豪门利益联姻婚后相恋:微生物培养基的配制和灭菌

实验五 微生物培养基的配制和灭菌
培养基是将微 生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基质。培养基为微生物的生长提供营养物质和生存空间。它具有微生物正常生活所需的各种养料和适宜的环境条件；（1）适当组分和比例的营养物质；（2）适宜的pH值；（3）合适的渗透压；（4）保持无菌状态。所以培养基是培养微生物所必需的最主要材料。培养基的配制是微生物学工作者的主要技术操作之一。
培养基的种类：
根据培养基的组成成分，可将培养基分为三类：
合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。
半合成培养基：由一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。
天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成的。
从培养基的物理状态来分：
液体培养基：不加凝固剂的液态状培养基。
固体培养基：在液体培养基中加入2％左右的凝固剂的固体状培养基或固体状农副产品培养基。
半固体培养基：在液体培养基中加入0.2％-0.5％凝固剂而成的半固体状培养基。
微生物最常用的凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。它不是一种营养物质，只能被极少数种类的细菌分解利用。琼脂是从海藻中（主要是石花菜）提取而制成的。是一种多糖类化合物，主要成分是复杂的多糖硫酸酯钙盐，琼脂是一种可逆性胶体，在常规浓度下加热到96C以上即成溶胶状态，融化的琼脂，当温度下降到42℃以下，又凝固为固体。
一、目的要求l. 了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。
2. 了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。
3. 熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。
二、实验材料1. 药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O等。
2. 高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫外线杀菌灯。
3. 其它：天平、牛角匙、电炉、1N HCl、1N NaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养血、吸管、各种包装纸防水纸、绳索、棉花、标签等。
三、实验程序（一）、培养基配制
l. 培养基配制的一般方法和步骤
（1）称量：按照培养基配方，正确称取各种原料放于搪瓷杯中。
（2）溶化：在搪瓷杯中加入所需水量（根据实验需要加入蒸馏水或自来水），用玻棒搅匀，加热溶解。
（3）调pH值（调pH也可以在加琼脂后再调），用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。
表 6-1 琼脂和明胶的特性比较

（4）加琼脂溶化，在琼脂溶化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦，待完全溶化后，补足所失水分，一般数量少，时间短不必补水。
（5）分装：在漏斗架上分装。根据不同的需要进行分装，一般制斜面的装置为管高的1／5 特别注意不要使培养基粘污在管（瓶）口上以免浸湿棉塞，引起污染。
（6）包扎成捆、挂上标签。培养基分装好后，塞上棉塞，用防水纸包扎成捆挂上所配培养基名称的标签。
（7）灭菌备用。灭菌后如需制成斜面的，应在下磅后取出，摆成斜面（见图6-1）。培养基经灭菌后，必须放在37℃恒温培养箱中培养 24h，如确无菌生长、方可使用。

图6-1 灭菌的试管培养基趁热摆成斜面
2．三种培养基的配方及具体配制方法
（1）. 牛肉膏蛋白陈琼脂培养基（用于分离和培养细菌，是一种天然培养基）。
配方：
牛肉膏 3g 蛋白胨 5g 氯化钠3g
琼脂20g 自来水1 000mL pH7.2~ 7.4
灭菌l.05kg／cm2，25~30min
本实验将原配方配成各种浓缩液。各种浓度如下：30％牛肉膏、50％蛋白胨、30％氯化钠。以配制200mL培养基为例。
吸取30％牛肉膏2mL；50％蛋白胨2mL；30％氯化钠2mL；加入有刻度的搪瓷烧杯中，然后用自来水补足到200mL。用玻棒搅匀，在电炉上稍加热，调 pH至 7.4，加琼脂4g，加热熔化，用玻棒不断搅拌，至琼脂完全溶解为止，趁热在漏斗架上装试管，（见图6－2）。装带有棉塞的无菌试管，装置1／5的试管高度共12支，作斜面培养基、用铝壳试管帽的里装10mL。约试管高度的 1／2以上，用作分离时倒平板用。

图 6-2 分装培养基图 6-3 将培养基试管包扎成捆
分装完毕，以12支为一捆，用防水纸包扎成捆（图6-3），挂上标签，灭菌备用。
（2）. 马铃薯（或豆芽汁）蔗糖（或葡萄糖）琼脂培养基（用于分离和培养真菌之用，是一种半合成培养基）。
配方：
去皮马铃薯（或鲜豆芽）200g 蔗糖（或葡萄糖）20g 自来水1000mL
琼脂20g pH天然
灭菌（含蔗糖）1.05kg/cm220min（含葡萄糖）0.1kg/cm2 30min
制备方法配制200mL培养基为例
取上皮马铃薯40g，切成小块、放入无刻度的搪瓷杯中，加水200mL，置电炉上加热煮沸10min，用4层纱布过滤至具刻度的搪瓷杯中，滤液加水补足至200mL。然后加蔗糖4g，加琼脂4g，加热熔化并用玻棒不断搅拌直至琼脂完全溶化分装试管，下面一系例步骤同配细菌培养基相同。
（3）. 淀粉琼脂培养基（高氏一号Gause’I），用干分离和培养放线菌，是一种合成培养基。
配方：
可溶性淀粉 20.0g KNO31.0g K2HPO4 0.5g
MgSO4·7H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO4·7H2O 0.01g
琼脂20g 自来水1 000mL 灭菌1.05kg/cm230min
制备方法配制（以配制200mL）培养基为例：
吸取配方液：1％KNO320mL；1％K2 HPO410mL；1％MgSO4·7H2 O10mL；l％NaCl10mL；1％FeSO4 7H2O0.02mL．加水补足至 200mL，置电炉上加热.用另一只搪瓷杯称取可溶性淀粉4g，从200mL中取出少量加入淀粉中，用玻棒调成糊状，待液体沸腾后将淀粉糊洗入培养液中，搅匀，调pH至 7.4，加琼脂 4g，加热至琼脂完全溶化为止，趁热分装试管，以下一系例步骤同于配制细菌培养基的操作方法。
3. 无菌水的制备
无菌水，为下一次微生物分离实验中所需用而准备。
100mL三角瓶（装有玻璃珠），装自来水45mL，试管中装9mL自来水，塞上棉塞，包扎灭菌备用。三角瓶和试管须预先塞好棉塞，并经干热灭菌。
（二）分离培养微生物常用器皿的准备
1. 清洗一些玻璃仪器：如三角瓶试管，培养皿、吸管等。
2. 棉塞的制作：装培养基和分离培养需用的部分玻璃器皿，需加棉花塞梯塞的作用为过滤空气，使试管内外空气可以流通，但外界空气中杂菌不能进入，避免污染、试管、三角瓶都要做棉塞。吸管上部也要塞入棉花，在管口约1-2mm处，用解剖针塞入少许棉花，（约1-1.5cm 长）以防止细菌吸入口中，井避免将口中细菌吹入管内。棉花要塞得松紧适宜。吹时以能通气但不使棉花塞下滑为准。
教师示范做试管棉塞，同学每人做5支试管棉塞。棉塞要求不紧不松，两头光滑。试管棉塞的长度约3cm左右。塞入试管内部分约占2/3，头部稍大约占1/3左右，见图6-4。

图6-4 试管棉塞的规范要求
1. 正确式样2. 管内部分太短，管外部分太松3. 外部过小
4. 整个棉塞太松5. 管内部分过紧，外部太松
3. 包装培养皿和吸管等。为了使培养皿、吸管、三角玻棒等洗净，干热灭菌后，不让表面暴露，以保证无菌状态，为此干热灭菌前先用旧报纸包装妥当（见示范），每组同学包培养皿6只（一包）。
吸管的包装，将塞好棉花的吸管尖端，放在4~5cm宽的长纸条的一端，约成45°角左右，折叠纸条，包住吸管尖部，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌，见图6-5。

图6－5吸管灭菌前用纸包卷示意图
（三）培养基和玻璃器材的灭菌方法
灭菌的方法，通常可以分为四大类：（1）加热灭菌：包括直接灼烧灭菌、干热灭菌、加压蒸汽灭菌、间歇灭菌和煮沸消毒；（2）过滤去菌；（3）射线灭菌和消毒；（4）化学药剂灭菌和消毒。
在本实验中，介绍与培养基和玻璃器材灭菌有关的部份灭菌方法。
l. 干热灭菌法（即热空气灭菌法）
干热灭菌一般是利用电热烘箱作为干热灭菌器。前面所包装好的玻璃器皿，如带棉塞的三角瓶，试管、包装好的吸管、培养皿等，放入电热烘箱中。
打开烘箱顶部的通气孔，接上电源加热，使箱内空气的温度达到160℃~170℃，关闭通气孔使箱内的温度保持在160℃左右并维持1.5-2h。时间一到，切断电源。待温度下降60℃~70℃以下，方可打开箱门取灭菌物品，否则骤冷后易使箱内玻璃仪器破损。
2. 加压蒸气灭菌法
利用高压灭菌器，使水的沸点在密闭的灭菌器内随压力升高而增高（见表6-2），来提高蒸汽的温度和灭菌的效率。
在同一温度下湿热的杀菌效率比干热大，因为微生物细胞蛋白质在湿热情况下，易干凝固（见表6-3）。同时湿热的穿透力强，当水蒸汽与被灭菌的物品相接触后，便放出汽化潜热，逐步提高被灭菌物品的温度，直至与水蒸汽的温度相等，达到平衡为止，从而提高灭菌效率。
表6－2 灭菌器内空气比例与温度之间的关系

表6－3 蛋白质含水量与凝固温度之间的关系

手提式高压灭菌锅灭菌的操作步骤如下：
（1）在灭菌器内加入一定量的水（有的灭菌器内加水至止水线）。将用防水纸包扎好的灭菌物品如培养基、无菌水等，放进灭菌器内。
（2）接通电源，进行加热。
（3）当压力到达5bl/in2时，打开放气阀，使锅内的空气和水蒸汽一同排出，直至压力表的压力恢复到零，然后关闭排气阀，继续加热。
（4）当压力表＊的压力到达15bl/in2（即 1.05kg/cm2）时，此时灭菌器内的温度达到121℃，维持30min不变。对热不稳定的培养基灭菌时，应适当降低压力，延长时间。
（5）灭菌时间一到，切断电源，待压力下降至零时，才能打开排气孔，然后打开灭菌器盖，取出物品。如果灭菌后的固体培养基要做成斜面，需趁热放置。还需检查培养基灭菌是否彻底。
3. 间歇灭菌法
常采用阿诺（Arnold）氏灭菌器和柯赫（Koch）氏灭菌器或蒸笼灭菌，常压条件下蒸汽温度不超过100℃。在没有高压灭菌器设备的情况下或不宜加压灭菌的物品，可采用此法灭菌。
方法是：待灭菌物品放在灭菌器或蒸笼里，每d蒸煮1次，每次煮沸lh，连续3d重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在37C恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死的残留芽孢萌发成营养体，以便下1次蒸煮时杀灭。
4. 过滤除菌法
一些不能加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），可以用过滤除菌法，一般用细菌过滤器进行除菌。（教师示范）
细菌过滤器中的过滤板常用陶瓷、硅藻土或石棉等做成，过滤板孔眼很小，细菌不能通过。因此，过滤后的液体就除去了细菌。在进行过滤除菌前，整个细菌过滤器和接受液体的器皿，必须要包装妥当并进行加压蒸汽灭菌后方可使用。
下面介绍石棉板滤器的构造及其操作方法。石棉板滤器又称蔡氏（Scitz）滤器，它是由石棉制成的圆形滤板和一个特制漏斗组成（见图6-6a）。此漏斗分上下两节。上节为圆形金属筒，下节为金属漏斗。两节由三个活动螺旋固定，便于装卸。使用时拆开两节，将滤板放在漏斗上的金属筛板，再加上上节，然后将螺旋扭紧，将欲滤溶液置于滤器中抽滤。每次过滤必须用一张无菌的新滤板。石棉板滤器因容积大小不同而有各种型号，石棉板也有不同规格型号使用时必须根据需要搭配妥当。图6-6b为一个注射器装备滤器，用于不便高压蒸汽灭菌的维生素液或其他溶液的除菌和气体的除菌，极为方便。

图6－6 过滤除菌装置a. 蔡氏过滤器b. 注射器滤器装置
5. 紫外线灭菌
波长260~280nm之间的紫外线有很强的杀菌能力，一般紫外灯管能产生253.7nm的紫外光，杀死力强而稳定，但穿透力弱一般只适宜物体表面、空气灭菌。例如接种室、培养室、手术室、药厂包装室等空气灭菌。一般30w灯管、9m3空间，距地面2m每次打开紫外线照射0.5h，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时，先喷洒石碳酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。
在进行微生物接种和分离等操作时，常须用紫外线来杀灭接种室（箱）空气、台面等处的微生物。（参观示范）
紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力较弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。
紫外线对眼粘膜及视神经有强烈的损伤作用，对皮肤有刺激作用，所以不能直接在紫外线灯开启下工作和用眼睛直视开启的紫外灯。
6. 化学药剂消毒灭菌
微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂，详见表6-4。
表6－4 各类化学药剂消毒灭菌的浓度、作用方式和用法

思考题1、配固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？
2、培养基中加琼脂的作用是什么？
3、干热灭菌、高压蒸汽灭菌和间歇灭菌的场合有何不同？
4、如何检查培养基灭菌是否彻底？