测试名字的爱情命运:浅议PCR理论与技术

摘要：聚合酶链式反应简称PCR （英文全称：Polymerase Chain Reaction） ，它是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成 一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等 特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方。本篇文章主要介绍了PCR的基本理论与一些相关技术，希望我们可以更多的了解关于GPR的知识，然后对其更好的应用。

关键词：PCR技术、原位PCR、定量PCR

   1 聚合酶链式反应

分子克隆(molecular cloning)、DNA测序(DNA sequencing)和聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是分子生物学的三大主流技术。利用PCR技术，人们能在数小时内通过试管中的反应将特定的DNA片段扩增数百万倍。PCR技术成为生物科学研究的一种重要方法，为医学、遗传学和考古学等学科的研究提供了新的技术手段。

   1.1 PCR技术的原理

PCR的反应原理与细胞内的DNA复制相似，但PCR的反应体系要简单得多，主要包括DNA靶序列、与DNA靶序列单链3＇末端互补的合成引物、4种dNTP、耐热DNA聚合酶以及合适的缓冲液体系。

PCR由变性--退火(复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时 间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

   1.2 PCR反应体系

PCR的基本反应体系包括：需要扩增的模板、一对寡核酸引物(primers)、维持PH值的反应缓冲系统(reaction buffer system)、一价或二价阳离子(monovalent or divalent cations)、4种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP) 、催化依赖模板的DNA合成的耐热DNA聚合酶以及PCR促进剂等。

   1.2.1 模板

PCR反应的模板可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，先经过反转录生成cDNA然后再进行PCR反应。PCR反应体系中，对模板的要求如下：(1)纯化的模板 (2)模板的形式：单链或双链 (3)线性DNA (4)小片段模板DNA (5)适宜的模板量 

   1.2.2 引物

PCR扩增产物的大小以及扩增靶序列在基因组中的位置是由引物限定的，因此，引物的选择关系到PCR的特异性。

   1.2.3 反应缓冲系统

反应缓冲系统提供PCR反应所必需的、合适的酸碱度和某些离子。

   1.2.4 二价阳离子—Mg2+

所有耐热的DNA聚合酶的活性都需要二价阳离子(通常是Mg2+ )。             

1.2.5 三磷酸脱氧核苷酸

四种三磷酸脱氧核苷酸(deoxynucleotide teiphospatea,dNTPs)为PCR反应的合成原料。                                                                    

1.2.6 耐热DNA聚合酶 

耐热DNA聚合酶(thermostable DNA polymerase)能经受95℃以上的高温而不失活，因而无需在每轮循环中添加新酶；同时它催化的聚合反应的最适温度为70～80℃，此时引物与模板结合的特异性好，故产物的纯度高。                                                          

1.2.7 PCR促进剂

通过向PCR反应体系中加入助溶剂或添加剂，可以降低碱基错配水平，提高富含GC模板的扩增效率。同时PCR反应促进剂还增进DNA复性时的特异性配对，增加或改变DNA聚合酶的稳定性等，提高PCR的扩增效率。                                  

1.3 PCR的反应温度和循环参数

PCR反应是一个重复的循环过程，每一循环包括三个阶段的反应，加热而导致模板的变性，变性后寡聚核苷酸引物和与它互补的单链靶序列杂交而退火以及由热稳定DNA聚合酶的介导使已杂交的引物的延伸。                                       

1.3.1 变性的温度与时间

变性所需的加热温度取决于模板及PCR产物双链DNA中的G+C含量。双链DNA中的G+C的比率越高，则双链DNA分离变性的温度也就越高。变性所需的时间与DNA分子的长度相关，DNA分子越长在特定的解链温度下使双链DNA分子完全分离所需的时间就越长。                                                                     

1.3.2 退火的温度与时间

退火的温度决定PCR反应的特异性。引物与模板复性所需的退火温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。引物长度越短、G+C的比率越低，所需的退火温度就越低。                                                                    

1.3.3 延伸的温度与时间

延伸的温度取决于所使用的DNA聚合酶的最适温度，一般延伸的温度设备设定在所用的DNA聚合酶的最适温度附近，以获得最大的扩增效率。                     

1.3.4 循环次数

循环次数决定扩增的程度。在其他参数都已优化的前提下，循环次数取决于最初靶分子的浓度。循环次数过多会增加非特异性产物量及碱基错配数，此外，还会导致PCR反应——“平台效应”的出现；循环次数太少会影响正常的PCR产物量。             

1.4 PCR产物的检测和纯化

PCR反应完成后，必须通过严格的检测分析以确定是否得到准确可靠的特定扩增产物。常见的PCR产物的检测分析方法有凝胶电泳法、核酸探针杂交法、酶谱分析法、DNA酶免疫试验法、PCR-酶联免疫吸附法、颜色互补分析法、序列分析法、PCR-HPLC法、单一核甘酸引物延伸法、PCR-寡核苷酸连接检测法和单链构型多肽性分析法等。

通过PCR反应后反应体系中仍然存在着具有活性的DNA聚合酶，剩余的dNTP、引物以及反映缓冲体系中的各种金属离子等，因此，我们还必须通过一定的方法从反应体系中提纯PCR反应的扩增产物。常规的PCR产物纯化的基本过程如下：首先使用琼脂糖凝胶电泳分离除去反应体系中靶序列的非特异性扩增片段；然后使用蛋白酶K灭活耐热DNA聚合酶；此后使用常规的酚——氯仿抽提法除去剩余的dNTP，离心、乙醇洗脱后干燥；最后使用高效液相色谱或者凝胶电泳分离反应体系中剩余的引物和引物二聚体。通过琼脂糖凝胶电泳-溴化乙锭染色可以鉴定所提纯的PCR反应产物的纯度。           

2 原位PCR相关技术

原位PCR(in situ PCR，IS-PCR)是一种把原位杂交的细胞定位技术与PCR的高灵敏度相结合的技术，即通过PCR技术以DNA为起始物，对靶序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增，使其拷贝数增加，然后通过原位杂交方法检测，从而对靶核酸进行定性定量定位分析。                                                            

2.1 原位PCR的流程

原位PCR的大致流程主要包括：

(1)染色体、细胞及组织切片样品的制备。

(2)PCR前处理，包括石蜡切片、去石蜡、染色体变性和细胞穿透。

(3)PCR扩增，一般采用热启动PCR，病毒RNA的扩增需用反转录PCR。

(4)原位杂交及检测。                                                   

2.2 原位PCR的分类

原位PCR按检测方法不同分为：直接原位PCR；间接原位PCR；原位反转录PCR；原位再生式序列复制反应。                                                  

2.2.1 直接原位PCR

直接法原位PCR是使扩增产物直接携带标记分子，在原位PCR反应体系中使用标记的三磷酸核苷酸或引物。当标记物进行PCR扩增时，标记分子就掺入到扩增产物中，可用放射自显影技术、免疫组织化学技术或亲和组织化学等技术检测扩增产物。直接法原位PCR的优点是快速、简便。用标记引物进行直接法原位PCR，其扩增效率要比用不标记引物的低。在应用方面，直接法原位PCR不适于研究内源性基因重排和染色体易位。                                                                   

2.2.2间接原位PCR

间接法原位PCR的反应体系与常规PCR相同，所用的引物和三磷酸核苷酸都不带任何标记物。当PCR原为扩增结束后，再用原位杂家技术检测特异性扩增产物。由此可见，间接法原位PCR与原位杂交技术结合，故亦称为PCR原位杂交(PCR in situ hybridization)。与直接法原位PCR相比，间接法扩增效率较高，特异性更强。        

2.2.3 原位反转录PCR

原位反转录PCR(in situ reverse transciption)是结合反转录反应和PCR扩增检测细胞内低拷贝mRNA的方法。全过程分为两步进行：第一步以mRNA为模板，在反转录酶的催化下合成cDNA。第二步则以cDNA为模板，用PCR对靶序列进行扩增。进行原位反转录PCR的标本先要用DNA酶处理，以破坏组织细胞中的DNA。这样可保证PCR扩增的模板是从mRNA反转录合成的cDNA，而不是细胞中原有的DNA。                

2.3 原位PCR技术 

1、直接原位单拷贝PCR

2、在细胞和石蜡切片上检测低拷贝DNA序列的原位PCR方法

3、冷冻切片上的反转录原位PCR

4、HIV-1前病毒DNA的原位PCR检测及流式细胞仪分析

5、细胞内mRNA的原位PCR扩增

6、组织切片上核酸序列的PCR扩增——定位原位扩增                                                            

3 定位PCR技术

定量PCR(quantitive polymerasa chain reaction)技术有广义概念和狭义概念。广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)。                                                                     

3.1 定量PCR技术基本原理

PCR反应每个循环的产物均成为下一个循环的底物，并按指数级扩增，这种指数增长可用方程式Y=X(1+E)n来推算扩增产物，Y代表PCR产物，X指其实模板核苷酸的量，n指反应循环数，E为扩增效率。一般情况下，E在很有限的循环周期中保持相对恒定，通常20-30个循环，随后扩增效应减慢直至为零，扩增过程到达平台期，此时，PCR产物的积累不再依赖于投入的模板核苷酸量。因此，在使用上述方程式之前，必须用实验检测PCR扩增的指数增长特性。

对于一个给定的扩增片段，其实样本的含量越大，则指数扩增过程越短。扩增过程中的内在特性或参数都可能会引起动力学的变化，E取决于诸多元素，包括引物和扩增序列的特性、组分的浓度以及PCR反应温度等。其中特别是DNA聚合酶量/模板量的比值，它可能会随着热循环仪上标本位置或不同临床标本中某个DNA聚合酶抑制物的出现而变化。即使在同一条件、使用同一试剂的条件下，管与管之间的扩增效率也可能发生异变。影响E的因素中任何微小的差异将导致特异PCR产物水平的极大变化。                                     

3.2 定量PCR技术的分类

广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型：

（1）外参法+终产物分析。所谓“外参法”是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。这种类型没有对样本进行质控监测，易出现假阴假阳结果，没有监测扩增效率，定量不准。

（2）内参法+终产物分析。所谓“内参法”是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应。这种类型对样本进行质控监测，排除假阴结果，但是定量不准。

（3）外标法+过程监测。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，但是无法排除假阴结果。  

（4）内参法+过程监测。由于样本与阳性参照在一个容器内反应，用同样的Taq酶和反应参与物，存在竞争性抑制，起始模板量浓度高的反应会抑制起始模板量浓度低的反应，所以定量不准。 

（5）外标法+过程监测+内对照。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，同时排除假阴结果。这种类型是应该提倡的。                                       

3.3 定量PCR的主要影响因素

 PCR的主要影响因素有两个，一个是PCR扩增的动力学，另一个是样品的性质。

3.3.1 PCR扩增的动力学 

用PCR对靶基因定量时，首先应考虑的是PCR扩增动力学的有关因素，每一次PCR产物均是下一次循环的底物，模板的扩增呈指数式。但是，DNA的每一次复制都是不完全的，故积累分子数N=N0(1+E)n,N0是初始靶DNA的分子数，E是扩增效率（指每次循环中参与复制的模板与总模板的比率），n是循环数。扩增效率的微小差异便可导致产物积累量的显著不同。效率受靶DNA的序列及长度，反应条件，尤其是受N引物序列的影响。更重要的是，即使同时使用同样的试剂及操作，同等反应条件，PCR法管与管间的扩增效率也有明显差别。                                                   

3.3.2 样品的性质

样品性质可有显著差异，特别是临床反映。与良好样品相比，部分降解或不新鲜的样品显然含有少量靶基因。此基因尤其对反转录PCR影响极大，因为RNA易于降解，且反转录反应效果存在固有差异。这些重要的误差常被忽视，但只要对每份样品定量一个参照物，如第二基因或序列，即可获得很好控制。                                  

3.4 PCR的检测模式

PCR过程的监测有多种检测模式。最常用的有三种检测模式：R Green I 检测模式 、解探针模式（Taqman）Hydrolysis Probe 和杂交探针（Hybridization Probes）模式。   

3.4.1 R Green I 检测模式 

温度循环为94—55—72°C三步法，只有引物，无探针，荧光染料镶嵌在双股螺旋链中间。通过对特定方向的强荧光检测获得信号，这种试剂检测模式易产生非特异信号，且本底光较大。                                                           

3.4.2 解探针模式

温度循环为94—60°C二步法，不仅有引物，还有另外一个特异针对扩增模板的探针在引物对之间。在探针相邻两个碱基上分别结合两个荧光染料，一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态。当Taq酶在60°C延伸扩增链时，遇到探针，利用Taq酶5`—3`外切酶活性将探针水解成单个碱基，单个碱基之间距离较远，第一个染料的能量无法传给第二个染料，只好通过发射特征光子回到稳定态，通过对溶液中第一个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式增加了检测信号的特异性，但是由于利用了Taq酶5`—3`外切酶活性，一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给Taq酶5`—3`外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度（Tm）仅要求其高于60°C，这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，而且无法做质控检测。           

3.4.3 杂交探针模式

温度循环为94—55—72°C三步法，有引物，二个特异针对扩增模板相邻的探针在引物对之间，在一个探针3`碱基上结合一个荧光染料，在另一个探针5`碱基上结合第二个荧光染料。在55°C时，两个探针都刚好接合在模板上，第一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态，通过对结合在扩增模板上双探针中第二个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式中荧光信号与特定杂交温度相关，探针的浓度始终保持不变，因此可以在扩增后检测熔解曲线作为信号的特异性质控。另外这种试剂检测模式可以用于点突变检测。           

4 PCR相关技术的应用

1、PCR技术用于构建cDNA文库、测序及基因突变的检测

2、PCR技术分析DNA序列多态性

3、用PCR技术分析VNTR和STR

4、用PCR技术对性别染色体进行分析

5、用PCR技术对动植物、微生物DNA进行分析

6、PCR技术检测CDK4敲入转基因鼠的基因型

    7、PCR反应体系中模板DNA浓度与PCR扩增效率的关系                           

参考文献：                                                                                 

[1]丁振若,苏明权.1998.临床PCR基因诊断技术.西安:世界图书出版公司

[2]冯作化.2001.医学分子生物学.北京:人民卫生出版社

[3]林万明.1998.PCR技术操作和应用指南.北京:人民军医出版社

[4]王延华,景强.2005.PCR理论与技术.北京:科学出版社

[5]吴乃虎.2000.基因工程原理.北京:科学出版社