三七对肝硬化的作用:临床生化自动化分析 - 中国仪器之家 17baba.com

目前临床生化绝大部分检测已实现自动化分析，其中多数由自动生化分析仪(automatic biochemical analyzer)完成。自动生化分析仪由电脑控制，将生化分析中的取样(sampling)、加试剂、混匀、保温反应、检测(detect)、结果计算、可靠性判断、显示和打印、以及清洗(Cleaning)等步骤组合在一起自动操作。其电脑不但用来控制自动化分析仪，也用来安排测试（test）要求和打印结果。自动生化分析技术提高了临床生化检验质量和速度，可减轻检验人员的劳动强度，节约样品和试剂，增加检验项目，提高检测精密度，减少实验误差，并且有利于临床检验标准化的实现。
自动生化分析仪按其工作方式不同分为连续流动式(continuous streaming movement style)或管道式、分立式(discrete style)、离心式(centrifugation style)和干片式(drying style) ，其中以分立式应用最为广泛，而干片式由于具备体积小、试剂以每个测试为单位独立使用，且操作简便等优点，多为急诊检验所采纳，样品数量很少的医院也可选用，连续流动式和离心式现已很少使用。本章主要介绍分立式自动生化分析仪及其应用，对干片式分析仪也将作简单介绍。

第一节 分立式自动生化分析仪的结构

分立式自动生化分析仪完全模仿手工操作方式设计，自动生化分析仪的各部分结构对应手工操作的每个步骤包括取样、加试剂、混匀、孵育、检测、结果计算、器材清洗等，分述如下： 一、基本结构
（一）样品盘或样品架
样品盘（specimen disc）是放置待测样品的转盘，可放置一定数量的样品杯（specimen cup）或不同规格的采血试管，通过样品盘的转动来控制不同样品的进样。另一种方式是样品架（specimen stock），每个样品架可放数只样品杯或采血试管（多为5只或10只）。样品杯或采血试管均可盛载血清、血浆、尿液等样品。样品架的移动通过样品传送带来进行，以样品架上的条形码（barcode）或底部编码孔识别样品架号及样品位置号。有些仪器有专用于急诊样品、校准品和质控品的可识别架（见图7-1），更多仪器通过固定专用位置来区分这些样品架类型。样品杯或采血试管可贴上包含样品性质和编号的条形码，分析仪通过对样品条形码识别不同的样品。

样品架的优点有：①随着样品架移动及样品的被检测，可不断追加已放置样品杯或采血试管的样品架；②通过样品架的移动能将样品传送到另一个分析模块（analysis die-block）甚至另一台分析仪上再进行分析。而样品盘则只能固定在某个分析模块或某台分析仪上被检测；但多数样品盘为开放式，对其上的样品可较自由地随时取出和放入。
（二）试剂室和试剂瓶
试剂室（reagent chamber）内可装有放置试剂瓶的转盘，一般可放置20种以上具有一定形状的塑料试剂瓶，大型分析仪可放置30～45种试剂瓶,试剂瓶容量一般为10ml～100ml。通过试剂转盘的转动来选用不同试剂。试剂室也有按试剂架形式设计，可放置容量为250ml～500ml的任意形状的试剂瓶，试剂瓶不能转动，但每个试剂瓶内引出一条试剂管路及其喷嘴，即每种试剂均有专用的加试剂装置，因而不同试剂间无交叉污染；但试剂管路较长使试剂的死体积较大，因而适宜用于使用频率高、消耗试剂量大的检测项目。大型分析仪同时备有第一试剂室和第二试剂室，即具备对同一检测项目添加两次试剂的功能，个别分析仪还具有加入第三试剂的功能。对有条形码装置的仪器可将带条形码的试剂瓶放在试剂室转盘上的任意位置，仪器能自动识别试剂的种类、批号和有效期。试剂室均具有冷藏装置，可将试剂保存在4℃～10℃。
（三）反应杯和反应盘
反应杯（reaction cup）是样品与试剂进行化学反应的场所，同时用作比色杯，这一点与手工操作有显著区别。由透光性好的硬塑料或石英玻璃制成，100只或更多的反应杯围成一圈组成一个反应盘（reaction disc），反应杯的数量往往与分析效率成正比。在测定过程中反应盘作恒速的圆周运动，在静止时向反应杯中加入样品、试剂或进行搅拌混匀，当反应盘相对静止时经过检测窗口的比色杯可进行吸光度检测。比色杯光径有0.5cm～1cm不等，大多数分析仪在计算时将其折算为1厘米光径。
（四）取样和加试剂装置
1．取样装置 取样装置（sampling assembly）由取样针、取样臂、取样管路、取样注射器和阀门组成，能定量吸取样品并加入到反应杯。不同分析仪的取样容量有不同的范围，一般为2μl～35μl，步进0.1微升不等。最低取样量很重要，取样量小对仪器的制作要求就高，是判断高低档分析仪的一个指标。取样针尖上设有电子感应器，具液面感应功能，取样针于样品上方下降，一旦接触到样品液面即停止下降而开始吸样。多数感应器设有防撞装置，遇到阻碍时取样针立即停止运动并报警。某些取样针还设有阻塞报警系统，当取样针被样品中的凝块、纤维蛋白等物质阻塞时，机器会自动报警、加大压力冲洗取样针，并跳过当前样品，进行下一个样品的取样检测。
由于取样针在各样品间产生携带交叉污染，因此所有的自动生化分析仪均对其设置了防交叉污染（crossing contamination）的措施。绝大多数采用水洗方式（又有淋浴式和洗脸盆式之分），在吸取另一个样品前对接触样品的样品针内外壁进行冲洗；也有采用化学惰性液（chemical inertia fluid）的方式来隔绝样品与取样针内外壁之间的接触。
2．加试剂装置 加试剂装置用于定量吸取试剂加入反应杯，可加入试剂容量一般为20μl～380μl。步进1～5微升不等，取样精度在1微升左右。加试剂装置有两种类型，一种类型的组成部件与取样装置类似，其液面感应系统能检测并提示试剂剩余量。与取样装置一样，也同样设置有防止试剂间携带交叉污染的措施，另外，可通过吸取比需要量多一定量的试剂来解决交叉污染问题。另一种类型为灌注式加试剂装置，该装置具有许多条试剂管路及其喷嘴，每种试剂单独使用一条试剂管路和喷嘴。这种加试剂方式的优点是不存在各试剂间的交叉污染。大型自动生化仪多具有两组加试剂装置，可分别从两个试剂室吸取同一个检测项目的第一和第二试剂，大多数分析仪所有检测项目加入第二试剂的时间点统一固定为1个或2个点，也有分析仪有3个加入时间点可供选择。
（五）混匀与搅拌装置
反应杯里的样品与试剂通过搅拌棒搅拌而充分混匀，搅拌棒的形状为扁平棒状或扁平螺旋状，表面的疏水材料能防止反应液被搅拌棒所携带。其工作方式大多为旋转式搅拌，也有震动搅拌方式。也设置了防止搅拌棒在不同反应液之间携带交叉污染的清洗措施。
（六）温控和定时系统
分析仪的反应杯浸浴在恒温循环水或恒温空气中，恒温循环水浴方式的优点是温度传递速度快，但保养要求较高，恒温空气浴方式保养简单，但温度传递速度不如恒温水浴循环方式。温度控制器能使循环水或循环空气的温度控制在规定温度±0.1℃。规定温度可有37℃和30℃两种选择，一般固定在37℃。还有一种恒温液循环加温方式，集干式空气浴和水浴的优点，恒温液为热容量高、蓄热能力强、无腐蚀的液体，使温度均匀稳定，且保养简单。
不同分析仪对检测吸光度的间隔时间有不同的规定，反应时间应该设定为此间隔时间的倍数。总反应时间一般限制在8.5min-10min内，个别分析仪可以设定为15min或22min等。
（七）光路和检测系统
自动生化分析仪以紫外可见分光光度法为主要的检测手段，与一般分光光度计一样，其光路和检测系统由光源、单色器和检测器组成。
1．光源 光源（light source）一般为卤素钨丝灯（halogen tungsten filament lamp），也有采用长寿命的氙灯（xe lamp），要求在340nm～800nm波长范围内能发射出稳定且较平坦的光能。
2．单色器 单色器（monochromato）采用①干涉滤光片（interference filter）分光系统，常带有340nm、38nm0、405nm、500nm、550nm、600nm、660nm等几种滤光片，各滤光片固定在转盘上，以转盘旋转的方式来选择波长。这种分光系统在半自动分析仪中常用，只能在一个检测项目完成后，改变一个波长，再检测另一个项目，且不能同时进行多波长检测。②光栅（raster）分光系统，常在340（或293）nm～850nm范围内选择10～13种固定的单色光。
光栅分光有前分光和后分光两种方式，目前以后分光方式为多见。后分光是光源先透过比色杯中的反应液再照射到光栅上，经色散后所有固定单色光同时通过各自的光纤传输到对应的检测器，微处理器按该分析项目的分析参数选择其中一个或两个波长（双波长方式）的吸光度值，用于分析结果的计算，参见图7-2。后分光的优点是单色器中没有转动部分，因而提高了检测的精度和速度。

3．检测器 检测器（detector）由光敏二极管及放大电路组成，可按设定的间隔时间连续测定各反应杯的吸光度值。
（八）数据处理系统
此系统具有多种数据处理功能。
1．计算测定结果 分析仪检测到的吸光度值或吸光度的变化值扣除试剂空白，乘以校准系数或计算因子K，再由方法学补偿系数a和b校正，即得到被测样品的浓度值或酶的活性。分析仪还可按设定的校准模式如线性或非线性的对数、指数等方式处理校准曲线，从而计算待测样品结果。
2．判断结果准确性 包括结果是否超过参考范围、结果是否超过线性范围和检测范围、试剂空白吸光度有无超范围、连续监测范围内吸光度值变化是否偏离线性，以及底物消耗是否超过设定范围等。
3．保存各种数据 电脑的存储介质不仅可以保存大量的测定结果，还可以保留一定数量的其它相关数据，如被分析项目各检测点吸光度值、各次校准的校准曲线、每天的室内质控数据等，以供随时查询。
4．自我诊断功能 能检测仪器工作状态，有关部分的温度、压力，以及空白比色杯吸光度等。
（九）清洗系统
多数全自动生化分析仪具有反应杯清洗装置。一个反应杯内的反应和检测结束后，该反应杯就被冲洗系统及时冲洗，其清洗过程是：由废液针吸取反应杯内废液，加入清洗剂（detergent）冲洗并抽干后，再经数次去离子水冲洗及抽干，更高级的仪器带有风干技术。然后做杯空白的吸光度检查，若通过检查则此反应杯可继续循环使用；如果不能通过，分析仪将提示该反应杯异常，并跳过此反应杯使用下一个反应杯，或提示更换反应杯。
在检测过程中，样品针、试剂针和搅拌棒一般在用于下一个样品、试剂或反应杯前即清洗一次，此时多数为去离子水冲洗，在一批检测完成后，则自动进行清洗剂清洗。
清洗剂可配有1至3种，除一种常规清洗剂外，其它1至2种可按设定对试剂针、样品针或反应杯进行补充清洗。

二、组合式自动分析仪
（一）组合式自动生化分析仪
将相同或不同的两台或两台以上的分析部分，即分析模块进行组合连接，采用样品架方式使样品通过传输线在不同分析模块间进行传递并检测。各分析模块所分析项目的组合提高了分析效率，这些分析模块除了基于紫外-可见光谱分析原理的分析模块外，还有基于离子选择电极的电解质分析模块，甚至还可组合建立在免疫发光分析原理的免疫分析模块。
（二）实验室自动化系统
实验室自动化系统（laboratory automation system，LAS）是组合各自动分析系统如生化分析系统、免疫分析系统以及血液分析系统等，实现样品自动运输和电脑系统管理各部分的运行，其目的是为了提高工作效率和减少耗损。实验室自动化系统包括样品前处理系统、样品输送系统和各样品分析系统。不同功能的各模块以同一标准来连接，通过计算机控制运行。
样品前处理系统能独立工作，由样品投入部、离心分离部、开栓部、在线分注部、非在线分注部、贴条码部、盖栓部、样品分注收存部、样品接收部等模块构成前处理系统，每一模块既是系统的部分，又是独立的单元，可根据不同需要选择使用，具有灵活性和扩展性。因为采用了统一标准连接设计，前处理系统可通过样品输送部分与样品分析系统连接，组成类似工业领域的生产流水线，从而实现了从采血到报告的实验室全自动化。随着检测样品量的增加，只需添加需要的模块，将其插入连接，即可扩大处理能力。这样可避免同类硬件和功能的重复投资，节省占地面积所需的基础投入。当一模块发生故障时，其余模块仍在运行，在24小时内任意时间对模块进行交替保养维护，不影响日常工作。目前，样品前处理系统已较多用于自动生化分析仪。
由于实验室原拥有自动化分析仪的品牌、型号、档次各不相同，各实验室的检测要求也不同，目前设计和组成一个实用的实验室自动化系统尚不容易，而认为LAS是一个概念的引导更恰当，它是一个向理想实验室迈进的努力方向。

第二节 生化自动化分析方法概要

一、分析方法分类
（一）终点法
被测物质在反应过程中完全被转变为产物，即达到反应终点，根据终点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法（end essay）。实际上被测物并没有完全被转变，而只是与产物达到一个动态的化学平衡，因此该法称为平衡法更为恰当。从时间-吸光度曲线来看，到达反应终点或平衡点时，吸光度将不再变化。分析仪通常在反应终点附近连续选择两个吸光度值，求出其平均值计算结果，并可根据两点的吸光度差来判断反应是否到达反应终点。终点法参数设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。
终点时间的确定：①根据时间-吸光度曲线来确定，如Trinder反应测定尿酸，反应曲线上3～5min时其吸光度已趋向稳定，因而可将5min作为反应终点。②根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定，如在血清白蛋白的溴甲酚绿法测定中，白蛋白与溴甲酚绿在10s内很快完成反应，之后α球蛋白和β球蛋白与溴甲酚绿发生 "慢反应"，使反应曲线上吸光度在10s后仍继续缓慢上升，持续约达10min，因此终点时间应采用10～30s，而不应选择10min。
1．一点终点法 在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，这种方法称为一点终点法（one point end essay），其反应曲线见图7-3。其检测结果的计算公式是：待测物浓度CU=（待测吸光度AU－试剂空白吸光度AB）×K。 K为校准系数，详见第五节二操作方法。

2．两点终点法 在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果，称为两点终点法（two point end essay），其反应曲线见图7-4。计算公式为CU=（待测吸光度A2－待测吸光度A1）×K。该法能有效地消除溶血（hemolysis）、黄疸（icterus）和脂浊（lipo-turbid）等样品本身光吸收（见图7-5）造成的干扰。在单试剂分析加入试剂的初期、或双试剂分析中第二试剂加入之初，若指示反应吸光度尚未明显变化，则可在此时选择第一个吸光度，在指示反应终点时选择第二个吸光度，从而设置成两点终点法。但指示反应初期吸光度无明显变化的化学反应较少，如单试剂方式测定总蛋白、白蛋白、钙、磷、镁等的终点法分析项目，及双试剂方式测定葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等的终点法分析项目，因反应初期吸光度已有明显变化，因而均难以用上述方式设置两点终点法。但在双试剂分析中，如果将第一吸光度选择在第二试剂加入前，此时指示反应一般尚未开始，则能容易设置两点终点法。在此要注意必须将两次读吸光度时不同比色液体积进行校正。目前全自动分析仪均具有此自动校正功能，不必手工进行校正。

（二）固定时间法
指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算，称为固定时间法（fixed-time essay），反应曲线见图7-6。其计算公式与两点终点法相同，为CU=(A2-A1)×K。有时也称此法为两点法。

该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题。例如：苦味酸法测定肌酐，反应的最初30s内，血清中快反应干扰物（如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）能与碱性苦味酸反应；在第二个30s时碱性苦味酸主要与肌酐反应，且此段时间－吸光度曲线的线性较好（故也可用连续监测法测定肌酐）；在80～120s及其以后，碱性苦味可与蛋白质以及其它慢反应干扰物反应。这样选用反应的第二个30s为测定时间，既避免了快反应物质的干扰，也避免了慢反应物质的影响，使肌酐浓度与吸光度变化呈良好的线性关系，有利于提高分析的特异性和准确度。
（三）连续监测法
连续监测法（continuous monitoring essay）又称速率法（rate essay），是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变化值（ΔA/min）计算结果，见图7-7A和B。所谓线性期就是各点吸光度差值相等，如图7-7C所示，图中δ1及δ5值偏小，而δ2＝δ3＝δ4，故A1点至A4点属线性段。此线性期对底物来说属零级反应，期间的ΔA/min即为酶促反应的初速度，其大小与被测酶活性成正比。连续监测法的优点即是可以确定线性期并计算ΔA/min，根据此值再准确地计算酶活性，因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物。酶活性（U/L）＝ΔA/min×理论（或校准）K值，代谢物浓度CU=ΔA/min×校准K值。关于理论K值和校准K值叙述如下：

1．理论K值 多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准品可用，因而根据酶活性的国际单位定义得出酶活性的计算公式为：酶活性 (U/L)=ΔA/min× ，将此式中 以K来表示，此K值可通过对已知值即指示物质的毫摩尔消光系数（ε）、反应液总容量（TV）、样品容量（SV）和比色杯光径（d）计算后得出，即为理论K值，可作为分析参数输入到分析仪中。
采用理论K值的前提应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度控制精确以及波长准确等。但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进电机精度、滤光片带宽等方面的差异，可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差。温度的影响有时也非常大，由于反应盘是半暴露的，因此随着较冷试剂的加入，反应盘中的温度会逐渐降低，尽管开始测定时反应盘温度已升到37°C，但在某一项目测定过程的开始阶段，温度可能达不到37°C ，甚至仅35°C左右，且反应过程中仍有可能上下波动，这对于酶学反应来说影响是很大的。如采用37°C时的理论K值，将会使测定结果降低，温度的波动还会使得结果的重复性降低。当然，若试剂在加入反应杯前经试剂臂内加热装置预温，则基本不影响反应盘温度。
由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长、带宽以及加样系统的准确性等的影响，书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的不同，因而有必要获得实际的摩尔吸光系数，然后用来计算的K值称为实测K值。
（1）NADH（NADPH）摩尔吸光系数的测定：NADH（NADPH）没有标准纯制品，而且配成溶液后稳定性又较差，不能直接用NADH 或NADPH标准液来校正仪器，须通过有NAD+(NADP+)参与的反应途径。用已糖激酶 (HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系。葡萄糖有标准纯制品，又有国家批准文号的葡葡糖标准液。因此，根据公式A=εbC，已知比色杯光径b和葡萄糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度A后便可计算出NADH（NADPH）的摩尔吸光系数ε为 A/bC。假设，葡萄糖标准液浓度为1Ommo1/L(0.01mol/L)，标准液加入量为3.5μL，酶试剂加入量为335μL，比色杯光径为0.7cm，在340nm测得吸光度为0.465，则
实测NADH摩尔吸光系数= ＝6424 ，即在此台分析仪上340nm波长处测得NADH（NADPH）的摩尔吸光系数为6424，而理论上NADH（NADPH）的ε为6220。
（2）"色素原"酶促产物在405nm波长摩尔吸光系数的测定：有许多酶底物为人工合成的"色素原"底物，其本身无色，经酶作用后释放出有色的反应产物，在405nm波长具有吸收峰。最常用色素原底物及其产物为: ALP测定以磷酸对硝基苯酚 (4-Nitrophenyl phosphate，4-NPP)为底物，经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚(4-Nitrophenol，4-NP)，GGT测定以γ-L-谷氨酰对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或γ-L-谷氨酰-3-羟基-对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)为底物，经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺(p-Nitroaniline，4-NA)或对硝基-5-氨基苯甲酸(2-amino-nitrobenzoicacid， ANBA)。对硝基苯酚的摩尔吸光系数为18700(405nm)，对硝基苯胺的摩尔吸光系数为9870(405nm)，对硝基-5-氨基苯甲酸的摩尔吸光系数为9490(405nm)。下面是对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定方法。
试剂：① 4-NP标准储存液(1Ommo1/L)。② 4-NP标准应用液(2.5mmo1/L，以0.84mol/L AMP缓冲液稀释而成)。③ 底物缓冲液(l5mmol/L 4-NPP配于0.84mol/L AMP-HCL缓冲液中，37℃,pH l0.09土0.02)。
测定方法：4-NP标准液加入量为5μL，底物缓冲液加入量为350μL，波长405nm，光径0.7cm，温度37℃，测定得吸光度为A1；另用蒸馏水代替4-NP标准液，按上述方法测定其吸光度为A2，4-NP标准液吸光度ΔA= A1- A2，若测得ΔA为0.460，则
实测4-NP摩尔吸光系数＝ ＝18662
2．校准K值 酶活性校准品经校准操作后由分析仪自动计算得出。在进行酶学测定时，如果分析条件的变化如温度、样品试剂加量和吸光度检测偏差可同等程度地影响校准物和待测样品，则使用校准品能进行补偿。一般来说以使用校准K值为好，但必须有两个先决条件：①必须使用配套的试剂；②必须使用配套的高质量的校准品，该校准品应具有溯源性。使用与该分析仪配套的酶活性校准品也可得到较好的酶活性测定结果。关于酶活性标准品，欧洲标准局（BCR）和美国国家标准技术研究院（NIST）均发表了人血清基质的酶活性标准物，但目前尚无公认的标准（校准）品问世。
（四）透射比浊法
抗原与相应的抗体结合形成的免疫复合物，在反应液中具有一定的浊度，可由一般分光光度法进行透射比浊（transmission turbidimetry）测定，可用于某些蛋白质和药物浓度等的测定。该法须做多点校准，再经非线性回归，求出抗原或抗体的含量。使用散射比浊法（scatter turbidimetry）能更加准确快速地检测抗原抗体形成浊度的大小或其速度，目前专用的特定蛋白分析仪可做此法检测。有关免疫比浊法原理详见第二章。

二、常用生化检测项目分析方法举例
1．终点法检测 常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。
2．固定时间法 苦味酸法测定肌酐采用此法。
3．连续监测法 对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。
4．透射比浊法 透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。

第三节 分析参数设置

分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改。各种测定项目的分析参数（analysis paramete）大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道，由用户自己设定分析参数。因此必须理解各参数的确切意义。

一、分析参数介绍
（一）必选分析参数
这类参数是分析仪检测的前提条件，没有这些参数无法进行检测。
1．试验名称 试验名称（test code）是指测定项目的标示符，常以项目的英文缩写来表示。
2．方法类型（也称反应模式） 方法类型（assay）有终点法、两点法、连续监测法等，根据被检物质的检测方法原理选择其中一种反应类型。
3．反应温度 一般有30℃、37℃可供选择，通常固定为37℃。
4．主波长 主波长（primary wavelength）是指定一个与被测物质反应产物的光吸收有关的波长。
5．次波长 次波长（secondary wavelength）是在使用双波长时，要指定一个与主波长、干扰物质光吸收有关的波长。
6．反应方向 反应方向（response direction）有正向反应和负向反应两种，吸光度增加为正向反应，吸光度下降为负向反应。
7．样品量 样品量（sampling volum）一般是2μl～35μl，以0.1μl步进，个别分析仪最少能达到1.6μl。可设置常量、减量和增量。
8． 第一试剂量 第一试剂量（first regengt volum）一般是20～300μl，以1μl步进。
9． 第二试剂量 第二试剂量（second regengt volum）一般也是20～300μl，以1μl步进。
10．总反应容量 总反应容量（total reacting volum）在不同的分析仪有一个不同的规定范围，一般是180～350μl，个别仪器能减少至120μl。总反应容量太少无法进行吸光度测定。
11．孵育时间 孵育时间（incubate time）在终点法是样品与试剂混匀开始至反应终点为止的时间，在两点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间。
12．延迟时间 延迟时间（delay time）在连续监测法中样品与反应试剂（第二试剂）混匀开始至连续监测期第一个吸光度选择点之间的时间。
13．连续监测时间 连续监测时间（continuous monitoring time）在延迟时间之后即开始，一般为60～120s，不少于4个吸光度检测点（3个吸光度变化值）。
14．校准液个数及浓度 校准曲线线性好并通过坐标零点的，可采用一个校准液（calibrator）；线性好但不通过坐标零点，应使用两个校准液；对于校准曲线呈非线性者，必须使用两个以上校准液。每一个校准液都要有一个合适的浓度。
15．校准K值或理论K值 通过校准得到的K值为校准K值（calibrate coefficient）或由计算得出的K值为理论K值。
16．线性范围 即方法的线性范围（linearity range），超过此范围应增加样品量或减少样品量重测。与试剂/样品比值有关。
17．小数点位数 检测结果的小数点位数（decimal point digit）。
（二）备选分析参数
这类分析参数与检测结果的准确性有关，一般来说不设置这类分析参数，分析仪也能检测出结果，但若样品中待测物浓度太高等，检测结果可能不准确。
1．样品预稀释 设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个数值，便可在分析前自动对样品进行高倍稀释。
2．底物耗尽值 底物耗尽值（substrate exhaust limit）在负反应的酶活性测定中，可设置此参数，以规定一个吸光度下降限。若低于此限时底物已太少，不足以维持零级反应而导致检测结果不准确。
3．前区检查 免疫比浊法中应用，以判断是否有抗原过剩。将终点法最后两个吸光度值的差别（ΔA）设置一个限值，如果后一点的吸光度比前一点低，表示已有抗原过剩，应稀释样品后重测。
4．试剂空白吸光度范围 超过此设定范围表示试剂已变质，应更换合格试剂。
5．试剂空白速率 连续监测法中使用，是试剂本身在监测过程中没有化学反应时的变化速率。
6．方法学补偿系数 用于校准不同分析方法间测定结果的一致性，有斜率和截距两个参数。
7．参考值范围 对超过此范围的测定结果，仪器会打印出提示。
（三）某些参数的特殊意义
1．最小样品量 最小样品量是指分析仪进样针能在规定的误差范围内吸取的最小样品量。一般分析仪的最小样品量是2μl，目前也有小至1.6μl的。在样品含高浓度代谢产物或高活性酶浓度的情况下往往需采用分析仪的最小样品量作为减量参数，从而使分析仪检测范围（与线性范围不同）的上限得以扩大。
2．最大试剂量 方法灵敏度很高而线性上限低的检测项目，如血清白蛋白的溴甲酚氯法测定，以往手工法操作时样品量10μl，试剂量4ml，这样试剂量/样品量比例（R/S）为200，线性上限则为60g/L。此法移植到分析仪上后，R/S却很难达到200，致使线性上限变低。因此对这类检测项目最大试剂量非常重要。
3．弹性速率 在酶活性测定中，当酶活性太高，在连续监测期中已不呈线性反应时，有些仪器具有弹性速率（flexrate）功能，能自动选择反应曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果，使酶活性测定的线性范围得以扩大。如AST可从1000U/L扩展至4000U/L，从而减少稀释及重测次数、降低成本。
4．试剂空白速率 当样品中存在胆红素时，胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负干扰。因为胆红素在肌酐检测的波长505nm有较高光吸收，而且胆红素在碱性环境中可被氧化转变，因而在肌酐反应过程中胆红素的光吸收呈下降趋势。若在加入第一试剂后一段时间内设置试剂空白速率，因为此段中苦味酸尚未与肌酐反应，而胆红素在第一试剂的碱性环境中已同样被氧化转变，因而以第二试剂加入后的速率变化，减去试剂空白速率变化，便可消除胆红素的负干扰，见图7-8。

二、单波长和双波长方式
（一）概念
采用一个波长检测物质的光吸收强度的方式称为单波长(mono-wavelength)方式。当反应液中含有一种组分，或在混合反应液中待测组分的吸收峰与其它共存物质的吸收波长无重叠时，可以选用。在吸光度检测中，使用一个主波长和一个次波长的称双波长方式。当反应液中存在干扰物的较大吸收、从而影响测定结果的准确性时，采用双波长方式更好。
（二）双波长的作用
双波长(di-wavelength)测定优点是①消除噪音干扰;②减少杂散光影响;③减少样品本身光吸收的干扰。从光源，到比色杯、单色器、检测器的整个光路系统中，均存在着随时间发生变化的不稳定的检测信号，即噪音，而双波长检测是同时进行的，两种波长检测产生的噪音基本上相同，因而能消除噪音干扰。当样品中存在非化学反应的干扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时，会产生非特异性的光吸收，而干扰测定结果的准确性。采用双波长方式测定可以部分消除这类干扰，提高检测的准确性。
（三）次波长的确定方法
当被测物的主波长确定之后，再选择次波长。如根据甘油三酯等干扰物吸收光谱特征，选择次波长，使干扰物在主、次波长处有尽可能相同的光吸收值，而被测物在主、次波长处的光吸收值应有较大的差异。一般来说，次波长应大于主波长100nm。以主波长与次波长吸光度差来计算结果。
（四）双波长的具体应用
对于某些反应速度快且无法设置为两点终点法的分析项目，尤其是单试剂分析中，可以利用双波长的方式来部分消除样品本身的光吸收干扰。目前用单试剂法测定的项目应用双波长的为血清总蛋白（双缩脲法）主波长500nm，次波长576nm；血清白蛋白（溴甲酚氯法）主、次波长分别为600和700nm；钙（偶氮砷Ⅲ法）主、次波长分别为 660、770nm；磷（紫外比色法）主、次波长为340、405nm，镁（二甲苯胺蓝法）主、次波长为505和 600nm。

三、单试剂和双试剂方式
反应过程中只加一次试剂称单试剂方式，加两次试剂便为双试剂方式。目前的生化分析仪大多可用双试剂方式分析，其优点是：①可提高试剂的稳定性，多数双试剂混合成单一工作试剂时，其稳定时间缩短；②能设置两点终点法，来消除来自样品本身的光吸收干扰；③在某些项目检测时能消除非特异性化学反应的干扰。如血清ALT测定，血清中的内源性丙酮酸及其它酮酸也可与试剂中的指示酶（乳酸脱氢酶）起反应，使结果偏高。若先加入缺乏α-酮戊二酸的第一试剂，使其它酮酸与指示酶反应之后再加入含有α-酮戊二酸的第二试剂，启动真正的ALT酶促反应生成丙酮酸，而丙酮酸与乳酸脱氢酶的反应消耗的NAD＋能真正反映ALT的活性，从而消除以上副反应的影响。

四、测定过程的自动监测
各种自动生化分析仪或多或少都具有对测定过程进行各种监测的功能，以便在没有人"监督"化学反应的情况下提高检测的准确性。高档分析仪的监测功能更强。
1．试剂空白监测 每种试剂都有一定的空白吸光度范围，试剂空白吸光度的改变往往提示着该试剂的变质：如利用Trinder反应为原理的检测试剂会因酚被氧化为醌而变为红色；碱性磷酸酶、γ－谷氨酰转移酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或硝基苯胺而变黄；有些试剂久置后变浑浊。这些情况均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应检测项目，其试剂在放置过程中空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降等。
试剂空白的测定方法有两种：①每瓶试剂在使用前通过对试剂空白校准来确定试剂空白吸光度，这种方式适用于先取样品后加试剂的分析仪。②每个样品测定前均检测试剂空白吸光度，适用于先加试剂后取样品的分析仪。
2．试剂空白变化速率监测 一些酶试剂在反应温度下不稳定，其空白吸光度可随着时间逐渐发生变化，这种变化的主要原因与工具酶或辅酶的纯度有关，且因试剂的组成和生产厂家的不同而不同。这种变化会影响测定结果的准确性，一般使结果偏高。如果设置此项监测，分析仪在结果计算时会自动减去试剂空白变化速率。在以监测NAD（P）H减少为指示反应的酶活性测定中，空白速率可监测并消除由NADH自身氧化所造成的吸光度下降；在色素原为底物的酶活性测定中，空白速率可监测并消除底物自身分解造成的吸光度升高。有关空白速率监测在胆红素对碱性苦味酸速率法测定肌酐负干扰消除中的作用，已如前述。
3．样品信息监测 由于样品的溶血、脂浊、黄疸会对测定结果产生非化学反应的干扰。根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性，用双波长或多波长检测其性质和程度，一般是测定样品在600nm／570nm、700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的大小来分别判断样品溶血、脂浊和黄疸程度。然后在结果计算时自动减去这部分干扰，这将有利于提高分析结果的可靠性。
4．结果可靠性监测
（1）终点监测：终点法测定要判断所选的测光点是否到达终点或平衡点。一些分析仪在所选终点后再选一个测光点，比较这两点吸光度的差异来判断反应是否到达终点。
（2）线性期监测：连续监测法选择时间－吸光度反应曲线上的线性期来计算酶活性或被测物浓度，因此仪器要确定此连续监测期是否呈线性。其监测方法为①将连续监测到的各吸光度值进行线性回归，计算出各点的方差，根据方差值的大小来判断是否呈线性；②取连续监测期开始若干点的变化速率与连续监测期最后若干点的变化速率进行比较，来判断是否为线性期。
5．底物消耗的监测 在连续监测法测定酶活性时，如果在监测期内吸光度上升或下降超过其底物耗尽值，则说明该样品酶活性非常高，底物将被耗尽，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不可靠。此时不打印结果或打印结果同时也打印出底物耗尽提示，该样品应稀释一定的倍数重新测定。此监测对于采用负反应分析酶活性的方法甚为重要。见图7-9

6．方法线性范围监测 每种待测物分析都有一个可测定的浓度或活性范围，样品结果若超过此范围，分析仪将显示测定结果超过线性范围的提示，多数分析仪会自动将样品减量或增量重新测定。

四、分析参数设置举例
以肌酸激酶的某通用试剂盒在某分析仪上使用为例，设置其反应程序中的主要参数。
1．某生化分析仪有关参数的设置范围 样品量2－35?l，第一试剂量20－270?l，第二试剂量20－270?l，总反应容量180－350?，吸光度监测周期18s，总反应时间10min，各试剂可加入时间：1.5min，4.5min，9.5min。
2．肌酸激酶试剂盒通用参数 样品量50?l，第一试剂1000?l，37℃保温5min，加第二试剂500?l，延滞时间2min在340nm读第一点吸光度，连续监测2min。
3．根据以上条件进行参数设置
（1）按比例减少样品量和各试剂量：使反应液总容量在分析仪180－350?l范围内。选择样品量为10?l，第一试剂200?l，第二试剂100?l，这时反应液总容量是310?l。或者选择样品量为8?l，第一试剂160?l，第二试剂80?l，这时反应液总容量是248?l。
（2）确定第二试剂加入时间：根据通用参数，应选择4.5min为第二试剂加入点。
（3）确定各个吸光度选择点：由于第二试剂加入时间4.5min，换算成监测周期为第16，17点之间，加上2min延滞时间，则在第24监测点为第一点吸光度，并连续选择24-31监测点。
（4）计算K值：根据样品量10?l，第一试剂200?l，第二试剂100?l，代入计算公式
则K = = = 4984
也可以采用肌酸激酶的校准品，执行校准程序来得到校准K值。
4．对新设置的反应参数进行试运行 在开始运行时，分析仪会对各反应参数之间的逻辑合法性进行检测，如果反应参数中出现逻辑性错误，则分析仪会显示错误信息并停机，这时可以根据提示信息对反应参数进行修改。

第四节 自动生化分析仪的工作过程和操作方法

一、工作过程
在测定过程中所有机械步骤均由微处理器根据已设定的程序（procedure）进行工作。
1．取样加试剂和混匀 样品盘转动，使样品进入待测位置，样品针定量吸取样品加入一反应杯；反应盘旋转；试剂转盘转动使所需试剂瓶进入试剂吸取位置，试剂针定量吸取试剂加入反应杯；搅拌机构将反应杯内液体进行搅拌混匀。此后，便按递进原理对下一样品进行采样、加试剂等同样操作。
2．保温反应和吸光度检测 反应盘旋转，反应杯内液体在恒温条件下进行化学反应，当该反应杯通过吸光度检测窗口时即被检测得到一个吸光度值；再按规定的间隔时间检测反应过程中的吸光度值直至总反应结束。总反应时间一般为10min，如果18s为检测吸光度的间隔时间（interval time），则10min得到34个吸光度值，若15s为间隔时间，则得到40个吸光度值。
分析仪能显示或/和打印反应全过程的时间－吸光度曲线，从这条曲线上，能观察和计算化学反应的速度、时间，以及反应呈线性段的时间，从而可为确定分析方法类型、参数设置等提供依据。
3．计算并显示或打印结果 分析仪根据各测光点读数对某一检测项目进行结果计算，并显示或打印出每个项目的报告，也可按标本显示或打印出全部项目的累积。即待某样品指定的项目测试完毕，便显示或打印检测结果。

二、操作方法
（一）操作前的各项检查
1．正常开机以后，检查冲洗用水装置是否正常、各项分析试剂是否充足、各种清洗剂是否足够，以及样品针、试剂针和搅拌棒是否清洁。
2．确认要进行校准的项目，确认要做的质控批号及项目，以及校准品、质控品是否足够。
3．进行光度计自检来确认光路与检测系统是否处于正常工作状态。
（二）校准
分析仪在样品分析之前都要对该分析项目进行校准（也称定标），得出一个该项目的校准系数（K）。校准前首先必须在反应程序里设定有关校准的参数，如校准液的代码、位置及浓度值等。执行校准程序，检测得到该校准品的吸光度值，再根据校准浓度计算校准系数（K=校准品浓度/校准品吸光度）。
1．校准方式 有单点校准、两点校准和多点校准，大多数检测项目的校准曲线呈直线且通过原点，用单个浓度的校准液即可，若校准曲线呈直线但不通过原点，则需用两个浓度的校准液做两点校准；当校准曲线不呈直线而为真正的曲线时，应做多点校准，并按其线形选择不同的曲线方程进行拟和，如双曲线、抛物线、幂函数、指数函数、对数函数等方程等，多数生化分析仪已设置有数种曲线方程可将多点校准的结果自动进行数据处理，得到曲线拟和方程，样品的检测吸光度便可通过此方程计算出结果。
2．对校准的要求
（1）选择合适（配套）的校准品，包括校准品数目、类型和浓度。
（2）如有可能校准品应溯源到参考方法或参考物质。
（3）确定校准的频度。根据检测项目方法和试剂的稳定性不同而确定不同的校准频度，如每日校准、每周校准、每月校准、每两月校准等，至少每六个月进行一次校准。
（4）如有下列情况发生时，必须进行校准：①改变试剂的种类，或者批号更换了。如果实验室能说明改变试剂批号并不影响结果的范围，则可以不进行校准。②仪器或者检验系统进行一次大的预防性维护或者更换了重要部件，这些都有可能影响检验性能。③质控反映出异常的趋势或偏移，或者超出了实验室规定的接受限，采取一般性纠正措施后，不能识别和纠正问题时。
（三）质控品测定
质控是保证检测结果可靠性的一个重要手段，因此每批样品的分析测定均应该有质控样品同时监测。关于分析仪的批测定，是指一批样品从开始测定到完成测定后停止的整个过程。其中如果进行了添加或更新试剂、进行了有可能改变吸光度的维护等操作，均应进行一次质控样品的检测，以便及时监测到分析系统的改变。
所有分析仪都已设定或固化了有关质控的分析程序，①设定有关质控参数，如每个质控品的批号、靶值和标准差；②选择质控图的方式，如均值－标准差质控图；③质控结果的统计分析，分析仪会保存每次测定的质控结果，并对其进行统计，以列表或质控图的形式在屏幕上显示。可根据质控结果在质控图上的位置判断其是否在控。如果判为失控则应从试剂、质控品、校准品和分析仪等几方面寻找原因。通过对质控结果的分析，也可以了解某项目的分析精密度和准确度的改变。
（四）检测项目的输入与测定
1．项目输入
（1）逐项输入：每份样品可以任选分析仪中已设置的且试剂室内已预置试剂的项目中的一项、几项或全部项目。
（2）项目组合输入：把与疾病相关的检验项目组合在一起，进行组合检验，这有利于方便病人，有利于疾病的诊断和预后分析，同时也简化了分析操作，提高分析效率。
（3）批量输入：对于有连续相同测定项目的样品，可使用批量输入的方法。
2．进行测定 多数全自动分析仪的操作非常方便，在开始测定画面，输入该批第一个样品的样品号，分析仪即会自动逐个地对样品进行测定。一般在开始画面还有选择：①是否需要对结果超过设定的线性范围、超过允许的吸光度上限等的样品自动进行重复测定；②测定结果是否需要按照已设定的打印格式自动打印与测定结果有关的选项。
3．急诊检验 几乎所有全自动生化分析仪都具备"急诊优先"的功能，仪器留有急诊样品的分析位置或专用样品架以及急诊分析的专用编号。一旦在急诊样品位置上放置了样品，并设定了急诊检验的项目，分析仪就会在常规样品的测定过程中，优先安排对该样品进行分析测定。
（五）样品的减量与预稀释方式
当样品中待测物浓度很高时，其结果往往会超过该项目的线性范围上限。此时分析仪一般会进行自动减少样品量重新测定。分析仪在结果计算时会自动按照样品量的减少比例进行计算。样品的预稀释方式是指在分析过程中仪器首先对样品做自动稀释，然后进行测定。操作过程是，首先由样品针吸取一定量样品，加入反应杯，然后反应杯旋转至加试剂位置，由试剂针吸取稀释液加入已取样品的反应杯，由搅拌针进行搅拌混匀，当再次旋转至取样位置时，由取样针在已稀释的反应杯里吸取已稀释的样品，加至另一个反应杯。前一个反应杯作为预稀释样品用，后一个反应杯将加入试剂产生化学反应用于测定。样品预稀释的优点在于，稀释过程能自动化进行，能使用到高达100倍或更高的稀释比例。但是每进行一次样品预稀释需占用3个取样周期(sampling cycle)，使分析速度减慢。
（六）分析仪的维护
分析仪的常规维护(maintenanc)是保证分析仪能够正常运行的重要手段。分析仪要严格根据操作手册的要求进行维护，一般包括每天维护、每周维护、不定期维护等几方面。
1．每天维护 ①清洗样品针，试剂针，特别是搅拌棒容易缠上纤维蛋白，是最常见的交叉污染源。②加试剂。③加清洗剂。
2．每周维护 ①执行比色杯清洗程序对比色杯进行清洗。这是由于比色杯经过反复使用后，会在比色杯内壁附有用常规方法难以彻底冲洗的物质，这些物质会引起交叉污染，通过使用专用的反应杯清洗剂能比较彻底地对这些附着物进行清洗。②对比色杯进行空白吸光度检查，以了解比色杯经过一段时间使用后透光性的改变情况，以及光路系统的情况。③对于用恒温水浴方式进行保温反应的仪器，要对恒温水槽进行清洗。
2．不定期维护 是指对一些易磨损的消耗部件进行检查与更换。①检查进样注射器是否漏水，检查各冲洗管路是否畅通，检查各机械运转部分是否工作正常。②比色杯是否需要更换。③光源灯是否需要更换。
（七）分析仪数据连网
分析仪的数据连网是指分析仪与实验室网络系统之间分析数据的互传与共享。连网的实现是通过分析仪的数据接口以及接口软件来完成，通过连网，能使来自分析仪的结果数据在网络软件的强大功能下得到进一步的处理，如报告单的格式（形式）更加为医生与患者所接受；患者的信息与对应的检验结果能长期保存；结果的分析与管理更为完善。

三、自动化分析与手工操作的比较
与手工法相比，自动化分析具有许多优点，但也存在一些缺点。
（一）优点
1．检测速度快。
2．检测灵敏度高 由于分析仪采用了高灵敏的发光二极管等检测器，使可检测的吸光度达1.0-3.0甚至以上，多数在2.5以上，且吸光度可精确到0.0001。因而在符合郎伯－比尔定律的前提下，线性上限提高 。
3．检测准确度高 分析仪能全过程检测吸光度，因而能准确地判断终点；使终点法结果准确，能做连续监测法使酶活性检测更准确，以及各种自动监测判断功能使检测结果的准确性提高。
4．检测精密度高 分析仪尤其是高档分析仪，其取样品和加试剂的精度高，人为误差小，各类偶然误差也小，使检测精密度大大提高。
5．样品和试剂用量减少 样品用量减少的主要好处是在同样采血量的前提下，可检测项目增多；试剂用量减少则大大降低了试剂成本。
6．其他 ①能精确地控制反应时间，这对于连续监测尤其重要。②能精确地控制反应温度，这对酶促反应特别重要。③能进行复杂的结果计算，如非线性计算，使非线性的检测项目如载脂蛋白能得到准确测定。
（二）缺点
1．选择次波长较困难 因分析仪无连续波长可选，因而选择合适的次波长有时很困难。
2．操作时间受限 如各检测项目加试剂时间只能统一固定在2到3个时间点，总反应时间只能固定在10min或15min等。
3．操作复杂性受限 ①加试剂的次数受限制，多数只能加1到2种试剂即单试剂法或双试剂法，因而有些检测方法无法在分析仪上测定，如改良J-G法测定血清胆红素。需加三次或以上试剂的检测项目就无法进行自动化分析。②无法做复杂的操作如检测过程中的离心、过滤、萃取、煮沸等步骤，使有些检测项目无法实现自动分析。③选择和改变反应温度困难。
4．样品量/试剂量的比例受限制 由此影响了某些检测项目的最低检测限和线性上限。
5．做参考方法受限制 由于操作复杂性受限，以及反应过程中发生的现象难以观察，不能中断操作过程做一些灵活的操作改变等，因此操作复杂的参考方法一般由手工操作。
6.仪器维护和保养较复杂。

第五节 干片式生化分析仪简介

一、仪器结构
干片式生化仪由干片(dry sheet)试剂和检测仪器两部分组成。
（一）干片试剂
所有检测项目的试剂都做成干片，成为干片试剂，干片试剂的结构从上到下一般分为展开层、试剂层、显色层和支持层，见图7-10。
（二）检测仪器
检测仪器也有半自动和全自动之分。半自动分析仪在分析过程中试剂片的选择与放入和待测样品的加入均需要由人工逐个去完成，且测定速度较慢。全自动分析仪则只要在样品盘或样品架上放好待测样品，在操作屏幕上设定好需测定的项目，由分析仪自动选取干片试剂、自动进行定量取样、孵育和检测，且测定速度较快。 二、分析原理
（一）分析过程
样品在干片试剂中各层中的反应过程如下。
1．展开层 待测样品定量加到干片试剂上，由展开层把样品均匀展开，并且阻挡固体物质如红细胞和大分子物质进入试剂层。展开层还能为反射光检测提供一个具有反射的背景。
2．试剂层 样品中的水分成为干式试剂的溶剂，试剂与待测物质进行化学反应。试剂层的结构还能控制多步化学反应的反应次序。
3．显色层 化学反应的产物在显色层与显色试剂起呈色反应。支持层为一透明胶片，仅起支撑试剂干片的作用。
4．吸光度检测 整个过程经过一个规定的时间，由反射光度计进行检测分析。光度计的单色光透过支持层、显色层、试剂层，一部分光线被吸收，另一部分光线则反射到接收器被检测。待测物浓度越高，光线被吸收越多，检测到的反射光越弱，因而待测物浓度与吸光度成正比。（图7-10）

图7-10 干式试剂测定示意图
（二）分析方法原理
测定不同待测物利用不同的方法原理。如血氨测定，氨干试剂片的有效成分是溴酚蓝（bromphenol blue）,其它成分包括表面活性剂、缓冲成分和保湿剂。氨通过半透膜进入试剂层，与指示染料溴酚蓝反应产生颜色产物，其颜色强度也即吸光度与样品中氨含量成正比，由反射光度计在605nm进行吸光度检测，与经同样检测的氨校准品进行比较，得到样品中氨的浓度。血氨测定的分析参数很简单：样品10μl，反应时间5min，波长605nm。

第六节 自动生化分析仪性能评价

生化分析仪有全自动和半自动之分。全自动分析仪将取样至出结果的全过程都自动完成。操作者只要把样品放在分析仪一定的位置上，输入要测定的项目代号，仪器就会根据分析程序自动地进行操作，并打印出测定结果。某些全自动生化分析仪不具备清洗反应杯的功能，必须将反应盘从分析仪中取出手工清洗，高档自动生化分析仪则能自动清洗反应杯，因而节省了时间，提高了效率。自动化程度越高，人力资源越节省，高档自动化仪器节约了大量的劳动力。举例来说，一台分析速度为1600测试/h的分析仪，工作4小时所完成的工作量，如果用手工操作，一般需要15到20个人工作1天。另外由于全自动化操作，并且分析仪设有完善的测定过程监测功能，因此人为主观误差因素很小，检测精密度大大提高。
半自动分析仪的工作原理为连续流动式分析，实际上叫自动比色仪可能更恰当，其流动式管道即为比色杯，因而不同样品反应液之间互染率大。其优点是结构简单，价格便宜，无不同比色杯之间的吸光性差异。缺点有：① 交叉污染较重，样品间、试剂间以及反应液之间相互影响不可避免。②每个样品检测后均需冲洗才能进行下一个测定，速度很慢。③分析过程中的某些步骤需手工完成（如加试剂、取样、混合、保温等）。这类仪器体积小，结构简单，价格低，分析仪的测定过程监测功能较为简单，也存在一定的主观误差。目前更多地用于研究性实验或教学中。
分析速度是自动生化分析仪最重要的分析性能，其次，与分析方法性能类似，生化分析仪的分析性能也包括准确度、精密度、检测范围等。

一、分析速度
在分析方法相同的情况下不同分析仪的分析速度不同，影响分析速度的有以下因素：
1．通道数量 通道(channel)数主要与分析仪所能容纳的试剂瓶数量有关，因为试剂瓶数量决定分析仪同时能测定的项目数。半自动分析仪为连续流动式，属单通道分析仪，一次只能分析一个项目，要等一个样品或一批样品相同的项目测定完毕后才能分析另一个项目，因此分析效率很低。多通道分析仪可同时任选多种测定项目检测，因此分析效率高。
2．取样周期 每加一次样品或试剂的时间为一个取样周期，取样周期决定了分析仪的工作速度。加试剂周期与取样周期相应；对于单针取样的分析仪，如取样周期为10s，理论上每60min可取样360次，则其工作速度为360测试/h；若取样周期为4.5s，则理论工作速度为800测试/h，依此类推。只有一组加试剂装置的分析仪在做双试剂法测定时，加第二试剂也要占用一个取样周期，使工作速度减半；如果有两组加试剂装置，因在另一试剂吸取位置添加第二试剂，所以工作速度不变。
3．反应杯数量 反应杯数量多，容许同时处于取样、反应检测和清洗状态的反应杯数量便多，分析效率可提高。反应杯数量多可为较短的取样周期提供条件。
4．一次能容纳的样品数量 一次同时能容纳的样品量也即批处理样品量，分析仪对每批样品进行测定的前后均有一个启动过程和停止过程，这两个过程各需要数分钟到十数分钟不等。因此，若批处理样品量大，则分析速度快。
5．试剂瓶容量 试剂瓶容量小，对检测频率高的项目（如葡萄糖、丙氨酸氨基转移酶等），可能会出现在某批样品测定中试剂不够的情况，此时需中断测定添加试剂，而使检测效率下降。正因为如此，对这类高频率出现的检测项目，有时设置两个试剂瓶位置。
6．合适的项目组合 具双圈反应盘（一般有240×2个反应杯）的分析仪有两套阵列式光电检测器，能同时对内圈和外圈的反应杯进行吸光度检测。这种系统要求有两支取样针，1个样品被两支取样针同时吸取两份样品，分别加于内外圈反应杯中，其加试剂装置为灌注式，可同时在两个反应杯中加两种不同的试剂。这个系统的测试速度更快，如果取样周期为4.5s，理论上每小时可得到1600个测试。这个系统还可配置4支取样针，1个样品被4支样品针同时吸取4份样品，放到双圈反应盘的4个反应杯中，然后同时加4种不同的试剂。这时如果取样周期为6s，则理论上每小时可得到2400个测试。
在双圈反应杯、2支取样针或4支取样针系统，一次能同时对一个样品的2个或4个检测项目吸取样品，这2个或4个检测项目便需组合在一起测定。也就是说，如果一个样品同时需要检测该2个或4个项目，则能使分析仪发挥最大的分析效率；若某一样品只需要检测该组合项目中的1项或1-3项，则该分析仪的分析效率便不能最大程度地发挥。
7．组合式自动生化分析仪 其分析速度为各分析模块分析速度的加和。如两台每小时分别为2400、800个测试的分析模块，可组合成理论上最大分析速度为每小时3200个测试的分析仪；两台同样为每小时1600个测试的分析模块，也能组合成理论上分析速度为每小时3200个测试的分析仪。

二、分析仪性能指标
自动生化分析仪的性能除分析速度外，还包括准确度、精密度、检测能力和检测成本等。分析仪生产厂家关于其分析仪的介绍资料中通常列出许多性能指标，这些指标实际上是性能的解释。
（一）准确度
吸样、加试剂、温控准确度，以及光路系统如波长、检测器准确度和波谱带宽等，都影响检测准确度，这些因素往往使相同项目的检测结果向同一方向偏离。有关这些准确度的指标通常无具体说明，但可以通过相应的实验来检测。应当说多数分析仪对有关这些部件的制作及其工作的准确度比手工操作及其所用的仪器好得多。
（二）精密度
以上影响准确度的因素同样可因其制作不精而使工作稳定性较差，造成精密度不佳，吸样精度以及样品针、试剂针、反应杯的交叉污染是影响精密度的主要因素，有关分析仪的资料中通常会介绍防止和减少交叉污染的措施，主要是其冲洗系统各有特点，冲洗效果可能不同。
（三）检测能力
1．检测方法 多数分析仪能做终点法、固定时间法、连续监测法和透射比浊法。
2．检测时间 分析仪通常可检测最长10min的反应，个别能检测15-22min甚至更长时间。3．加试剂次数 能加1-4种试剂，多数为2种。
4．检测范围 对微弱光线的检测能力即能检测吸光度的最高值，其准确度决定检测上限；检测灵敏度则为能辨别待测物最小浓度差的能力，有时与最低检出浓度一致，但后者主要取决于方法灵敏度。
（四）检测成本
反应杯类型和寿命决定其耗费，最小样品量影响试剂用量，最小反应杯液量可决定样品和试剂用量。目前临床生化绝大部分检测已实现自动化分析，其中多数由自动生化分析仪(automatic biochemical analyzer)完成。自动生化分析仪由电脑控制，将生化分析中的取样(sampling)、加试剂、混匀、保温反应、检测(detect)、结果计算、可靠性判断、显示和打印、以及清洗(Cleaning)等步骤组合在一起自动操作。其电脑不但用来控制自动化分析仪，也用来安排测试（test）要求和打印结果。自动生化分析技术提高了临床生化检验质量和速度，可减轻检验人员的劳动强度，节约样品和试剂，增加检验项目，提高检测精密度，减少实验误差，并且有利于临床检验标准化的实现。
自动生化分析仪按其工作方式不同分为连续流动式(continuous streaming movement style)或管道式、分立式(discrete style)、离心式(centrifugation style)和干片式(drying style) ，其中以分立式应用最为广泛，而干片式由于具备体积小、试剂以每个测试为单位独立使用，且操作简便等优点，多为急诊检验所采纳，样品数量很少的医院也可选用，连续流动式和离心式现已很少使用。本章主要介绍分立式自动生化分析仪及其应用，对干片式分析仪也将作简单介绍。

第一节 分立式自动生化分析仪的结构

分立式自动生化分析仪完全模仿手工操作方式设计，自动生化分析仪的各部分结构对应手工操作的每个步骤包括取样、加试剂、混匀、孵育、检测、结果计算、器材清洗等，分述如下： 一、基本结构
（一）样品盘或样品架
样品盘（specimen disc）是放置待测样品的转盘，可放置一定数量的样品杯（specimen cup）或不同规格的采血试管，通过样品盘的转动来控制不同样品的进样。另一种方式是样品架（specimen stock），每个样品架可放数只样品杯或采血试管（多为5只或10只）。样品杯或采血试管均可盛载血清、血浆、尿液等样品。样品架的移动通过样品传送带来进行，以样品架上的条形码（barcode）或底部编码孔识别样品架号及样品位置号。有些仪器有专用于急诊样品、校准品和质控品的可识别架（见图7-1），更多仪器通过固定专用位置来区分这些样品架类型。样品杯或采血试管可贴上包含样品性质和编号的条形码，分析仪通过对样品条形码识别不同的样品。

样品架的优点有：①随着样品架移动及样品的被检测，可不断追加已放置样品杯或采血试管的样品架；②通过样品架的移动能将样品传送到另一个分析模块（analysis die-block）甚至另一台分析仪上再进行分析。而样品盘则只能固定在某个分析模块或某台分析仪上被检测；但多数样品盘为开放式，对其上的样品可较自由地随时取出和放入。
（二）试剂室和试剂瓶
试剂室（reagent chamber）内可装有放置试剂瓶的转盘，一般可放置20种以上具有一定形状的塑料试剂瓶，大型分析仪可放置30～45种试剂瓶,试剂瓶容量一般为10ml～100ml。通过试剂转盘的转动来选用不同试剂。试剂室也有按试剂架形式设计，可放置容量为250ml～500ml的任意形状的试剂瓶，试剂瓶不能转动，但每个试剂瓶内引出一条试剂管路及其喷嘴，即每种试剂均有专用的加试剂装置，因而不同试剂间无交叉污染；但试剂管路较长使试剂的死体积较大，因而适宜用于使用频率高、消耗试剂量大的检测项目。大型分析仪同时备有第一试剂室和第二试剂室，即具备对同一检测项目添加两次试剂的功能，个别分析仪还具有加入第三试剂的功能。对有条形码装置的仪器可将带条形码的试剂瓶放在试剂室转盘上的任意位置，仪器能自动识别试剂的种类、批号和有效期。试剂室均具有冷藏装置，可将试剂保存在4℃～10℃。
（三）反应杯和反应盘
反应杯（reaction cup）是样品与试剂进行化学反应的场所，同时用作比色杯，这一点与手工操作有显著区别。由透光性好的硬塑料或石英玻璃制成，100只或更多的反应杯围成一圈组成一个反应盘（reaction disc），反应杯的数量往往与分析效率成正比。在测定过程中反应盘作恒速的圆周运动，在静止时向反应杯中加入样品、试剂或进行搅拌混匀，当反应盘相对静止时经过检测窗口的比色杯可进行吸光度检测。比色杯光径有0.5cm～1cm不等，大多数分析仪在计算时将其折算为1厘米光径。
（四）取样和加试剂装置
1．取样装置 取样装置（sampling assembly）由取样针、取样臂、取样管路、取样注射器和阀门组成，能定量吸取样品并加入到反应杯。不同分析仪的取样容量有不同的范围，一般为2μl～35μl，步进0.1微升不等。最低取样量很重要，取样量小对仪器的制作要求就高，是判断高低档分析仪的一个指标。取样针尖上设有电子感应器，具液面感应功能，取样针于样品上方下降，一旦接触到样品液面即停止下降而开始吸样。多数感应器设有防撞装置，遇到阻碍时取样针立即停止运动并报警。某些取样针还设有阻塞报警系统，当取样针被样品中的凝块、纤维蛋白等物质阻塞时，机器会自动报警、加大压力冲洗取样针，并跳过当前样品，进行下一个样品的取样检测。
由于取样针在各样品间产生携带交叉污染，因此所有的自动生化分析仪均对其设置了防交叉污染（crossing contamination）的措施。绝大多数采用水洗方式（又有淋浴式和洗脸盆式之分），在吸取另一个样品前对接触样品的样品针内外壁进行冲洗；也有采用化学惰性液（chemical inertia fluid）的方式来隔绝样品与取样针内外壁之间的接触。
2．加试剂装置 加试剂装置用于定量吸取试剂加入反应杯，可加入试剂容量一般为20μl～380μl。步进1～5微升不等，取样精度在1微升左右。加试剂装置有两种类型，一种类型的组成部件与取样装置类似，其液面感应系统能检测并提示试剂剩余量。与取样装置一样，也同样设置有防止试剂间携带交叉污染的措施，另外，可通过吸取比需要量多一定量的试剂来解决交叉污染问题。另一种类型为灌注式加试剂装置，该装置具有许多条试剂管路及其喷嘴，每种试剂单独使用一条试剂管路和喷嘴。这种加试剂方式的优点是不存在各试剂间的交叉污染。大型自动生化仪多具有两组加试剂装置，可分别从两个试剂室吸取同一个检测项目的第一和第二试剂，大多数分析仪所有检测项目加入第二试剂的时间点统一固定为1个或2个点，也有分析仪有3个加入时间点可供选择。
（五）混匀与搅拌装置
反应杯里的样品与试剂通过搅拌棒搅拌而充分混匀，搅拌棒的形状为扁平棒状或扁平螺旋状，表面的疏水材料能防止反应液被搅拌棒所携带。其工作方式大多为旋转式搅拌，也有震动搅拌方式。也设置了防止搅拌棒在不同反应液之间携带交叉污染的清洗措施。
（六）温控和定时系统
分析仪的反应杯浸浴在恒温循环水或恒温空气中，恒温循环水浴方式的优点是温度传递速度快，但保养要求较高，恒温空气浴方式保养简单，但温度传递速度不如恒温水浴循环方式。温度控制器能使循环水或循环空气的温度控制在规定温度±0.1℃。规定温度可有37℃和30℃两种选择，一般固定在37℃。还有一种恒温液循环加温方式，集干式空气浴和水浴的优点，恒温液为热容量高、蓄热能力强、无腐蚀的液体，使温度均匀稳定，且保养简单。
不同分析仪对检测吸光度的间隔时间有不同的规定，反应时间应该设定为此间隔时间的倍数。总反应时间一般限制在8.5min-10min内，个别分析仪可以设定为15min或22min等。
（七）光路和检测系统
自动生化分析仪以紫外可见分光光度法为主要的检测手段，与一般分光光度计一样，其光路和检测系统由光源、单色器和检测器组成。
1．光源 光源（light source）一般为卤素钨丝灯（halogen tungsten filament lamp），也有采用长寿命的氙灯（xe lamp），要求在340nm～800nm波长范围内能发射出稳定且较平坦的光能。
2．单色器 单色器（monochromato）采用①干涉滤光片（interference filter）分光系统，常带有340nm、38nm0、405nm、500nm、550nm、600nm、660nm等几种滤光片，各滤光片固定在转盘上，以转盘旋转的方式来选择波长。这种分光系统在半自动分析仪中常用，只能在一个检测项目完成后，改变一个波长，再检测另一个项目，且不能同时进行多波长检测。②光栅（raster）分光系统，常在340（或293）nm～850nm范围内选择10～13种固定的单色光。
光栅分光有前分光和后分光两种方式，目前以后分光方式为多见。后分光是光源先透过比色杯中的反应液再照射到光栅上，经色散后所有固定单色光同时通过各自的光纤传输到对应的检测器，微处理器按该分析项目的分析参数选择其中一个或两个波长（双波长方式）的吸光度值，用于分析结果的计算，参见图7-2。后分光的优点是单色器中没有转动部分，因而提高了检测的精度和速度。

3．检测器 检测器（detector）由光敏二极管及放大电路组成，可按设定的间隔时间连续测定各反应杯的吸光度值。
（八）数据处理系统
此系统具有多种数据处理功能。
1．计算测定结果 分析仪检测到的吸光度值或吸光度的变化值扣除试剂空白，乘以校准系数或计算因子K，再由方法学补偿系数a和b校正，即得到被测样品的浓度值或酶的活性。分析仪还可按设定的校准模式如线性或非线性的对数、指数等方式处理校准曲线，从而计算待测样品结果。
2．判断结果准确性 包括结果是否超过参考范围、结果是否超过线性范围和检测范围、试剂空白吸光度有无超范围、连续监测范围内吸光度值变化是否偏离线性，以及底物消耗是否超过设定范围等。
3．保存各种数据 电脑的存储介质不仅可以保存大量的测定结果，还可以保留一定数量的其它相关数据，如被分析项目各检测点吸光度值、各次校准的校准曲线、每天的室内质控数据等，以供随时查询。
4．自我诊断功能 能检测仪器工作状态，有关部分的温度、压力，以及空白比色杯吸光度等。
（九）清洗系统
多数全自动生化分析仪具有反应杯清洗装置。一个反应杯内的反应和检测结束后，该反应杯就被冲洗系统及时冲洗，其清洗过程是：由废液针吸取反应杯内废液，加入清洗剂（detergent）冲洗并抽干后，再经数次去离子水冲洗及抽干，更高级的仪器带有风干技术。然后做杯空白的吸光度检查，若通过检查则此反应杯可继续循环使用；如果不能通过，分析仪将提示该反应杯异常，并跳过此反应杯使用下一个反应杯，或提示更换反应杯。
在检测过程中，样品针、试剂针和搅拌棒一般在用于下一个样品、试剂或反应杯前即清洗一次，此时多数为去离子水冲洗，在一批检测完成后，则自动进行清洗剂清洗。
清洗剂可配有1至3种，除一种常规清洗剂外，其它1至2种可按设定对试剂针、样品针或反应杯进行补充清洗。

二、组合式自动分析仪
（一）组合式自动生化分析仪
将相同或不同的两台或两台以上的分析部分，即分析模块进行组合连接，采用样品架方式使样品通过传输线在不同分析模块间进行传递并检测。各分析模块所分析项目的组合提高了分析效率，这些分析模块除了基于紫外-可见光谱分析原理的分析模块外，还有基于离子选择电极的电解质分析模块，甚至还可组合建立在免疫发光分析原理的免疫分析模块。
（二）实验室自动化系统
实验室自动化系统（laboratory automation system，LAS）是组合各自动分析系统如生化分析系统、免疫分析系统以及血液分析系统等，实现样品自动运输和电脑系统管理各部分的运行，其目的是为了提高工作效率和减少耗损。实验室自动化系统包括样品前处理系统、样品输送系统和各样品分析系统。不同功能的各模块以同一标准来连接，通过计算机控制运行。
样品前处理系统能独立工作，由样品投入部、离心分离部、开栓部、在线分注部、非在线分注部、贴条码部、盖栓部、样品分注收存部、样品接收部等模块构成前处理系统，每一模块既是系统的部分，又是独立的单元，可根据不同需要选择使用，具有灵活性和扩展性。因为采用了统一标准连接设计，前处理系统可通过样品输送部分与样品分析系统连接，组成类似工业领域的生产流水线，从而实现了从采血到报告的实验室全自动化。随着检测样品量的增加，只需添加需要的模块，将其插入连接，即可扩大处理能力。这样可避免同类硬件和功能的重复投资，节省占地面积所需的基础投入。当一模块发生故障时，其余模块仍在运行，在24小时内任意时间对模块进行交替保养维护，不影响日常工作。目前，样品前处理系统已较多用于自动生化分析仪。
由于实验室原拥有自动化分析仪的品牌、型号、档次各不相同，各实验室的检测要求也不同，目前设计和组成一个实用的实验室自动化系统尚不容易，而认为LAS是一个概念的引导更恰当，它是一个向理想实验室迈进的努力方向。

第二节 生化自动化分析方法概要

一、分析方法分类
（一）终点法
被测物质在反应过程中完全被转变为产物，即达到反应终点，根据终点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法（end essay）。实际上被测物并没有完全被转变，而只是与产物达到一个动态的化学平衡，因此该法称为平衡法更为恰当。从时间-吸光度曲线来看，到达反应终点或平衡点时，吸光度将不再变化。分析仪通常在反应终点附近连续选择两个吸光度值，求出其平均值计算结果，并可根据两点的吸光度差来判断反应是否到达反应终点。终点法参数设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。
终点时间的确定：①根据时间-吸光度曲线来确定，如Trinder反应测定尿酸，反应曲线上3～5min时其吸光度已趋向稳定，因而可将5min作为反应终点。②根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定，如在血清白蛋白的溴甲酚绿法测定中，白蛋白与溴甲酚绿在10s内很快完成反应，之后α球蛋白和β球蛋白与溴甲酚绿发生 "慢反应"，使反应曲线上吸光度在10s后仍继续缓慢上升，持续约达10min，因此终点时间应采用10～30s，而不应选择10min。
1．一点终点法 在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，这种方法称为一点终点法（one point end essay），其反应曲线见图7-3。其检测结果的计算公式是：待测物浓度CU=（待测吸光度AU－试剂空白吸光度AB）×K。 K为校准系数，详见第五节二操作方法。

2．两点终点法 在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果，称为两点终点法（two point end essay），其反应曲线见图7-4。计算公式为CU=（待测吸光度A2－待测吸光度A1）×K。该法能有效地消除溶血（hemolysis）、黄疸（icterus）和脂浊（lipo-turbid）等样品本身光吸收（见图7-5）造成的干扰。在单试剂分析加入试剂的初期、或双试剂分析中第二试剂加入之初，若指示反应吸光度尚未明显变化，则可在此时选择第一个吸光度，在指示反应终点时选择第二个吸光度，从而设置成两点终点法。但指示反应初期吸光度无明显变化的化学反应较少，如单试剂方式测定总蛋白、白蛋白、钙、磷、镁等的终点法分析项目，及双试剂方式测定葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等的终点法分析项目，因反应初期吸光度已有明显变化，因而均难以用上述方式设置两点终点法。但在双试剂分析中，如果将第一吸光度选择在第二试剂加入前，此时指示反应一般尚未开始，则能容易设置两点终点法。在此要注意必须将两次读吸光度时不同比色液体积进行校正。目前全自动分析仪均具有此自动校正功能，不必手工进行校正。

（二）固定时间法
指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算，称为固定时间法（fixed-time essay），反应曲线见图7-6。其计算公式与两点终点法相同，为CU=(A2-A1)×K。有时也称此法为两点法。

该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题。例如：苦味酸法测定肌酐，反应的最初30s内，血清中快反应干扰物（如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）能与碱性苦味酸反应；在第二个30s时碱性苦味酸主要与肌酐反应，且此段时间－吸光度曲线的线性较好（故也可用连续监测法测定肌酐）；在80～120s及其以后，碱性苦味可与蛋白质以及其它慢反应干扰物反应。这样选用反应的第二个30s为测定时间，既避免了快反应物质的干扰，也避免了慢反应物质的影响，使肌酐浓度与吸光度变化呈良好的线性关系，有利于提高分析的特异性和准确度。
（三）连续监测法
连续监测法（continuous monitoring essay）又称速率法（rate essay），是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变化值（ΔA/min）计算结果，见图7-7A和B。所谓线性期就是各点吸光度差值相等，如图7-7C所示，图中δ1及δ5值偏小，而δ2＝δ3＝δ4，故A1点至A4点属线性段。此线性期对底物来说属零级反应，期间的ΔA/min即为酶促反应的初速度，其大小与被测酶活性成正比。连续监测法的优点即是可以确定线性期并计算ΔA/min，根据此值再准确地计算酶活性，因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物。酶活性（U/L）＝ΔA/min×理论（或校准）K值，代谢物浓度CU=ΔA/min×校准K值。关于理论K值和校准K值叙述如下：

1．理论K值 多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准品可用，因而根据酶活性的国际单位定义得出酶活性的计算公式为：酶活性 (U/L)=ΔA/min× ，将此式中 以K来表示，此K值可通过对已知值即指示物质的毫摩尔消光系数（ε）、反应液总容量（TV）、样品容量（SV）和比色杯光径（d）计算后得出，即为理论K值，可作为分析参数输入到分析仪中。
采用理论K值的前提应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度控制精确以及波长准确等。但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进电机精度、滤光片带宽等方面的差异，可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差。温度的影响有时也非常大，由于反应盘是半暴露的，因此随着较冷试剂的加入，反应盘中的温度会逐渐降低，尽管开始测定时反应盘温度已升到37°C，但在某一项目测定过程的开始阶段，温度可能达不到37°C ，甚至仅35°C左右，且反应过程中仍有可能上下波动，这对于酶学反应来说影响是很大的。如采用37°C时的理论K值，将会使测定结果降低，温度的波动还会使得结果的重复性降低。当然，若试剂在加入反应杯前经试剂臂内加热装置预温，则基本不影响反应盘温度。
由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长、带宽以及加样系统的准确性等的影响，书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的不同，因而有必要获得实际的摩尔吸光系数，然后用来计算的K值称为实测K值。
（1）NADH（NADPH）摩尔吸光系数的测定：NADH（NADPH）没有标准纯制品，而且配成溶液后稳定性又较差，不能直接用NADH 或NADPH标准液来校正仪器，须通过有NAD+(NADP+)参与的反应途径。用已糖激酶 (HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系。葡萄糖有标准纯制品，又有国家批准文号的葡葡糖标准液。因此，根据公式A=εbC，已知比色杯光径b和葡萄糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度A后便可计算出NADH（NADPH）的摩尔吸光系数ε为 A/bC。假设，葡萄糖标准液浓度为1Ommo1/L(0.01mol/L)，标准液加入量为3.5μL，酶试剂加入量为335μL，比色杯光径为0.7cm，在340nm测得吸光度为0.465，则
实测NADH摩尔吸光系数= ＝6424 ，即在此台分析仪上340nm波长处测得NADH（NADPH）的摩尔吸光系数为6424，而理论上NADH（NADPH）的ε为6220。
（2）"色素原"酶促产物在405nm波长摩尔吸光系数的测定：有许多酶底物为人工合成的"色素原"底物，其本身无色，经酶作用后释放出有色的反应产物，在405nm波长具有吸收峰。最常用色素原底物及其产物为: ALP测定以磷酸对硝基苯酚 (4-Nitrophenyl phosphate，4-NPP)为底物，经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚(4-Nitrophenol，4-NP)，GGT测定以γ-L-谷氨酰对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或γ-L-谷氨酰-3-羟基-对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)为底物，经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺(p-Nitroaniline，4-NA)或对硝基-5-氨基苯甲酸(2-amino-nitrobenzoicacid， ANBA)。对硝基苯酚的摩尔吸光系数为18700(405nm)，对硝基苯胺的摩尔吸光系数为9870(405nm)，对硝基-5-氨基苯甲酸的摩尔吸光系数为9490(405nm)。下面是对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定方法。
试剂：① 4-NP标准储存液(1Ommo1/L)。② 4-NP标准应用液(2.5mmo1/L，以0.84mol/L AMP缓冲液稀释而成)。③ 底物缓冲液(l5mmol/L 4-NPP配于0.84mol/L AMP-HCL缓冲液中，37℃,pH l0.09土0.02)。
测定方法：4-NP标准液加入量为5μL，底物缓冲液加入量为350μL，波长405nm，光径0.7cm，温度37℃，测定得吸光度为A1；另用蒸馏水代替4-NP标准液，按上述方法测定其吸光度为A2，4-NP标准液吸光度ΔA= A1- A2，若测得ΔA为0.460，则
实测4-NP摩尔吸光系数＝ ＝18662
2．校准K值 酶活性校准品经校准操作后由分析仪自动计算得出。在进行酶学测定时，如果分析条件的变化如温度、样品试剂加量和吸光度检测偏差可同等程度地影响校准物和待测样品，则使用校准品能进行补偿。一般来说以使用校准K值为好，但必须有两个先决条件：①必须使用配套的试剂；②必须使用配套的高质量的校准品，该校准品应具有溯源性。使用与该分析仪配套的酶活性校准品也可得到较好的酶活性测定结果。关于酶活性标准品，欧洲标准局（BCR）和美国国家标准技术研究院（NIST）均发表了人血清基质的酶活性标准物，但目前尚无公认的标准（校准）品问世。
（四）透射比浊法
抗原与相应的抗体结合形成的免疫复合物，在反应液中具有一定的浊度，可由一般分光光度法进行透射比浊（transmission turbidimetry）测定，可用于某些蛋白质和药物浓度等的测定。该法须做多点校准，再经非线性回归，求出抗原或抗体的含量。使用散射比浊法（scatter turbidimetry）能更加准确快速地检测抗原抗体形成浊度的大小或其速度，目前专用的特定蛋白分析仪可做此法检测。有关免疫比浊法原理详见第二章。

二、常用生化检测项目分析方法举例
1．终点法检测 常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。
2．固定时间法 苦味酸法测定肌酐采用此法。
3．连续监测法 对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。
4．透射比浊法 透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。

第三节 分析参数设置

分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改。各种测定项目的分析参数（analysis paramete）大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道，由用户自己设定分析参数。因此必须理解各参数的确切意义。

一、分析参数介绍
（一）必选分析参数
这类参数是分析仪检测的前提条件，没有这些参数无法进行检测。
1．试验名称 试验名称（test code）是指测定项目的标示符，常以项目的英文缩写来表示。
2．方法类型（也称反应模式） 方法类型（assay）有终点法、两点法、连续监测法等，根据被检物质的检测方法原理选择其中一种反应类型。
3．反应温度 一般有30℃、37℃可供选择，通常固定为37℃。
4．主波长 主波长（primary wavelength）是指定一个与被测物质反应产物的光吸收有关的波长。
5．次波长 次波长（secondary wavelength）是在使用双波长时，要指定一个与主波长、干扰物质光吸收有关的波长。
6．反应方向 反应方向（response direction）有正向反应和负向反应两种，吸光度增加为正向反应，吸光度下降为负向反应。
7．样品量 样品量（sampling volum）一般是2μl～35μl，以0.1μl步进，个别分析仪最少能达到1.6μl。可设置常量、减量和增量。
8． 第一试剂量 第一试剂量（first regengt volum）一般是20～300μl，以1μl步进。
9． 第二试剂量 第二试剂量（second regengt volum）一般也是20～300μl，以1μl步进。
10．总反应容量 总反应容量（total reacting volum）在不同的分析仪有一个不同的规定范围，一般是180～350μl，个别仪器能减少至120μl。总反应容量太少无法进行吸光度测定。
11．孵育时间 孵育时间（incubate time）在终点法是样品与试剂混匀开始至反应终点为止的时间，在两点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间。
12．延迟时间 延迟时间（delay time）在连续监测法中样品与反应试剂（第二试剂）混匀开始至连续监测期第一个吸光度选择点之间的时间。
13．连续监测时间 连续监测时间（continuous monitoring time）在延迟时间之后即开始，一般为60～120s，不少于4个吸光度检测点（3个吸光度变化值）。
14．校准液个数及浓度 校准曲线线性好并通过坐标零点的，可采用一个校准液（calibrator）；线性好但不通过坐标零点，应使用两个校准液；对于校准曲线呈非线性者，必须使用两个以上校准液。每一个校准液都要有一个合适的浓度。
15．校准K值或理论K值 通过校准得到的K值为校准K值（calibrate coefficient）或由计算得出的K值为理论K值。
16．线性范围 即方法的线性范围（linearity range），超过此范围应增加样品量或减少样品量重测。与试剂/样品比值有关。
17．小数点位数 检测结果的小数点位数（decimal point digit）。
（二）备选分析参数
这类分析参数与检测结果的准确性有关，一般来说不设置这类分析参数，分析仪也能检测出结果，但若样品中待测物浓度太高等，检测结果可能不准确。
1．样品预稀释 设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个数值，便可在分析前自动对样品进行高倍稀释。
2．底物耗尽值 底物耗尽值（substrate exhaust limit）在负反应的酶活性测定中，可设置此参数，以规定一个吸光度下降限。若低于此限时底物已太少，不足以维持零级反应而导致检测结果不准确。
3．前区检查 免疫比浊法中应用，以判断是否有抗原过剩。将终点法最后两个吸光度值的差别（ΔA）设置一个限值，如果后一点的吸光度比前一点低，表示已有抗原过剩，应稀释样品后重测。
4．试剂空白吸光度范围 超过此设定范围表示试剂已变质，应更换合格试剂。
5．试剂空白速率 连续监测法中使用，是试剂本身在监测过程中没有化学反应时的变化速率。
6．方法学补偿系数 用于校准不同分析方法间测定结果的一致性，有斜率和截距两个参数。
7．参考值范围 对超过此范围的测定结果，仪器会打印出提示。
（三）某些参数的特殊意义
1．最小样品量 最小样品量是指分析仪进样针能在规定的误差范围内吸取的最小样品量。一般分析仪的最小样品量是2μl，目前也有小至1.6μl的。在样品含高浓度代谢产物或高活性酶浓度的情况下往往需采用分析仪的最小样品量作为减量参数，从而使分析仪检测范围（与线性范围不同）的上限得以扩大。
2．最大试剂量 方法灵敏度很高而线性上限低的检测项目，如血清白蛋白的溴甲酚氯法测定，以往手工法操作时样品量10μl，试剂量4ml，这样试剂量/样品量比例（R/S）为200，线性上限则为60g/L。此法移植到分析仪上后，R/S却很难达到200，致使线性上限变低。因此对这类检测项目最大试剂量非常重要。
3．弹性速率 在酶活性测定中，当酶活性太高，在连续监测期中已不呈线性反应时，有些仪器具有弹性速率（flexrate）功能，能自动选择反应曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果，使酶活性测定的线性范围得以扩大。如AST可从1000U/L扩展至4000U/L，从而减少稀释及重测次数、降低成本。
4．试剂空白速率 当样品中存在胆红素时，胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负干扰。因为胆红素在肌酐检测的波长505nm有较高光吸收，而且胆红素在碱性环境中可被氧化转变，因而在肌酐反应过程中胆红素的光吸收呈下降趋势。若在加入第一试剂后一段时间内设置试剂空白速率，因为此段中苦味酸尚未与肌酐反应，而胆红素在第一试剂的碱性环境中已同样被氧化转变，因而以第二试剂加入后的速率变化，减去试剂空白速率变化，便可消除胆红素的负干扰，见图7-8。

二、单波长和双波长方式
（一）概念
采用一个波长检测物质的光吸收强度的方式称为单波长(mono-wavelength)方式。当反应液中含有一种组分，或在混合反应液中待测组分的吸收峰与其它共存物质的吸收波长无重叠时，可以选用。在吸光度检测中，使用一个主波长和一个次波长的称双波长方式。当反应液中存在干扰物的较大吸收、从而影响测定结果的准确性时，采用双波长方式更好。
（二）双波长的作用
双波长(di-wavelength)测定优点是①消除噪音干扰;②减少杂散光影响;③减少样品本身光吸收的干扰。从光源，到比色杯、单色器、检测器的整个光路系统中，均存在着随时间发生变化的不稳定的检测信号，即噪音，而双波长检测是同时进行的，两种波长检测产生的噪音基本上相同，因而能消除噪音干扰。当样品中存在非化学反应的干扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时，会产生非特异性的光吸收，而干扰测定结果的准确性。采用双波长方式测定可以部分消除这类干扰，提高检测的准确性。
（三）次波长的确定方法
当被测物的主波长确定之后，再选择次波长。如根据甘油三酯等干扰物吸收光谱特征，选择次波长，使干扰物在主、次波长处有尽可能相同的光吸收值，而被测物在主、次波长处的光吸收值应有较大的差异。一般来说，次波长应大于主波长100nm。以主波长与次波长吸光度差来计算结果。
（四）双波长的具体应用
对于某些反应速度快且无法设置为两点终点法的分析项目，尤其是单试剂分析中，可以利用双波长的方式来部分消除样品本身的光吸收干扰。目前用单试剂法测定的项目应用双波长的为血清总蛋白（双缩脲法）主波长500nm，次波长576nm；血清白蛋白（溴甲酚氯法）主、次波长分别为600和700nm；钙（偶氮砷Ⅲ法）主、次波长分别为 660、770nm；磷（紫外比色法）主、次波长为340、405nm，镁（二甲苯胺蓝法）主、次波长为505和 600nm。

三、单试剂和双试剂方式
反应过程中只加一次试剂称单试剂方式，加两次试剂便为双试剂方式。目前的生化分析仪大多可用双试剂方式分析，其优点是：①可提高试剂的稳定性，多数双试剂混合成单一工作试剂时，其稳定时间缩短；②能设置两点终点法，来消除来自样品本身的光吸收干扰；③在某些项目检测时能消除非特异性化学反应的干扰。如血清ALT测定，血清中的内源性丙酮酸及其它酮酸也可与试剂中的指示酶（乳酸脱氢酶）起反应，使结果偏高。若先加入缺乏α-酮戊二酸的第一试剂，使其它酮酸与指示酶反应之后再加入含有α-酮戊二酸的第二试剂，启动真正的ALT酶促反应生成丙酮酸，而丙酮酸与乳酸脱氢酶的反应消耗的NAD＋能真正反映ALT的活性，从而消除以上副反应的影响。

四、测定过程的自动监测
各种自动生化分析仪或多或少都具有对测定过程进行各种监测的功能，以便在没有人"监督"化学反应的情况下提高检测的准确性。高档分析仪的监测功能更强。
1．试剂空白监测 每种试剂都有一定的空白吸光度范围，试剂空白吸光度的改变往往提示着该试剂的变质：如利用Trinder反应为原理的检测试剂会因酚被氧化为醌而变为红色；碱性磷酸酶、γ－谷氨酰转移酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或硝基苯胺而变黄；有些试剂久置后变浑浊。这些情况均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应检测项目，其试剂在放置过程中空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降等。
试剂空白的测定方法有两种：①每瓶试剂在使用前通过对试剂空白校准来确定试剂空白吸光度，这种方式适用于先取样品后加试剂的分析仪。②每个样品测定前均检测试剂空白吸光度，适用于先加试剂后取样品的分析仪。
2．试剂空白变化速率监测 一些酶试剂在反应温度下不稳定，其空白吸光度可随着时间逐渐发生变化，这种变化的主要原因与工具酶或辅酶的纯度有关，且因试剂的组成和生产厂家的不同而不同。这种变化会影响测定结果的准确性，一般使结果偏高。如果设置此项监测，分析仪在结果计算时会自动减去试剂空白变化速率。在以监测NAD（P）H减少为指示反应的酶活性测定中，空白速率可监测并消除由NADH自身氧化所造成的吸光度下降；在色素原为底物的酶活性测定中，空白速率可监测并消除底物自身分解造成的吸光度升高。有关空白速率监测在胆红素对碱性苦味酸速率法测定肌酐负干扰消除中的作用，已如前述。
3．样品信息监测 由于样品的溶血、脂浊、黄疸会对测定结果产生非化学反应的干扰。根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性，用双波长或多波长检测其性质和程度，一般是测定样品在600nm／570nm、700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的大小来分别判断样品溶血、脂浊和黄疸程度。然后在结果计算时自动减去这部分干扰，这将有利于提高分析结果的可靠性。
4．结果可靠性监测
（1）终点监测：终点法测定要判断所选的测光点是否到达终点或平衡点。一些分析仪在所选终点后再选一个测光点，比较这两点吸光度的差异来判断反应是否到达终点。
（2）线性期监测：连续监测法选择时间－吸光度反应曲线上的线性期来计算酶活性或被测物浓度，因此仪器要确定此连续监测期是否呈线性。其监测方法为①将连续监测到的各吸光度值进行线性回归，计算出各点的方差，根据方差值的大小来判断是否呈线性；②取连续监测期开始若干点的变化速率与连续监测期最后若干点的变化速率进行比较，来判断是否为线性期。
5．底物消耗的监测 在连续监测法测定酶活性时，如果在监测期内吸光度上升或下降超过其底物耗尽值，则说明该样品酶活性非常高，底物将被耗尽，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不可靠。此时不打印结果或打印结果同时也打印出底物耗尽提示，该样品应稀释一定的倍数重新测定。此监测对于采用负反应分析酶活性的方法甚为重要。见图7-9

6．方法线性范围监测 每种待测物分析都有一个可测定的浓度或活性范围，样品结果若超过此范围，分析仪将显示测定结果超过线性范围的提示，多数分析仪会自动将样品减量或增量重新测定。

四、分析参数设置举例
以肌酸激酶的某通用试剂盒在某分析仪上使用为例，设置其反应程序中的主要参数。
1．某生化分析仪有关参数的设置范围 样品量2－35?l，第一试剂量20－270?l，第二试剂量20－270?l，总反应容量180－350?，吸光度监测周期18s，总反应时间10min，各试剂可加入时间：1.5min，4.5min，9.5min。
2．肌酸激酶试剂盒通用参数 样品量50?l，第一试剂1000?l，37℃保温5min，加第二试剂500?l，延滞时间2min在340nm读第一点吸光度，连续监测2min。
3．根据以上条件进行参数设置
（1）按比例减少样品量和各试剂量：使反应液总容量在分析仪180－350?l范围内。选择样品量为10?l，第一试剂200?l，第二试剂100?l，这时反应液总容量是310?l。或者选择样品量为8?l，第一试剂160?l，第二试剂80?l，这时反应液总容量是248?l。
（2）确定第二试剂加入时间：根据通用参数，应选择4.5min为第二试剂加入点。
（3）确定各个吸光度选择点：由于第二试剂加入时间4.5min，换算成监测周期为第16，17点之间，加上2min延滞时间，则在第24监测点为第一点吸光度，并连续选择24-31监测点。
（4）计算K值：根据样品量10?l，第一试剂200?l，第二试剂100?l，代入计算公式
则K = = = 4984
也可以采用肌酸激酶的校准品，执行校准程序来得到校准K值。
4．对新设置的反应参数进行试运行 在开始运行时，分析仪会对各反应参数之间的逻辑合法性进行检测，如果反应参数中出现逻辑性错误，则分析仪会显示错误信息并停机，这时可以根据提示信息对反应参数进行修改。

第四节 自动生化分析仪的工作过程和操作方法

一、工作过程
在测定过程中所有机械步骤均由微处理器根据已设定的程序（procedure）进行工作。
1．取样加试剂和混匀 样品盘转动，使样品进入待测位置，样品针定量吸取样品加入一反应杯；反应盘旋转；试剂转盘转动使所需试剂瓶进入试剂吸取位置，试剂针定量吸取试剂加入反应杯；搅拌机构将反应杯内液体进行搅拌混匀。此后，便按递进原理对下一样品进行采样、加试剂等同样操作。
2．保温反应和吸光度检测 反应盘旋转，反应杯内液体在恒温条件下进行化学反应，当该反应杯通过吸光度检测窗口时即被检测得到一个吸光度值；再按规定的间隔时间检测反应过程中的吸光度值直至总反应结束。总反应时间一般为10min，如果18s为检测吸光度的间隔时间（interval time），则10min得到34个吸光度值，若15s为间隔时间，则得到40个吸光度值。
分析仪能显示或/和打印反应全过程的时间－吸光度曲线，从这条曲线上，能观察和计算化学反应的速度、时间，以及反应呈线性段的时间，从而可为确定分析方法类型、参数设置等提供依据。
3．计算并显示或打印结果 分析仪根据各测光点读数对某一检测项目进行结果计算，并显示或打印出每个项目的报告，也可按标本显示或打印出全部项目的累积。即待某样品指定的项目测试完毕，便显示或打印检测结果。

二、操作方法
（一）操作前的各项检查
1．正常开机以后，检查冲洗用水装置是否正常、各项分析试剂是否充足、各种清洗剂是否足够，以及样品针、试剂针和搅拌棒是否清洁。
2．确认要进行校准的项目，确认要做的质控批号及项目，以及校准品、质控品是否足够。
3．进行光度计自检来确认光路与检测系统是否处于正常工作状态。
（二）校准
分析仪在样品分析之前都要对该分析项目进行校准（也称定标），得出一个该项目的校准系数（K）。校准前首先必须在反应程序里设定有关校准的参数，如校准液的代码、位置及浓度值等。执行校准程序，检测得到该校准品的吸光度值，再根据校准浓度计算校准系数（K=校准品浓度/校准品吸光度）。
1．校准方式 有单点校准、两点校准和多点校准，大多数检测项目的校准曲线呈直线且通过原点，用单个浓度的校准液即可，若校准曲线呈直线但不通过原点，则需用两个浓度的校准液做两点校准；当校准曲线不呈直线而为真正的曲线时，应做多点校准，并按其线形选择不同的曲线方程进行拟和，如双曲线、抛物线、幂函数、指数函数、对数函数等方程等，多数生化分析仪已设置有数种曲线方程可将多点校准的结果自动进行数据处理，得到曲线拟和方程，样品的检测吸光度便可通过此方程计算出结果。
2．对校准的要求
（1）选择合适（配套）的校准品，包括校准品数目、类型和浓度。
（2）如有可能校准品应溯源到参考方法或参考物质。
（3）确定校准的频度。根据检测项目方法和试剂的稳定性不同而确定不同的校准频度，如每日校准、每周校准、每月校准、每两月校准等，至少每六个月进行一次校准。
（4）如有下列情况发生时，必须进行校准：①改变试剂的种类，或者批号更换了。如果实验室能说明改变试剂批号并不影响结果的范围，则可以不进行校准。②仪器或者检验系统进行一次大的预防性维护或者更换了重要部件，这些都有可能影响检验性能。③质控反映出异常的趋势或偏移，或者超出了实验室规定的接受限，采取一般性纠正措施后，不能识别和纠正问题时。
（三）质控品测定
质控是保证检测结果可靠性的一个重要手段，因此每批样品的分析测定均应该有质控样品同时监测。关于分析仪的批测定，是指一批样品从开始测定到完成测定后停止的整个过程。其中如果进行了添加或更新试剂、进行了有可能改变吸光度的维护等操作，均应进行一次质控样品的检测，以便及时监测到分析系统的改变。
所有分析仪都已设定或固化了有关质控的分析程序，①设定有关质控参数，如每个质控品的批号、靶值和标准差；②选择质控图的方式，如均值－标准差质控图；③质控结果的统计分析，分析仪会保存每次测定的质控结果，并对其进行统计，以列表或质控图的形式在屏幕上显示。可根据质控结果在质控图上的位置判断其是否在控。如果判为失控则应从试剂、质控品、校准品和分析仪等几方面寻找原因。通过对质控结果的分析，也可以了解某项目的分析精密度和准确度的改变。
（四）检测项目的输入与测定
1．项目输入
（1）逐项输入：每份样品可以任选分析仪中已设置的且试剂室内已预置试剂的项目中的一项、几项或全部项目。
（2）项目组合输入：把与疾病相关的检验项目组合在一起，进行组合检验，这有利于方便病人，有利于疾病的诊断和预后分析，同时也简化了分析操作，提高分析效率。
（3）批量输入：对于有连续相同测定项目的样品，可使用批量输入的方法。
2．进行测定 多数全自动分析仪的操作非常方便，在开始测定画面，输入该批第一个样品的样品号，分析仪即会自动逐个地对样品进行测定。一般在开始画面还有选择：①是否需要对结果超过设定的线性范围、超过允许的吸光度上限等的样品自动进行重复测定；②测定结果是否需要按照已设定的打印格式自动打印与测定结果有关的选项。
3．急诊检验 几乎所有全自动生化分析仪都具备"急诊优先"的功能，仪器留有急诊样品的分析位置或专用样品架以及急诊分析的专用编号。一旦在急诊样品位置上放置了样品，并设定了急诊检验的项目，分析仪就会在常规样品的测定过程中，优先安排对该样品进行分析测定。
（五）样品的减量与预稀释方式
当样品中待测物浓度很高时，其结果往往会超过该项目的线性范围上限。此时分析仪一般会进行自动减少样品量重新测定。分析仪在结果计算时会自动按照样品量的减少比例进行计算。样品的预稀释方式是指在分析过程中仪器首先对样品做自动稀释，然后进行测定。操作过程是，首先由样品针吸取一定量样品，加入反应杯，然后反应杯旋转至加试剂位置，由试剂针吸取稀释液加入已取样品的反应杯，由搅拌针进行搅拌混匀，当再次旋转至取样位置时，由取样针在已稀释的反应杯里吸取已稀释的样品，加至另一个反应杯。前一个反应杯作为预稀释样品用，后一个反应杯将加入试剂产生化学反应用于测定。样品预稀释的优点在于，稀释过程能自动化进行，能使用到高达100倍或更高的稀释比例。但是每进行一次样品预稀释需占用3个取样周期(sampling cycle)，使分析速度减慢。
（六）分析仪的维护
分析仪的常规维护(maintenanc)是保证分析仪能够正常运行的重要手段。分析仪要严格根据操作手册的要求进行维护，一般包括每天维护、每周维护、不定期维护等几方面。
1．每天维护 ①清洗样品针，试剂针，特别是搅拌棒容易缠上纤维蛋白，是最常见的交叉污染源。②加试剂。③加清洗剂。
2．每周维护 ①执行比色杯清洗程序对比色杯进行清洗。这是由于比色杯经过反复使用后，会在比色杯内壁附有用常规方法难以彻底冲洗的物质，这些物质会引起交叉污染，通过使用专用的反应杯清洗剂能比较彻底地对这些附着物进行清洗。②对比色杯进行空白吸光度检查，以了解比色杯经过一段时间使用后透光性的改变情况，以及光路系统的情况。③对于用恒温水浴方式进行保温反应的仪器，要对恒温水槽进行清洗。
2．不定期维护 是指对一些易磨损的消耗部件进行检查与更换。①检查进样注射器是否漏水，检查各冲洗管路是否畅通，检查各机械运转部分是否工作正常。②比色杯是否需要更换。③光源灯是否需要更换。
（七）分析仪数据连网
分析仪的数据连网是指分析仪与实验室网络系统之间分析数据的互传与共享。连网的实现是通过分析仪的数据接口以及接口软件来完成，通过连网，能使来自分析仪的结果数据在网络软件的强大功能下得到进一步的处理，如报告单的格式（形式）更加为医生与患者所接受；患者的信息与对应的检验结果能长期保存；结果的分析与管理更为完善。

三、自动化分析与手工操作的比较
与手工法相比，自动化分析具有许多优点，但也存在一些缺点。
（一）优点
1．检测速度快。
2．检测灵敏度高 由于分析仪采用了高灵敏的发光二极管等检测器，使可检测的吸光度达1.0-3.0甚至以上，多数在2.5以上，且吸光度可精确到0.0001。因而在符合郎伯－比尔定律的前提下，线性上限提高 。
3．检测准确度高 分析仪能全过程检测吸光度，因而能准确地判断终点；使终点法结果准确，能做连续监测法使酶活性检测更准确，以及各种自动监测判断功能使检测结果的准确性提高。
4．检测精密度高 分析仪尤其是高档分析仪，其取样品和加试剂的精度高，人为误差小，各类偶然误差也小，使检测精密度大大提高。
5．样品和试剂用量减少 样品用量减少的主要好处是在同样采血量的前提下，可检测项目增多；试剂用量减少则大大降低了试剂成本。
6．其他 ①能精确地控制反应时间，这对于连续监测尤其重要。②能精确地控制反应温度，这对酶促反应特别重要。③能进行复杂的结果计算，如非线性计算，使非线性的检测项目如载脂蛋白能得到准确测定。
（二）缺点
1．选择次波长较困难 因分析仪无连续波长可选，因而选择合适的次波长有时很困难。
2．操作时间受限 如各检测项目加试剂时间只能统一固定在2到3个时间点，总反应时间只能固定在10min或15min等。
3．操作复杂性受限 ①加试剂的次数受限制，多数只能加1到2种试剂即单试剂法或双试剂法，因而有些检测方法无法在分析仪上测定，如改良J-G法测定血清胆红素。需加三次或以上试剂的检测项目就无法进行自动化分析。②无法做复杂的操作如检测过程中的离心、过滤、萃取、煮沸等步骤，使有些检测项目无法实现自动分析。③选择和改变反应温度困难。
4．样品量/试剂量的比例受限制 由此影响了某些检测项目的最低检测限和线性上限。
5．做参考方法受限制 由于操作复杂性受限，以及反应过程中发生的现象难以观察，不能中断操作过程做一些灵活的操作改变等，因此操作复杂的参考方法一般由手工操作。
6.仪器维护和保养较复杂。

第五节 干片式生化分析仪简介

一、仪器结构
干片式生化仪由干片(dry sheet)试剂和检测仪器两部分组成。
（一）干片试剂
所有检测项目的试剂都做成干片，成为干片试剂，干片试剂的结构从上到下一般分为展开层、试剂层、显色层和支持层，见图7-10。
（二）检测仪器
检测仪器也有半自动和全自动之分。半自动分析仪在分析过程中试剂片的选择与放入和待测样品的加入均需要由人工逐个去完成，且测定速度较慢。全自动分析仪则只要在样品盘或样品架上放好待测样品，在操作屏幕上设定好需测定的项目，由分析仪自动选取干片试剂、自动进行定量取样、孵育和检测，且测定速度较快。 二、分析原理
（一）分析过程
样品在干片试剂中各层中的反应过程如下。
1．展开层 待测样品定量加到干片试剂上，由展开层把样品均匀展开，并且阻挡固体物质如红细胞和大分子物质进入试剂层。展开层还能为反射光检测提供一个具有反射的背景。
2．试剂层 样品中的水分成为干式试剂的溶剂，试剂与待测物质进行化学反应。试剂层的结构还能控制多步化学反应的反应次序。
3．显色层 化学反应的产物在显色层与显色试剂起呈色反应。支持层为一透明胶片，仅起支撑试剂干片的作用。
4．吸光度检测 整个过程经过一个规定的时间，由反射光度计进行检测分析。光度计的单色光透过支持层、显色层、试剂层，一部分光线被吸收，另一部分光线则反射到接收器被检测。待测物浓度越高，光线被吸收越多，检测到的反射光越弱，因而待测物浓度与吸光度成正比。（图7-10）

图7-10 干式试剂测定示意图
（二）分析方法原理
测定不同待测物利用不同的方法原理。如血氨测定，氨干试剂片的有效成分是溴酚蓝（bromphenol blue）,其它成分包括表面活性剂、缓冲成分和保湿剂。氨通过半透膜进入试剂层，与指示染料溴酚蓝反应产生颜色产物，其颜色强度也即吸光度与样品中氨含量成正比，由反射光度计在605nm进行吸光度检测，与经同样检测的氨校准品进行比较，得到样品中氨的浓度。血氨测定的分析参数很简单：样品10μl，反应时间5min，波长605nm。

第六节 自动生化分析仪性能评价

生化分析仪有全自动和半自动之分。全自动分析仪将取样至出结果的全过程都自动完成。操作者只要把样品放在分析仪一定的位置上，输入要测定的项目代号，仪器就会根据分析程序自动地进行操作，并打印出测定结果。某些全自动生化分析仪不具备清洗反应杯的功能，必须将反应盘从分析仪中取出手工清洗，高档自动生化分析仪则能自动清洗反应杯，因而节省了时间，提高了效率。自动化程度越高，人力资源越节省，高档自动化仪器节约了大量的劳动力。举例来说，一台分析速度为1600测试/h的分析仪，工作4小时所完成的工作量，如果用手工操作，一般需要15到20个人工作1天。另外由于全自动化操作，并且分析仪设有完善的测定过程监测功能，因此人为主观误差因素很小，检测精密度大大提高。
半自动分析仪的工作原理为连续流动式分析，实际上叫自动比色仪可能更恰当，其流动式管道即为比色杯，因而不同样品反应液之间互染率大。其优点是结构简单，价格便宜，无不同比色杯之间的吸光性差异。缺点有：① 交叉污染较重，样品间、试剂间以及反应液之间相互影响不可避免。②每个样品检测后均需冲洗才能进行下一个测定，速度很慢。③分析过程中的某些步骤需手工完成（如加试剂、取样、混合、保温等）。这类仪器体积小，结构简单，价格低，分析仪的测定过程监测功能较为简单，也存在一定的主观误差。目前更多地用于研究性实验或教学中。
分析速度是自动生化分析仪最重要的分析性能，其次，与分析方法性能类似，生化分析仪的分析性能也包括准确度、精密度、检测范围等。

一、分析速度
在分析方法相同的情况下不同分析仪的分析速度不同，影响分析速度的有以下因素：
1．通道数量 通道(channel)数主要与分析仪所能容纳的试剂瓶数量有关，因为试剂瓶数量决定分析仪同时能测定的项目数。半自动分析仪为连续流动式，属单通道分析仪，一次只能分析一个项目，要等一个样品或一批样品相同的项目测定完毕后才能分析另一个项目，因此分析效率很低。多通道分析仪可同时任选多种测定项目检测，因此分析效率高。
2．取样周期 每加一次样品或试剂的时间为一个取样周期，取样周期决定了分析仪的工作速度。加试剂周期与取样周期相应；对于单针取样的分析仪，如取样周期为10s，理论上每60min可取样360次，则其工作速度为360测试/h；若取样周期为4.5s，则理论工作速度为800测试/h，依此类推。只有一组加试剂装置的分析仪在做双试剂法测定时，加第二试剂也要占用一个取样周期，使工作速度减半；如果有两组加试剂装置，因在另一试剂吸取位置添加第二试剂，所以工作速度不变。
3．反应杯数量 反应杯数量多，容许同时处于取样、反应检测和清洗状态的反应杯数量便多，分析效率可提高。反应杯数量多可为较短的取样周期提供条件。
4．一次能容纳的样品数量 一次同时能容纳的样品量也即批处理样品量，分析仪对每批样品进行测定的前后均有一个启动过程和停止过程，这两个过程各需要数分钟到十数分钟不等。因此，若批处理样品量大，则分析速度快。
5．试剂瓶容量 试剂瓶容量小，对检测频率高的项目（如葡萄糖、丙氨酸氨基转移酶等），可能会出现在某批样品测定中试剂不够的情况，此时需中断测定添加试剂，而使检测效率下降。正因为如此，对这类高频率出现的检测项目，有时设置两个试剂瓶位置。
6．合适的项目组合 具双圈反应盘（一般有240×2个反应杯）的分析仪有两套阵列式光电检测器，能同时对内圈和外圈的反应杯进行吸光度检测。这种系统要求有两支取样针，1个样品被两支取样针同时吸取两份样品，分别加于内外圈反应杯中，其加试剂装置为灌注式，可同时在两个反应杯中加两种不同的试剂。这个系统的测试速度更快，如果取样周期为4.5s，理论上每小时可得到1600个测试。这个系统还可配置4支取样针，1个样品被4支样品针同时吸取4份样品，放到双圈反应盘的4个反应杯中，然后同时加4种不同的试剂。这时如果取样周期为6s，则理论上每小时可得到2400个测试。
在双圈反应杯、2支取样针或4支取样针系统，一次能同时对一个样品的2个或4个检测项目吸取样品，这2个或4个检测项目便需组合在一起测定。也就是说，如果一个样品同时需要检测该2个或4个项目，则能使分析仪发挥最大的分析效率；若某一样品只需要检测该组合项目中的1项或1-3项，则该分析仪的分析效率便不能最大程度地发挥。
7．组合式自动生化分析仪 其分析速度为各分析模块分析速度的加和。如两台每小时分别为2400、800个测试的分析模块，可组合成理论上最大分析速度为每小时3200个测试的分析仪；两台同样为每小时1600个测试的分析模块，也能组合成理论上分析速度为每小时3200个测试的分析仪。

二、分析仪性能指标
自动生化分析仪的性能除分析速度外，还包括准确度、精密度、检测能力和检测成本等。分析仪生产厂家关于其分析仪的介绍资料中通常列出许多性能指标，这些指标实际上是性能的解释。
（一）准确度
吸样、加试剂、温控准确度，以及光路系统如波长、检测器准确度和波谱带宽等，都影响检测准确度，这些因素往往使相同项目的检测结果向同一方向偏离。有关这些准确度的指标通常无具体说明，但可以通过相应的实验来检测。应当说多数分析仪对有关这些部件的制作及其工作的准确度比手工操作及其所用的仪器好得多。
（二）精密度
以上影响准确度的因素同样可因其制作不精而使工作稳定性较差，造成精密度不佳，吸样精度以及样品针、试剂针、反应杯的交叉污染是影响精密度的主要因素，有关分析仪的资料中通常会介绍防止和减少交叉污染的措施，主要是其冲洗系统各有特点，冲洗效果可能不同。
（三）检测能力
1．检测方法 多数分析仪能做终点法、固定时间法、连续监测法和透射比浊法。
2．检测时间 分析仪通常可检测最长10min的反应，个别能检测15-22min甚至更长时间。3．加试剂次数 能加1-4种试剂，多数为2种。
4．检测范围 对微弱光线的检测能力即能检测吸光度的最高值，其准确度决定检测上限；检测灵敏度则为能辨别待测物最小浓度差的能力，有时与最低检出浓度一致，但后者主要取决于方法灵敏度。
（四）检测成本
反应杯类型和寿命决定其耗费，最小样品量影响试剂用量，最小反应杯液量可决定样品和试剂用量。目前临床生化绝大部分检测已实现自动化分析，其中多数由自动生化分析仪(automatic biochemical analyzer)完成。自动生化分析仪由电脑控制，将生化分析中的取样(sampling)、加试剂、混匀、保温反应、检测(detect)、结果计算、可靠性判断、显示和打印、以及清洗(Cleaning)等步骤组合在一起自动操作。其电脑不但用来控制自动化分析仪，也用来安排测试（test）要求和打印结果。自动生化分析技术提高了临床生化检验质量和速度，可减轻检验人员的劳动强度，节约样品和试剂，增加检验项目，提高检测精密度，减少实验误差，并且有利于临床检验标准化的实现。
自动生化分析仪按其工作方式不同分为连续流动式(continuous streaming movement style)或管道式、分立式(discrete style)、离心式(centrifugation style)和干片式(drying style) ，其中以分立式应用最为广泛，而干片式由于具备体积小、试剂以每个测试为单位独立使用，且操作简便等优点，多为急诊检验所采纳，样品数量很少的医院也可选用，连续流动式和离心式现已很少使用。本章主要介绍分立式自动生化分析仪及其应用，对干片式分析仪也将作简单介绍。

第一节 分立式自动生化分析仪的结构

分立式自动生化分析仪完全模仿手工操作方式设计，自动生化分析仪的各部分结构对应手工操作的每个步骤包括取样、加试剂、混匀、孵育、检测、结果计算、器材清洗等，分述如下： 一、基本结构
（一）样品盘或样品架
样品盘（specimen disc）是放置待测样品的转盘，可放置一定数量的样品杯（specimen cup）或不同规格的采血试管，通过样品盘的转动来控制不同样品的进样。另一种方式是样品架（specimen stock），每个样品架可放数只样品杯或采血试管（多为5只或10只）。样品杯或采血试管均可盛载血清、血浆、尿液等样品。样品架的移动通过样品传送带来进行，以样品架上的条形码（barcode）或底部编码孔识别样品架号及样品位置号。有些仪器有专用于急诊样品、校准品和质控品的可识别架（见图7-1），更多仪器通过固定专用位置来区分这些样品架类型。样品杯或采血试管可贴上包含样品性质和编号的条形码，分析仪通过对样品条形码识别不同的样品。

样品架的优点有：①随着样品架移动及样品的被检测，可不断追加已放置样品杯或采血试管的样品架；②通过样品架的移动能将样品传送到另一个分析模块（analysis die-block）甚至另一台分析仪上再进行分析。而样品盘则只能固定在某个分析模块或某台分析仪上被检测；但多数样品盘为开放式，对其上的样品可较自由地随时取出和放入。
（二）试剂室和试剂瓶
试剂室（reagent chamber）内可装有放置试剂瓶的转盘，一般可放置20种以上具有一定形状的塑料试剂瓶，大型分析仪可放置30～45种试剂瓶,试剂瓶容量一般为10ml～100ml。通过试剂转盘的转动来选用不同试剂。试剂室也有按试剂架形式设计，可放置容量为250ml～500ml的任意形状的试剂瓶，试剂瓶不能转动，但每个试剂瓶内引出一条试剂管路及其喷嘴，即每种试剂均有专用的加试剂装置，因而不同试剂间无交叉污染；但试剂管路较长使试剂的死体积较大，因而适宜用于使用频率高、消耗试剂量大的检测项目。大型分析仪同时备有第一试剂室和第二试剂室，即具备对同一检测项目添加两次试剂的功能，个别分析仪还具有加入第三试剂的功能。对有条形码装置的仪器可将带条形码的试剂瓶放在试剂室转盘上的任意位置，仪器能自动识别试剂的种类、批号和有效期。试剂室均具有冷藏装置，可将试剂保存在4℃～10℃。
（三）反应杯和反应盘
反应杯（reaction cup）是样品与试剂进行化学反应的场所，同时用作比色杯，这一点与手工操作有显著区别。由透光性好的硬塑料或石英玻璃制成，100只或更多的反应杯围成一圈组成一个反应盘（reaction disc），反应杯的数量往往与分析效率成正比。在测定过程中反应盘作恒速的圆周运动，在静止时向反应杯中加入样品、试剂或进行搅拌混匀，当反应盘相对静止时经过检测窗口的比色杯可进行吸光度检测。比色杯光径有0.5cm～1cm不等，大多数分析仪在计算时将其折算为1厘米光径。
（四）取样和加试剂装置
1．取样装置 取样装置（sampling assembly）由取样针、取样臂、取样管路、取样注射器和阀门组成，能定量吸取样品并加入到反应杯。不同分析仪的取样容量有不同的范围，一般为2μl～35μl，步进0.1微升不等。最低取样量很重要，取样量小对仪器的制作要求就高，是判断高低档分析仪的一个指标。取样针尖上设有电子感应器，具液面感应功能，取样针于样品上方下降，一旦接触到样品液面即停止下降而开始吸样。多数感应器设有防撞装置，遇到阻碍时取样针立即停止运动并报警。某些取样针还设有阻塞报警系统，当取样针被样品中的凝块、纤维蛋白等物质阻塞时，机器会自动报警、加大压力冲洗取样针，并跳过当前样品，进行下一个样品的取样检测。
由于取样针在各样品间产生携带交叉污染，因此所有的自动生化分析仪均对其设置了防交叉污染（crossing contamination）的措施。绝大多数采用水洗方式（又有淋浴式和洗脸盆式之分），在吸取另一个样品前对接触样品的样品针内外壁进行冲洗；也有采用化学惰性液（chemical inertia fluid）的方式来隔绝样品与取样针内外壁之间的接触。
2．加试剂装置 加试剂装置用于定量吸取试剂加入反应杯，可加入试剂容量一般为20μl～380μl。步进1～5微升不等，取样精度在1微升左右。加试剂装置有两种类型，一种类型的组成部件与取样装置类似，其液面感应系统能检测并提示试剂剩余量。与取样装置一样，也同样设置有防止试剂间携带交叉污染的措施，另外，可通过吸取比需要量多一定量的试剂来解决交叉污染问题。另一种类型为灌注式加试剂装置，该装置具有许多条试剂管路及其喷嘴，每种试剂单独使用一条试剂管路和喷嘴。这种加试剂方式的优点是不存在各试剂间的交叉污染。大型自动生化仪多具有两组加试剂装置，可分别从两个试剂室吸取同一个检测项目的第一和第二试剂，大多数分析仪所有检测项目加入第二试剂的时间点统一固定为1个或2个点，也有分析仪有3个加入时间点可供选择。
（五）混匀与搅拌装置
反应杯里的样品与试剂通过搅拌棒搅拌而充分混匀，搅拌棒的形状为扁平棒状或扁平螺旋状，表面的疏水材料能防止反应液被搅拌棒所携带。其工作方式大多为旋转式搅拌，也有震动搅拌方式。也设置了防止搅拌棒在不同反应液之间携带交叉污染的清洗措施。
（六）温控和定时系统
分析仪的反应杯浸浴在恒温循环水或恒温空气中，恒温循环水浴方式的优点是温度传递速度快，但保养要求较高，恒温空气浴方式保养简单，但温度传递速度不如恒温水浴循环方式。温度控制器能使循环水或循环空气的温度控制在规定温度±0.1℃。规定温度可有37℃和30℃两种选择，一般固定在37℃。还有一种恒温液循环加温方式，集干式空气浴和水浴的优点，恒温液为热容量高、蓄热能力强、无腐蚀的液体，使温度均匀稳定，且保养简单。
不同分析仪对检测吸光度的间隔时间有不同的规定，反应时间应该设定为此间隔时间的倍数。总反应时间一般限制在8.5min-10min内，个别分析仪可以设定为15min或22min等。
（七）光路和检测系统
自动生化分析仪以紫外可见分光光度法为主要的检测手段，与一般分光光度计一样，其光路和检测系统由光源、单色器和检测器组成。
1．光源 光源（light source）一般为卤素钨丝灯（halogen tungsten filament lamp），也有采用长寿命的氙灯（xe lamp），要求在340nm～800nm波长范围内能发射出稳定且较平坦的光能。
2．单色器 单色器（monochromato）采用①干涉滤光片（interference filter）分光系统，常带有340nm、38nm0、405nm、500nm、550nm、600nm、660nm等几种滤光片，各滤光片固定在转盘上，以转盘旋转的方式来选择波长。这种分光系统在半自动分析仪中常用，只能在一个检测项目完成后，改变一个波长，再检测另一个项目，且不能同时进行多波长检测。②光栅（raster）分光系统，常在340（或293）nm～850nm范围内选择10～13种固定的单色光。
光栅分光有前分光和后分光两种方式，目前以后分光方式为多见。后分光是光源先透过比色杯中的反应液再照射到光栅上，经色散后所有固定单色光同时通过各自的光纤传输到对应的检测器，微处理器按该分析项目的分析参数选择其中一个或两个波长（双波长方式）的吸光度值，用于分析结果的计算，参见图7-2。后分光的优点是单色器中没有转动部分，因而提高了检测的精度和速度。

3．检测器 检测器（detector）由光敏二极管及放大电路组成，可按设定的间隔时间连续测定各反应杯的吸光度值。
（八）数据处理系统
此系统具有多种数据处理功能。
1．计算测定结果 分析仪检测到的吸光度值或吸光度的变化值扣除试剂空白，乘以校准系数或计算因子K，再由方法学补偿系数a和b校正，即得到被测样品的浓度值或酶的活性。分析仪还可按设定的校准模式如线性或非线性的对数、指数等方式处理校准曲线，从而计算待测样品结果。
2．判断结果准确性 包括结果是否超过参考范围、结果是否超过线性范围和检测范围、试剂空白吸光度有无超范围、连续监测范围内吸光度值变化是否偏离线性，以及底物消耗是否超过设定范围等。
3．保存各种数据 电脑的存储介质不仅可以保存大量的测定结果，还可以保留一定数量的其它相关数据，如被分析项目各检测点吸光度值、各次校准的校准曲线、每天的室内质控数据等，以供随时查询。
4．自我诊断功能 能检测仪器工作状态，有关部分的温度、压力，以及空白比色杯吸光度等。
（九）清洗系统
多数全自动生化分析仪具有反应杯清洗装置。一个反应杯内的反应和检测结束后，该反应杯就被冲洗系统及时冲洗，其清洗过程是：由废液针吸取反应杯内废液，加入清洗剂（detergent）冲洗并抽干后，再经数次去离子水冲洗及抽干，更高级的仪器带有风干技术。然后做杯空白的吸光度检查，若通过检查则此反应杯可继续循环使用；如果不能通过，分析仪将提示该反应杯异常，并跳过此反应杯使用下一个反应杯，或提示更换反应杯。
在检测过程中，样品针、试剂针和搅拌棒一般在用于下一个样品、试剂或反应杯前即清洗一次，此时多数为去离子水冲洗，在一批检测完成后，则自动进行清洗剂清洗。
清洗剂可配有1至3种，除一种常规清洗剂外，其它1至2种可按设定对试剂针、样品针或反应杯进行补充清洗。

二、组合式自动分析仪
（一）组合式自动生化分析仪
将相同或不同的两台或两台以上的分析部分，即分析模块进行组合连接，采用样品架方式使样品通过传输线在不同分析模块间进行传递并检测。各分析模块所分析项目的组合提高了分析效率，这些分析模块除了基于紫外-可见光谱分析原理的分析模块外，还有基于离子选择电极的电解质分析模块，甚至还可组合建立在免疫发光分析原理的免疫分析模块。
（二）实验室自动化系统
实验室自动化系统（laboratory automation system，LAS）是组合各自动分析系统如生化分析系统、免疫分析系统以及血液分析系统等，实现样品自动运输和电脑系统管理各部分的运行，其目的是为了提高工作效率和减少耗损。实验室自动化系统包括样品前处理系统、样品输送系统和各样品分析系统。不同功能的各模块以同一标准来连接，通过计算机控制运行。
样品前处理系统能独立工作，由样品投入部、离心分离部、开栓部、在线分注部、非在线分注部、贴条码部、盖栓部、样品分注收存部、样品接收部等模块构成前处理系统，每一模块既是系统的部分，又是独立的单元，可根据不同需要选择使用，具有灵活性和扩展性。因为采用了统一标准连接设计，前处理系统可通过样品输送部分与样品分析系统连接，组成类似工业领域的生产流水线，从而实现了从采血到报告的实验室全自动化。随着检测样品量的增加，只需添加需要的模块，将其插入连接，即可扩大处理能力。这样可避免同类硬件和功能的重复投资，节省占地面积所需的基础投入。当一模块发生故障时，其余模块仍在运行，在24小时内任意时间对模块进行交替保养维护，不影响日常工作。目前，样品前处理系统已较多用于自动生化分析仪。
由于实验室原拥有自动化分析仪的品牌、型号、档次各不相同，各实验室的检测要求也不同，目前设计和组成一个实用的实验室自动化系统尚不容易，而认为LAS是一个概念的引导更恰当，它是一个向理想实验室迈进的努力方向。

第二节 生化自动化分析方法概要

一、分析方法分类
（一）终点法
被测物质在反应过程中完全被转变为产物，即达到反应终点，根据终点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法（end essay）。实际上被测物并没有完全被转变，而只是与产物达到一个动态的化学平衡，因此该法称为平衡法更为恰当。从时间-吸光度曲线来看，到达反应终点或平衡点时，吸光度将不再变化。分析仪通常在反应终点附近连续选择两个吸光度值，求出其平均值计算结果，并可根据两点的吸光度差来判断反应是否到达反应终点。终点法参数设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。
终点时间的确定：①根据时间-吸光度曲线来确定，如Trinder反应测定尿酸，反应曲线上3～5min时其吸光度已趋向稳定，因而可将5min作为反应终点。②根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定，如在血清白蛋白的溴甲酚绿法测定中，白蛋白与溴甲酚绿在10s内很快完成反应，之后α球蛋白和β球蛋白与溴甲酚绿发生 "慢反应"，使反应曲线上吸光度在10s后仍继续缓慢上升，持续约达10min，因此终点时间应采用10～30s，而不应选择10min。
1．一点终点法 在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，这种方法称为一点终点法（one point end essay），其反应曲线见图7-3。其检测结果的计算公式是：待测物浓度CU=（待测吸光度AU－试剂空白吸光度AB）×K。 K为校准系数，详见第五节二操作方法。

2．两点终点法 在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果，称为两点终点法（two point end essay），其反应曲线见图7-4。计算公式为CU=（待测吸光度A2－待测吸光度A1）×K。该法能有效地消除溶血（hemolysis）、黄疸（icterus）和脂浊（lipo-turbid）等样品本身光吸收（见图7-5）造成的干扰。在单试剂分析加入试剂的初期、或双试剂分析中第二试剂加入之初，若指示反应吸光度尚未明显变化，则可在此时选择第一个吸光度，在指示反应终点时选择第二个吸光度，从而设置成两点终点法。但指示反应初期吸光度无明显变化的化学反应较少，如单试剂方式测定总蛋白、白蛋白、钙、磷、镁等的终点法分析项目，及双试剂方式测定葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等的终点法分析项目，因反应初期吸光度已有明显变化，因而均难以用上述方式设置两点终点法。但在双试剂分析中，如果将第一吸光度选择在第二试剂加入前，此时指示反应一般尚未开始，则能容易设置两点终点法。在此要注意必须将两次读吸光度时不同比色液体积进行校正。目前全自动分析仪均具有此自动校正功能，不必手工进行校正。

（二）固定时间法
指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算，称为固定时间法（fixed-time essay），反应曲线见图7-6。其计算公式与两点终点法相同，为CU=(A2-A1)×K。有时也称此法为两点法。

该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题。例如：苦味酸法测定肌酐，反应的最初30s内，血清中快反应干扰物（如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）能与碱性苦味酸反应；在第二个30s时碱性苦味酸主要与肌酐反应，且此段时间－吸光度曲线的线性较好（故也可用连续监测法测定肌酐）；在80～120s及其以后，碱性苦味可与蛋白质以及其它慢反应干扰物反应。这样选用反应的第二个30s为测定时间，既避免了快反应物质的干扰，也避免了慢反应物质的影响，使肌酐浓度与吸光度变化呈良好的线性关系，有利于提高分析的特异性和准确度。
（三）连续监测法
连续监测法（continuous monitoring essay）又称速率法（rate essay），是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变化值（ΔA/min）计算结果，见图7-7A和B。所谓线性期就是各点吸光度差值相等，如图7-7C所示，图中δ1及δ5值偏小，而δ2＝δ3＝δ4，故A1点至A4点属线性段。此线性期对底物来说属零级反应，期间的ΔA/min即为酶促反应的初速度，其大小与被测酶活性成正比。连续监测法的优点即是可以确定线性期并计算ΔA/min，根据此值再准确地计算酶活性，因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物。酶活性（U/L）＝ΔA/min×理论（或校准）K值，代谢物浓度CU=ΔA/min×校准K值。关于理论K值和校准K值叙述如下：

1．理论K值 多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准品可用，因而根据酶活性的国际单位定义得出酶活性的计算公式为：酶活性 (U/L)=ΔA/min× ，将此式中 以K来表示，此K值可通过对已知值即指示物质的毫摩尔消光系数（ε）、反应液总容量（TV）、样品容量（SV）和比色杯光径（d）计算后得出，即为理论K值，可作为分析参数输入到分析仪中。
采用理论K值的前提应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度控制精确以及波长准确等。但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进电机精度、滤光片带宽等方面的差异，可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差。温度的影响有时也非常大，由于反应盘是半暴露的，因此随着较冷试剂的加入，反应盘中的温度会逐渐降低，尽管开始测定时反应盘温度已升到37°C，但在某一项目测定过程的开始阶段，温度可能达不到37°C ，甚至仅35°C左右，且反应过程中仍有可能上下波动，这对于酶学反应来说影响是很大的。如采用37°C时的理论K值，将会使测定结果降低，温度的波动还会使得结果的重复性降低。当然，若试剂在加入反应杯前经试剂臂内加热装置预温，则基本不影响反应盘温度。
由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长、带宽以及加样系统的准确性等的影响，书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的不同，因而有必要获得实际的摩尔吸光系数，然后用来计算的K值称为实测K值。
（1）NADH（NADPH）摩尔吸光系数的测定：NADH（NADPH）没有标准纯制品，而且配成溶液后稳定性又较差，不能直接用NADH 或NADPH标准液来校正仪器，须通过有NAD+(NADP+)参与的反应途径。用已糖激酶 (HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系。葡萄糖有标准纯制品，又有国家批准文号的葡葡糖标准液。因此，根据公式A=εbC，已知比色杯光径b和葡萄糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度A后便可计算出NADH（NADPH）的摩尔吸光系数ε为 A/bC。假设，葡萄糖标准液浓度为1Ommo1/L(0.01mol/L)，标准液加入量为3.5μL，酶试剂加入量为335μL，比色杯光径为0.7cm，在340nm测得吸光度为0.465，则
实测NADH摩尔吸光系数= ＝6424 ，即在此台分析仪上340nm波长处测得NADH（NADPH）的摩尔吸光系数为6424，而理论上NADH（NADPH）的ε为6220。
（2）"色素原"酶促产物在405nm波长摩尔吸光系数的测定：有许多酶底物为人工合成的"色素原"底物，其本身无色，经酶作用后释放出有色的反应产物，在405nm波长具有吸收峰。最常用色素原底物及其产物为: ALP测定以磷酸对硝基苯酚 (4-Nitrophenyl phosphate，4-NPP)为底物，经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚(4-Nitrophenol，4-NP)，GGT测定以γ-L-谷氨酰对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或γ-L-谷氨酰-3-羟基-对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)为底物，经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺(p-Nitroaniline，4-NA)或对硝基-5-氨基苯甲酸(2-amino-nitrobenzoicacid， ANBA)。对硝基苯酚的摩尔吸光系数为18700(405nm)，对硝基苯胺的摩尔吸光系数为9870(405nm)，对硝基-5-氨基苯甲酸的摩尔吸光系数为9490(405nm)。下面是对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定方法。
试剂：① 4-NP标准储存液(1Ommo1/L)。② 4-NP标准应用液(2.5mmo1/L，以0.84mol/L AMP缓冲液稀释而成)。③ 底物缓冲液(l5mmol/L 4-NPP配于0.84mol/L AMP-HCL缓冲液中，37℃,pH l0.09土0.02)。
测定方法：4-NP标准液加入量为5μL，底物缓冲液加入量为350μL，波长405nm，光径0.7cm，温度37℃，测定得吸光度为A1；另用蒸馏水代替4-NP标准液，按上述方法测定其吸光度为A2，4-NP标准液吸光度ΔA= A1- A2，若测得ΔA为0.460，则
实测4-NP摩尔吸光系数＝ ＝18662
2．校准K值 酶活性校准品经校准操作后由分析仪自动计算得出。在进行酶学测定时，如果分析条件的变化如温度、样品试剂加量和吸光度检测偏差可同等程度地影响校准物和待测样品，则使用校准品能进行补偿。一般来说以使用校准K值为好，但必须有两个先决条件：①必须使用配套的试剂；②必须使用配套的高质量的校准品，该校准品应具有溯源性。使用与该分析仪配套的酶活性校准品也可得到较好的酶活性测定结果。关于酶活性标准品，欧洲标准局（BCR）和美国国家标准技术研究院（NIST）均发表了人血清基质的酶活性标准物，但目前尚无公认的标准（校准）品问世。
（四）透射比浊法
抗原与相应的抗体结合形成的免疫复合物，在反应液中具有一定的浊度，可由一般分光光度法进行透射比浊（transmission turbidimetry）测定，可用于某些蛋白质和药物浓度等的测定。该法须做多点校准，再经非线性回归，求出抗原或抗体的含量。使用散射比浊法（scatter turbidimetry）能更加准确快速地检测抗原抗体形成浊度的大小或其速度，目前专用的特定蛋白分析仪可做此法检测。有关免疫比浊法原理详见第二章。

二、常用生化检测项目分析方法举例
1．终点法检测 常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。
2．固定时间法 苦味酸法测定肌酐采用此法。
3．连续监测法 对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。
4．透射比浊法 透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。

第三节 分析参数设置

分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改。各种测定项目的分析参数（analysis paramete）大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道，由用户自己设定分析参数。因此必须理解各参数的确切意义。

一、分析参数介绍
（一）必选分析参数
这类参数是分析仪检测的前提条件，没有这些参数无法进行检测。
1．试验名称 试验名称（test code）是指测定项目的标示符，常以项目的英文缩写来表示。
2．方法类型（也称反应模式） 方法类型（assay）有终点法、两点法、连续监测法等，根据被检物质的检测方法原理选择其中一种反应类型。
3．反应温度 一般有30℃、37℃可供选择，通常固定为37℃。
4．主波长 主波长（primary wavelength）是指定一个与被测物质反应产物的光吸收有关的波长。
5．次波长 次波长（secondary wavelength）是在使用双波长时，要指定一个与主波长、干扰物质光吸收有关的波长。
6．反应方向 反应方向（response direction）有正向反应和负向反应两种，吸光度增加为正向反应，吸光度下降为负向反应。
7．样品量 样品量（sampling volum）一般是2μl～35μl，以0.1μl步进，个别分析仪最少能达到1.6μl。可设置常量、减量和增量。
8． 第一试剂量 第一试剂量（first regengt volum）一般是20～300μl，以1μl步进。
9． 第二试剂量 第二试剂量（second regengt volum）一般也是20～300μl，以1μl步进。
10．总反应容量 总反应容量（total reacting volum）在不同的分析仪有一个不同的规定范围，一般是180～350μl，个别仪器能减少至120μl。总反应容量太少无法进行吸光度测定。
11．孵育时间 孵育时间（incubate time）在终点法是样品与试剂混匀开始至反应终点为止的时间，在两点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间。
12．延迟时间 延迟时间（delay time）在连续监测法中样品与反应试剂（第二试剂）混匀开始至连续监测期第一个吸光度选择点之间的时间。
13．连续监测时间 连续监测时间（continuous monitoring time）在延迟时间之后即开始，一般为60～120s，不少于4个吸光度检测点（3个吸光度变化值）。
14．校准液个数及浓度 校准曲线线性好并通过坐标零点的，可采用一个校准液（calibrator）；线性好但不通过坐标零点，应使用两个校准液；对于校准曲线呈非线性者，必须使用两个以上校准液。每一个校准液都要有一个合适的浓度。
15．校准K值或理论K值 通过校准得到的K值为校准K值（calibrate coefficient）或由计算得出的K值为理论K值。
16．线性范围 即方法的线性范围（linearity range），超过此范围应增加样品量或减少样品量重测。与试剂/样品比值有关。
17．小数点位数 检测结果的小数点位数（decimal point digit）。
（二）备选分析参数
这类分析参数与检测结果的准确性有关，一般来说不设置这类分析参数，分析仪也能检测出结果，但若样品中待测物浓度太高等，检测结果可能不准确。
1．样品预稀释 设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个数值，便可在分析前自动对样品进行高倍稀释。
2．底物耗尽值 底物耗尽值（substrate exhaust limit）在负反应的酶活性测定中，可设置此参数，以规定一个吸光度下降限。若低于此限时底物已太少，不足以维持零级反应而导致检测结果不准确。
3．前区检查 免疫比浊法中应用，以判断是否有抗原过剩。将终点法最后两个吸光度值的差别（ΔA）设置一个限值，如果后一点的吸光度比前一点低，表示已有抗原过剩，应稀释样品后重测。
4．试剂空白吸光度范围 超过此设定范围表示试剂已变质，应更换合格试剂。
5．试剂空白速率 连续监测法中使用，是试剂本身在监测过程中没有化学反应时的变化速率。
6．方法学补偿系数 用于校准不同分析方法间测定结果的一致性，有斜率和截距两个参数。
7．参考值范围 对超过此范围的测定结果，仪器会打印出提示。
（三）某些参数的特殊意义
1．最小样品量 最小样品量是指分析仪进样针能在规定的误差范围内吸取的最小样品量。一般分析仪的最小样品量是2μl，目前也有小至1.6μl的。在样品含高浓度代谢产物或高活性酶浓度的情况下往往需采用分析仪的最小样品量作为减量参数，从而使分析仪检测范围（与线性范围不同）的上限得以扩大。
2．最大试剂量 方法灵敏度很高而线性上限低的检测项目，如血清白蛋白的溴甲酚氯法测定，以往手工法操作时样品量10μl，试剂量4ml，这样试剂量/样品量比例（R/S）为200，线性上限则为60g/L。此法移植到分析仪上后，R/S却很难达到200，致使线性上限变低。因此对这类检测项目最大试剂量非常重要。
3．弹性速率 在酶活性测定中，当酶活性太高，在连续监测期中已不呈线性反应时，有些仪器具有弹性速率（flexrate）功能，能自动选择反应曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果，使酶活性测定的线性范围得以扩大。如AST可从1000U/L扩展至4000U/L，从而减少稀释及重测次数、降低成本。
4．试剂空白速率 当样品中存在胆红素时，胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负干扰。因为胆红素在肌酐检测的波长505nm有较高光吸收，而且胆红素在碱性环境中可被氧化转变，因而在肌酐反应过程中胆红素的光吸收呈下降趋势。若在加入第一试剂后一段时间内设置试剂空白速率，因为此段中苦味酸尚未与肌酐反应，而胆红素在第一试剂的碱性环境中已同样被氧化转变，因而以第二试剂加入后的速率变化，减去试剂空白速率变化，便可消除胆红素的负干扰，见图7-8。

二、单波长和双波长方式
（一）概念
采用一个波长检测物质的光吸收强度的方式称为单波长(mono-wavelength)方式。当反应液中含有一种组分，或在混合反应液中待测组分的吸收峰与其它共存物质的吸收波长无重叠时，可以选用。在吸光度检测中，使用一个主波长和一个次波长的称双波长方式。当反应液中存在干扰物的较大吸收、从而影响测定结果的准确性时，采用双波长方式更好。
（二）双波长的作用
双波长(di-wavelength)测定优点是①消除噪音干扰;②减少杂散光影响;③减少样品本身光吸收的干扰。从光源，到比色杯、单色器、检测器的整个光路系统中，均存在着随时间发生变化的不稳定的检测信号，即噪音，而双波长检测是同时进行的，两种波长检测产生的噪音基本上相同，因而能消除噪音干扰。当样品中存在非化学反应的干扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时，会产生非特异性的光吸收，而干扰测定结果的准确性。采用双波长方式测定可以部分消除这类干扰，提高检测的准确性。
（三）次波长的确定方法
当被测物的主波长确定之后，再选择次波长。如根据甘油三酯等干扰物吸收光谱特征，选择次波长，使干扰物在主、次波长处有尽可能相同的光吸收值，而被测物在主、次波长处的光吸收值应有较大的差异。一般来说，次波长应大于主波长100nm。以主波长与次波长吸光度差来计算结果。
（四）双波长的具体应用
对于某些反应速度快且无法设置为两点终点法的分析项目，尤其是单试剂分析中，可以利用双波长的方式来部分消除样品本身的光吸收干扰。目前用单试剂法测定的项目应用双波长的为血清总蛋白（双缩脲法）主波长500nm，次波长576nm；血清白蛋白（溴甲酚氯法）主、次波长分别为600和700nm；钙（偶氮砷Ⅲ法）主、次波长分别为 660、770nm；磷（紫外比色法）主、次波长为340、405nm，镁（二甲苯胺蓝法）主、次波长为505和 600nm。

三、单试剂和双试剂方式
反应过程中只加一次试剂称单试剂方式，加两次试剂便为双试剂方式。目前的生化分析仪大多可用双试剂方式分析，其优点是：①可提高试剂的稳定性，多数双试剂混合成单一工作试剂时，其稳定时间缩短；②能设置两点终点法，来消除来自样品本身的光吸收干扰；③在某些项目检测时能消除非特异性化学反应的干扰。如血清ALT测定，血清中的内源性丙酮酸及其它酮酸也可与试剂中的指示酶（乳酸脱氢酶）起反应，使结果偏高。若先加入缺乏α-酮戊二酸的第一试剂，使其它酮酸与指示酶反应之后再加入含有α-酮戊二酸的第二试剂，启动真正的ALT酶促反应生成丙酮酸，而丙酮酸与乳酸脱氢酶的反应消耗的NAD＋能真正反映ALT的活性，从而消除以上副反应的影响。

四、测定过程的自动监测
各种自动生化分析仪或多或少都具有对测定过程进行各种监测的功能，以便在没有人"监督"化学反应的情况下提高检测的准确性。高档分析仪的监测功能更强。
1．试剂空白监测 每种试剂都有一定的空白吸光度范围，试剂空白吸光度的改变往往提示着该试剂的变质：如利用Trinder反应为原理的检测试剂会因酚被氧化为醌而变为红色；碱性磷酸酶、γ－谷氨酰转移酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或硝基苯胺而变黄；有些试剂久置后变浑浊。这些情况均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应检测项目，其试剂在放置过程中空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降等。
试剂空白的测定方法有两种：①每瓶试剂在使用前通过对试剂空白校准来确定试剂空白吸光度，这种方式适用于先取样品后加试剂的分析仪。②每个样品测定前均检测试剂空白吸光度，适用于先加试剂后取样品的分析仪。
2．试剂空白变化速率监测 一些酶试剂在反应温度下不稳定，其空白吸光度可随着时间逐渐发生变化，这种变化的主要原因与工具酶或辅酶的纯度有关，且因试剂的组成和生产厂家的不同而不同。这种变化会影响测定结果的准确性，一般使结果偏高。如果设置此项监测，分析仪在结果计算时会自动减去试剂空白变化速率。在以监测NAD（P）H减少为指示反应的酶活性测定中，空白速率可监测并消除由NADH自身氧化所造成的吸光度下降；在色素原为底物的酶活性测定中，空白速率可监测并消除底物自身分解造成的吸光度升高。有关空白速率监测在胆红素对碱性苦味酸速率法测定肌酐负干扰消除中的作用，已如前述。
3．样品信息监测 由于样品的溶血、脂浊、黄疸会对测定结果产生非化学反应的干扰。根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性，用双波长或多波长检测其性质和程度，一般是测定样品在600nm／570nm、700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的大小来分别判断样品溶血、脂浊和黄疸程度。然后在结果计算时自动减去这部分干扰，这将有利于提高分析结果的可靠性。
4．结果可靠性监测
（1）终点监测：终点法测定要判断所选的测光点是否到达终点或平衡点。一些分析仪在所选终点后再选一个测光点，比较这两点吸光度的差异来判断反应是否到达终点。
（2）线性期监测：连续监测法选择时间－吸光度反应曲线上的线性期来计算酶活性或被测物浓度，因此仪器要确定此连续监测期是否呈线性。其监测方法为①将连续监测到的各吸光度值进行线性回归，计算出各点的方差，根据方差值的大小来判断是否呈线性；②取连续监测期开始若干点的变化速率与连续监测期最后若干点的变化速率进行比较，来判断是否为线性期。
5．底物消耗的监测 在连续监测法测定酶活性时，如果在监测期内吸光度上升或下降超过其底物耗尽值，则说明该样品酶活性非常高，底物将被耗尽，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不可靠。此时不打印结果或打印结果同时也打印出底物耗尽提示，该样品应稀释一定的倍数重新测定。此监测对于采用负反应分析酶活性的方法甚为重要。见图7-9

6．方法线性范围监测 每种待测物分析都有一个可测定的浓度或活性范围，样品结果若超过此范围，分析仪将显示测定结果超过线性范围的提示，多数分析仪会自动将样品减量或增量重新测定。

四、分析参数设置举例
以肌酸激酶的某通用试剂盒在某分析仪上使用为例，设置其反应程序中的主要参数。
1．某生化分析仪有关参数的设置范围 样品量2－35?l，第一试剂量20－270?l，第二试剂量20－270?l，总反应容量180－350?，吸光度监测周期18s，总反应时间10min，各试剂可加入时间：1.5min，4.5min，9.5min。
2．肌酸激酶试剂盒通用参数 样品量50?l，第一试剂1000?l，37℃保温5min，加第二试剂500?l，延滞时间2min在340nm读第一点吸光度，连续监测2min。
3．根据以上条件进行参数设置
（1）按比例减少样品量和各试剂量：使反应液总容量在分析仪180－350?l范围内。选择样品量为10?l，第一试剂200?l，第二试剂100?l，这时反应液总容量是310?l。或者选择样品量为8?l，第一试剂160?l，第二试剂80?l，这时反应液总容量是248?l。
（2）确定第二试剂加入时间：根据通用参数，应选择4.5min为第二试剂加入点。
（3）确定各个吸光度选择点：由于第二试剂加入时间4.5min，换算成监测周期为第16，17点之间，加上2min延滞时间，则在第24监测点为第一点吸光度，并连续选择24-31监测点。
（4）计算K值：根据样品量10?l，第一试剂200?l，第二试剂100?l，代入计算公式
则K = = = 4984
也可以采用肌酸激酶的校准品，执行校准程序来得到校准K值。
4．对新设置的反应参数进行试运行 在开始运行时，分析仪会对各反应参数之间的逻辑合法性进行检测，如果反应参数中出现逻辑性错误，则分析仪会显示错误信息并停机，这时可以根据提示信息对反应参数进行修改。

第四节 自动生化分析仪的工作过程和操作方法

一、工作过程
在测定过程中所有机械步骤均由微处理器根据已设定的程序（procedure）进行工作。
1．取样加试剂和混匀 样品盘转动，使样品进入待测位置，样品针定量吸取样品加入一反应杯；反应盘旋转；试剂转盘转动使所需试剂瓶进入试剂吸取位置，试剂针定量吸取试剂加入反应杯；搅拌机构将反应杯内液体进行搅拌混匀。此后，便按递进原理对下一样品进行采样、加试剂等同样操作。
2．保温反应和吸光度检测 反应盘旋转，反应杯内液体在恒温条件下进行化学反应，当该反应杯通过吸光度检测窗口时即被检测得到一个吸光度值；再按规定的间隔时间检测反应过程中的吸光度值直至总反应结束。总反应时间一般为10min，如果18s为检测吸光度的间隔时间（interval time），则10min得到34个吸光度值，若15s为间隔时间，则得到40个吸光度值。
分析仪能显示或/和打印反应全过程的时间－吸光度曲线，从这条曲线上，能观察和计算化学反应的速度、时间，以及反应呈线性段的时间，从而可为确定分析方法类型、参数设置等提供依据。
3．计算并显示或打印结果 分析仪根据各测光点读数对某一检测项目进行结果计算，并显示或打印出每个项目的报告，也可按标本显示或打印出全部项目的累积。即待某样品指定的项目测试完毕，便显示或打印检测结果。

二、操作方法
（一）操作前的各项检查
1．正常开机以后，检查冲洗用水装置是否正常、各项分析试剂是否充足、各种清洗剂是否足够，以及样品针、试剂针和搅拌棒是否清洁。
2．确认要进行校准的项目，确认要做的质控批号及项目，以及校准品、质控品是否足够。
3．进行光度计自检来确认光路与检测系统是否处于正常工作状态。
（二）校准
分析仪在样品分析之前都要对该分析项目进行校准（也称定标），得出一个该项目的校准系数（K）。校准前首先必须在反应程序里设定有关校准的参数，如校准液的代码、位置及浓度值等。执行校准程序，检测得到该校准品的吸光度值，再根据校准浓度计算校准系数（K=校准品浓度/校准品吸光度）。
1．校准方式 有单点校准、两点校准和多点校准，大多数检测项目的校准曲线呈直线且通过原点，用单个浓度的校准液即可，若校准曲线呈直线但不通过原点，则需用两个浓度的校准液做两点校准；当校准曲线不呈直线而为真正的曲线时，应做多点校准，并按其线形选择不同的曲线方程进行拟和，如双曲线、抛物线、幂函数、指数函数、对数函数等方程等，多数生化分析仪已设置有数种曲线方程可将多点校准的结果自动进行数据处理，得到曲线拟和方程，样品的检测吸光度便可通过此方程计算出结果。
2．对校准的要求
（1）选择合适（配套）的校准品，包括校准品数目、类型和浓度。
（2）如有可能校准品应溯源到参考方法或参考物质。
（3）确定校准的频度。根据检测项目方法和试剂的稳定性不同而确定不同的校准频度，如每日校准、每周校准、每月校准、每两月校准等，至少每六个月进行一次校准。
（4）如有下列情况发生时，必须进行校准：①改变试剂的种类，或者批号更换了。如果实验室能说明改变试剂批号并不影响结果的范围，则可以不进行校准。②仪器或者检验系统进行一次大的预防性维护或者更换了重要部件，这些都有可能影响检验性能。③质控反映出异常的趋势或偏移，或者超出了实验室规定的接受限，采取一般性纠正措施后，不能识别和纠正问题时。
（三）质控品测定
质控是保证检测结果可靠性的一个重要手段，因此每批样品的分析测定均应该有质控样品同时监测。关于分析仪的批测定，是指一批样品从开始测定到完成测定后停止的整个过程。其中如果进行了添加或更新试剂、进行了有可能改变吸光度的维护等操作，均应进行一次质控样品的检测，以便及时监测到分析系统的改变。
所有分析仪都已设定或固化了有关质控的分析程序，①设定有关质控参数，如每个质控品的批号、靶值和标准差；②选择质控图的方式，如均值－标准差质控图；③质控结果的统计分析，分析仪会保存每次测定的质控结果，并对其进行统计，以列表或质控图的形式在屏幕上显示。可根据质控结果在质控图上的位置判断其是否在控。如果判为失控则应从试剂、质控品、校准品和分析仪等几方面寻找原因。通过对质控结果的分析，也可以了解某项目的分析精密度和准确度的改变。
（四）检测项目的输入与测定
1．项目输入
（1）逐项输入：每份样品可以任选分析仪中已设置的且试剂室内已预置试剂的项目中的一项、几项或全部项目。
（2）项目组合输入：把与疾病相关的检验项目组合在一起，进行组合检验，这有利于方便病人，有利于疾病的诊断和预后分析，同时也简化了分析操作，提高分析效率。
（3）批量输入：对于有连续相同测定项目的样品，可使用批量输入的方法。
2．进行测定 多数全自动分析仪的操作非常方便，在开始测定画面，输入该批第一个样品的样品号，分析仪即会自动逐个地对样品进行测定。一般在开始画面还有选择：①是否需要对结果超过设定的线性范围、超过允许的吸光度上限等的样品自动进行重复测定；②测定结果是否需要按照已设定的打印格式自动打印与测定结果有关的选项。
3．急诊检验 几乎所有全自动生化分析仪都具备"急诊优先"的功能，仪器留有急诊样品的分析位置或专用样品架以及急诊分析的专用编号。一旦在急诊样品位置上放置了样品，并设定了急诊检验的项目，分析仪就会在常规样品的测定过程中，优先安排对该样品进行分析测定。
（五）样品的减量与预稀释方式
当样品中待测物浓度很高时，其结果往往会超过该项目的线性范围上限。此时分析仪一般会进行自动减少样品量重新测定。分析仪在结果计算时会自动按照样品量的减少比例进行计算。样品的预稀释方式是指在分析过程中仪器首先对样品做自动稀释，然后进行测定。操作过程是，首先由样品针吸取一定量样品，加入反应杯，然后反应杯旋转至加试剂位置，由试剂针吸取稀释液加入已取样品的反应杯，由搅拌针进行搅拌混匀，当再次旋转至取样位置时，由取样针在已稀释的反应杯里吸取已稀释的样品，加至另一个反应杯。前一个反应杯作为预稀释样品用，后一个反应杯将加入试剂产生化学反应用于测定。样品预稀释的优点在于，稀释过程能自动化进行，能使用到高达100倍或更高的稀释比例。但是每进行一次样品预稀释需占用3个取样周期(sampling cycle)，使分析速度减慢。
（六）分析仪的维护
分析仪的常规维护(maintenanc)是保证分析仪能够正常运行的重要手段。分析仪要严格根据操作手册的要求进行维护，一般包括每天维护、每周维护、不定期维护等几方面。
1．每天维护 ①清洗样品针，试剂针，特别是搅拌棒容易缠上纤维蛋白，是最常见的交叉污染源。②加试剂。③加清洗剂。
2．每周维护 ①执行比色杯清洗程序对比色杯进行清洗。这是由于比色杯经过反复使用后，会在比色杯内壁附有用常规方法难以彻底冲洗的物质，这些物质会引起交叉污染，通过使用专用的反应杯清洗剂能比较彻底地对这些附着物进行清洗。②对比色杯进行空白吸光度检查，以了解比色杯经过一段时间使用后透光性的改变情况，以及光路系统的情况。③对于用恒温水浴方式进行保温反应的仪器，要对恒温水槽进行清洗。
2．不定期维护 是指对一些易磨损的消耗部件进行检查与更换。①检查进样注射器是否漏水，检查各冲洗管路是否畅通，检查各机械运转部分是否工作正常。②比色杯是否需要更换。③光源灯是否需要更换。
（七）分析仪数据连网
分析仪的数据连网是指分析仪与实验室网络系统之间分析数据的互传与共享。连网的实现是通过分析仪的数据接口以及接口软件来完成，通过连网，能使来自分析仪的结果数据在网络软件的强大功能下得到进一步的处理，如报告单的格式（形式）更加为医生与患者所接受；患者的信息与对应的检验结果能长期保存；结果的分析与管理更为完善。

三、自动化分析与手工操作的比较
与手工法相比，自动化分析具有许多优点，但也存在一些缺点。
（一）优点
1．检测速度快。
2．检测灵敏度高 由于分析仪采用了高灵敏的发光二极管等检测器，使可检测的吸光度达1.0-3.0甚至以上，多数在2.5以上，且吸光度可精确到0.0001。因而在符合郎伯－比尔定律的前提下，线性上限提高 。
3．检测准确度高 分析仪能全过程检测吸光度，因而能准确地判断终点；使终点法结果准确，能做连续监测法使酶活性检测更准确，以及各种自动监测判断功能使检测结果的准确性提高。
4．检测精密度高 分析仪尤其是高档分析仪，其取样品和加试剂的精度高，人为误差小，各类偶然误差也小，使检测精密度大大提高。
5．样品和试剂用量减少 样品用量减少的主要好处是在同样采血量的前提下，可检测项目增多；试剂用量减少则大大降低了试剂成本。
6．其他 ①能精确地控制反应时间，这对于连续监测尤其重要。②能精确地控制反应温度，这对酶促反应特别重要。③能进行复杂的结果计算，如非线性计算，使非线性的检测项目如载脂蛋白能得到准确测定。
（二）缺点
1．选择次波长较困难 因分析仪无连续波长可选，因而选择合适的次波长有时很困难。
2．操作时间受限 如各检测项目加试剂时间只能统一固定在2到3个时间点，总反应时间只能固定在10min或15min等。
3．操作复杂性受限 ①加试剂的次数受限制，多数只能加1到2种试剂即单试剂法或双试剂法，因而有些检测方法无法在分析仪上测定，如改良J-G法测定血清胆红素。需加三次或以上试剂的检测项目就无法进行自动化分析。②无法做复杂的操作如检测过程中的离心、过滤、萃取、煮沸等步骤，使有些检测项目无法实现自动分析。③选择和改变反应温度困难。
4．样品量/试剂量的比例受限制 由此影响了某些检测项目的最低检测限和线性上限。
5．做参考方法受限制 由于操作复杂性受限，以及反应过程中发生的现象难以观察，不能中断操作过程做一些灵活的操作改变等，因此操作复杂的参考方法一般由手工操作。
6.仪器维护和保养较复杂。

第五节 干片式生化分析仪简介

一、仪器结构
干片式生化仪由干片(dry sheet)试剂和检测仪器两部分组成。
（一）干片试剂
所有检测项目的试剂都做成干片，成为干片试剂，干片试剂的结构从上到下一般分为展开层、试剂层、显色层和支持层，见图7-10。
（二）检测仪器
检测仪器也有半自动和全自动之分。半自动分析仪在分析过程中试剂片的选择与放入和待测样品的加入均需要由人工逐个去完成，且测定速度较慢。全自动分析仪则只要在样品盘或样品架上放好待测样品，在操作屏幕上设定好需测定的项目，由分析仪自动选取干片试剂、自动进行定量取样、孵育和检测，且测定速度较快。 二、分析原理
（一）分析过程
样品在干片试剂中各层中的反应过程如下。
1．展开层 待测样品定量加到干片试剂上，由展开层把样品均匀展开，并且阻挡固体物质如红细胞和大分子物质进入试剂层。展开层还能为反射光检测提供一个具有反射的背景。
2．试剂层 样品中的水分成为干式试剂的溶剂，试剂与待测物质进行化学反应。试剂层的结构还能控制多步化学反应的反应次序。
3．显色层 化学反应的产物在显色层与显色试剂起呈色反应。支持层为一透明胶片，仅起支撑试剂干片的作用。
4．吸光度检测 整个过程经过一个规定的时间，由反射光度计进行检测分析。光度计的单色光透过支持层、显色层、试剂层，一部分光线被吸收，另一部分光线则反射到接收器被检测。待测物浓度越高，光线被吸收越多，检测到的反射光越弱，因而待测物浓度与吸光度成正比。（图7-10）

图7-10 干式试剂测定示意图
（二）分析方法原理
测定不同待测物利用不同的方法原理。如血氨测定，氨干试剂片的有效成分是溴酚蓝（bromphenol blue）,其它成分包括表面活性剂、缓冲成分和保湿剂。氨通过半透膜进入试剂层，与指示染料溴酚蓝反应产生颜色产物，其颜色强度也即吸光度与样品中氨含量成正比，由反射光度计在605nm进行吸光度检测，与经同样检测的氨校准品进行比较，得到样品中氨的浓度。血氨测定的分析参数很简单：样品10μl，反应时间5min，波长605nm。

第六节 自动生化分析仪性能评价

生化分析仪有全自动和半自动之分。全自动分析仪将取样至出结果的全过程都自动完成。操作者只要把样品放在分析仪一定的位置上，输入要测定的项目代号，仪器就会根据分析程序自动地进行操作，并打印出测定结果。某些全自动生化分析仪不具备清洗反应杯的功能，必须将反应盘从分析仪中取出手工清洗，高档自动生化分析仪则能自动清洗反应杯，因而节省了时间，提高了效率。自动化程度越高，人力资源越节省，高档自动化仪器节约了大量的劳动力。举例来说，一台分析速度为1600测试/h的分析仪，工作4小时所完成的工作量，如果用手工操作，一般需要15到20个人工作1天。另外由于全自动化操作，并且分析仪设有完善的测定过程监测功能，因此人为主观误差因素很小，检测精密度大大提高。
半自动分析仪的工作原理为连续流动式分析，实际上叫自动比色仪可能更恰当，其流动式管道即为比色杯，因而不同样品反应液之间互染率大。其优点是结构简单，价格便宜，无不同比色杯之间的吸光性差异。缺点有：① 交叉污染较重，样品间、试剂间以及反应液之间相互影响不可避免。②每个样品检测后均需冲洗才能进行下一个测定，速度很慢。③分析过程中的某些步骤需手工完成（如加试剂、取样、混合、保温等）。这类仪器体积小，结构简单，价格低，分析仪的测定过程监测功能较为简单，也存在一定的主观误差。目前更多地用于研究性实验或教学中。
分析速度是自动生化分析仪最重要的分析性能，其次，与分析方法性能类似，生化分析仪的分析性能也包括准确度、精密度、检测范围等。

一、分析速度
在分析方法相同的情况下不同分析仪的分析速度不同，影响分析速度的有以下因素：
1．通道数量 通道(channel)数主要与分析仪所能容纳的试剂瓶数量有关，因为试剂瓶数量决定分析仪同时能测定的项目数。半自动分析仪为连续流动式，属单通道分析仪，一次只能分析一个项目，要等一个样品或一批样品相同的项目测定完毕后才能分析另一个项目，因此分析效率很低。多通道分析仪可同时任选多种测定项目检测，因此分析效率高。
2．取样周期 每加一次样品或试剂的时间为一个取样周期，取样周期决定了分析仪的工作速度。加试剂周期与取样周期相应；对于单针取样的分析仪，如取样周期为10s，理论上每60min可取样360次，则其工作速度为360测试/h；若取样周期为4.5s，则理论工作速度为800测试/h，依此类推。只有一组加试剂装置的分析仪在做双试剂法测定时，加第二试剂也要占用一个取样周期，使工作速度减半；如果有两组加试剂装置，因在另一试剂吸取位置添加第二试剂，所以工作速度不变。
3．反应杯数量 反应杯数量多，容许同时处于取样、反应检测和清洗状态的反应杯数量便多，分析效率可提高。反应杯数量多可为较短的取样周期提供条件。
4．一次能容纳的样品数量 一次同时能容纳的样品量也即批处理样品量，分析仪对每批样品进行测定的前后均有一个启动过程和停止过程，这两个过程各需要数分钟到十数分钟不等。因此，若批处理样品量大，则分析速度快。
5．试剂瓶容量 试剂瓶容量小，对检测频率高的项目（如葡萄糖、丙氨酸氨基转移酶等），可能会出现在某批样品测定中试剂不够的情况，此时需中断测定添加试剂，而使检测效率下降。正因为如此，对这类高频率出现的检测项目，有时设置两个试剂瓶位置。
6．合适的项目组合 具双圈反应盘（一般有240×2个反应杯）的分析仪有两套阵列式光电检测器，能同时对内圈和外圈的反应杯进行吸光度检测。这种系统要求有两支取样针，1个样品被两支取样针同时吸取两份样品，分别加于内外圈反应杯中，其加试剂装置为灌注式，可同时在两个反应杯中加两种不同的试剂。这个系统的测试速度更快，如果取样周期为4.5s，理论上每小时可得到1600个测试。这个系统还可配置4支取样针，1个样品被4支样品针同时吸取4份样品，放到双圈反应盘的4个反应杯中，然后同时加4种不同的试剂。这时如果取样周期为6s，则理论上每小时可得到2400个测试。
在双圈反应杯、2支取样针或4支取样针系统，一次能同时对一个样品的2个或4个检测项目吸取样品，这2个或4个检测项目便需组合在一起测定。也就是说，如果一个样品同时需要检测该2个或4个项目，则能使分析仪发挥最大的分析效率；若某一样品只需要检测该组合项目中的1项或1-3项，则该分析仪的分析效率便不能最大程度地发挥。
7．组合式自动生化分析仪 其分析速度为各分析模块分析速度的加和。如两台每小时分别为2400、800个测试的分析模块，可组合成理论上最大分析速度为每小时3200个测试的分析仪；两台同样为每小时1600个测试的分析模块，也能组合成理论上分析速度为每小时3200个测试的分析仪。

二、分析仪性能指标
自动生化分析仪的性能除分析速度外，还包括准确度、精密度、检测能力和检测成本等。分析仪生产厂家关于其分析仪的介绍资料中通常列出许多性能指标，这些指标实际上是性能的解释。
（一）准确度
吸样、加试剂、温控准确度，以及光路系统如波长、检测器准确度和波谱带宽等，都影响检测准确度，这些因素往往使相同项目的检测结果向同一方向偏离。有关这些准确度的指标通常无具体说明，但可以通过相应的实验来检测。应当说多数分析仪对有关这些部件的制作及其工作的准确度比手工操作及其所用的仪器好得多。
（二）精密度
以上影响准确度的因素同样可因其制作不精而使工作稳定性较差，造成精密度不佳，吸样精度以及样品针、试剂针、反应杯的交叉污染是影响精密度的主要因素，有关分析仪的资料中通常会介绍防止和减少交叉污染的措施，主要是其冲洗系统各有特点，冲洗效果可能不同。
（三）检测能力
1．检测方法 多数分析仪能做终点法、固定时间法、连续监测法和透射比浊法。
2．检测时间 分析仪通常可检测最长10min的反应，个别能检测15-22min甚至更长时间。3．加试剂次数 能加1-4种试剂，多数为2种。
4．检测范围 对微弱光线的检测能力即能检测吸光度的最高值，其准确度决定检测上限；检测灵敏度则为能辨别待测物最小浓度差的能力，有时与最低检出浓度一致，但后者主要取决于方法灵敏度。
（四）检测成本
反应杯类型和寿命决定其耗费，最小样品量影响试剂用量，最小反应杯液量可决定样品和试剂用量。