八虎动漫网2017:DNA测序的基本原理及准备样品时的注意事项
来源:百度文库 编辑:中财网 时间:2024/05/02 02:53:08
一、测序的基本原理:
测序的基本原理是Sanger末端终止法,在酶的作用下将原本是一条长达数百碱基的片断扩增成数百条片断,彼此间相差一个碱基。用电泳分离这些片断后,再通过测序仪将这些信号转变成峰图,从而最终形成客户所看到的测序序列和测序的峰图。
目前通用的扩增方式是通过PCR的方式进行的起源;其原理简述如下:PCR类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的"半保留复制链",而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
采用PCR的方式扩增目标片断具有以下优点:
1. 微量的样品也可进行测序反应
2. 操作简便
3. 缩短了测序样品的准备时间。
因此目前所有提供测序服务的公司都是采用PCR扩增目标片断来进行测序的。当然由于测序反应要求较普通PCR远为严格,因此在所用的酶和反应体系方面均进行了特殊处理。
二、测序的样品要求:
测序由于是要进行特殊的PCR反应的,因此对样品的要求与其他试验的要求有所不同分别简述之:
1.样品的纯度:PCR具有短时间内高效的扩增能力,因此样品的纯度对反应有至关重要的影响。当样品不纯的时候,那些杂质会对实验结果产生干扰。这在PCR产物测序中表现的尤为明显,在测序结果上表现为峰图杂乱,过多的不可识别的碱基。
2.样品的量:尽管测序反应可以高效的扩增待测得模板,使得测序所需要的模板量大大降低,但是当最低限度的模板量也不能提供的话,会引起测序反应的异常,表现为无反应,峰图弱,或者反应中断等。
3. 样品的形式:这里专指纯化的PCR产物和质粒样品。正常情况下,溶解样品时常用的溶液有以下几种形式:水,Tris溶液,TE(Tris--EDTA)三种。当采用TE为溶剂的时候由于溶液中的EDTA可以干扰测序反应的进行,因此实验人员在进行测序时需要注意样品的溶解方式。
三、不同样品的要求及简介:
1.样品的形式:从测序角度来讲最好是由实验者提供菌液的形式,由公司来提取质粒,这样可以保证DNA样品的数量和质量。如果实验者提供的是质粒或者是纯化后的PCR产物,则需要说明其浓度和溶解的方式(原因如上)
2. 不同样品的说明:
(1)PCR产物:若是PCR产物进行测序时,需要实验者同时提供PCR的双向引物各10ul(浓度>5uM/ul),这是因为PCR的引物要求与测序的引物有所不同,因此不能保证一条PCR引物就能够测成功。双向引物可以在一条引物无法测序的情况下,改用另一端的引物测序。这样一来,最好实验者告知公司一下反应的条件,以便测序公司可以及时调整测序反应。
(已纯化)浓度 > 50ng/μl、体积> 10 μl;
(未纯化)浓度 > 100ng/μl、体积> 30 μl;
引物要求:浓度>5uM、体积>10 μl
(2)质粒产物:需要提供明确的质粒名称,大小、浓度以及测序所用的引物名称,如果是自带引物测序(条件同PCR测序),最好也能够标明反应的条件。质粒的大小对于测序也有着一定的影响。样品中,质粒的总量不低于5ug。
(3)菌液:需要明确的标明所用的抗生素类型和培养条件,以便样品能够培养和扩增。
1. 微量的样品也可进行测序反应
2. 操作简便
3. 缩短了测序样品的准备时间。
二、测序的样品要求:
三、不同样品的要求及简介:
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