青蒿素的故事
<生命新知>杂志 2010年5月号
青蒿素是从中药青篙中提取的高效、速效抗疟药。作用于疟原虫红细胞内期，适用于间日疟及恶性疟，特别是抢救脑型疟均有良效。其退热时间及疟原虫转阴时间都较氯喹短,对氯喹有抗药性的疟原虫亦有效。
正面战场以外两个国家的暗战
上个世纪60年代世界风云突起，东西方冷战进而发生一系列“热战”。美国为寻求与苏联的均势介入越南战争。当时交战双方面临的最大问题不是枪林弹雨而是传染病：倒在枪林弹雨中的士兵远没有因为疟疾而失去战斗力的人数多。这一地区自古以来就是所谓“瘴气”之地，三国时期诸葛亮南征孟获、唐朝时期李宓攻打南诏、清乾隆年间数度进击缅甸都因疟疾而受挫，元史列传第四十三有云“及至未战，士卒死者十已七八”。经过如此多的战争，这里的疟原虫似乎也比其他地区的同类更为强壮，当时疗效最好的药物氯喹已经无效。寻找更好的治疗药物成为当务之急[1]。
中国为支援越南，提供了大量物资上的支持，其中就包括了抗疟疾药物的开发。1967年5月23日国家科委、解放军总后勤部在北京饭店召开了“疟疾防治药物研究工作协作会议”，由国家部委、军队直属和有关省、市、自治区的数十个单位组成了攻关协作组，协作组的常设机构也因此称为523办公室。500多名科研人员在办公室的统一部署下，从生药、中药提取物、方剂、奎宁类衍生物、新合成药、针灸等六个大方向寻求突破口。但当时中国正处于文化大革命的动乱之中，科研工作开展极端困难：工作组1967年～1969年间共筛选了4万多种抗疟疾的化合物和中草药，都没有取得进展。
有趣的是，美国当时也在积极开展抗疟疾药物的研究，他们当时的理论是抗疟疾药物必含杂环，据此测试了20万种化合物，结果都不太理想。
兵分三路，歧路多亡羊 另辟蹊径，世间本无路
当时中国本身的疟疾状况也不容乐观，所以越南战争结束后，523项目继续开展。1969年1月21日，北京的卫生部中医研究院参加523项目，屠呦呦教授任科研组长。她从系统收集整理历代医籍、本草入手，整理出一册《抗疟单验方集》，包含640多种草药，其中就有后来声名远扬的青蒿。不过，在第一轮的药物筛选和实验中，青蒿提取物对疟疾的抑制率只有68%，还不及胡椒有效果。因此，在相当长的一段时间里，青蒿并没有引起大家的重视。后来中医研究院的研究者用低温萃取的方法得到了可贵的青蒿素晶体[2]。
山东省中医药研究所的魏振兴也注意到了青蒿的抗疟功效，1970年他选取山东本土生长的黄花蒿作原料，试图提取其中的有效成分。1971年研究人员采用醋酸乙酯等作介质提取到了白色结晶物，但仍不是纯的单体，熔点不固定。直到1973年11月，山东中医药研究所的提取工艺才成熟，研究人员通过重结晶，得到了纯度达99.9%的结晶体，测得熔点为156度[3]。
第三家从事青蒿素提取工作的单位是云南省药物研究所。1972年底，云南523办公室主任傅良书从北京带回消息，说中医研究院发现青蒿的粗提取物中含有一种可能会对疟疾有效的成分。1973年新年，罗泽渊在云南大学校园里意外地发现了许多同属的苦蒿。抱着试一试的想法，她采了一大把回来，制备了不同溶剂的提取物并顺利地获得了数种结晶体。从事药效学筛选工作的黄衡惊讶地发现编号为结晶体3的化合物能彻底杀灭小鼠血片中的疟原虫。经过进一步的药效学、药理学研究，到3月底，研究组证实了3号结晶体确实具有高效、低毒抗鼠疟的特点。与此同时，苦蒿的植物标本经分类专家吴征镒鉴定，定名为菊科蒿属大头黄花蒿。因此，他们将该结晶命名为黄蒿素。这是523项目中首次得到纯的青蒿素单体。
云南省药物研究所虽然起步最晚，但进展最快，在三家单位中最早得到纯的青蒿素单体，并发现了优质青蒿产地、发明了后来广泛应用的溶剂汽油提纯法，为进行药效、毒理、药理及临床试验提供了充足的青蒿素，极大地加速了整个项目的进展。
植物鉴定 结构确认
青蒿素的英文名最初使用的是汉语拼音Qinghaosu，后因与植物属名artemisia相关而称为artemisnine（化学文摘（CA）推荐使用artemisnine），但“ine”一般作为生物碱与含氮类化合物的后缀，而青蒿素并非含氮化合物，现在常用的名称有两个，artemisnine和Qinghaosu[2]。
青蒿素，从根本来讲，是倍半萜内酯，它包括一个过氧基团、1，2，4-三惡烷结构单元，有7个手性中心，生源关系属于Amorphane，其特点是A、B环相连，异丙基与桥头氢呈反式关系。当时还没有这样的结构公布，其结构特点还造成一些检测方法无法使用。青蒿素在近紫外区无吸收，只在末端（203nm）有弱吸收，没有荧光发色团，高温易分解。所以分析方法主要是定量方法。当时一个主要难点是如何在15个碳骨架中安排5个氧原子。研究组曾经考虑过这可能是一个过氧化合物，但过氧化合物不稳定的传统概念又否定了这一想法。后来在1975年4月的成都会议上，于德泉教授报告了鹰爪素是一个过氧化合物并有抗疟活性。受到鹰爪素的启发，吴毓林在吴照华的实验室用青蒿素做了一个碘化钠的定性试验，证实了过氧基团的存在。在此基础上，吴照华又用三苯膦的方法作了过氧基团的定量分析，进一步确证了青蒿素是过氧化合物。随后根据光谱数据得出了青蒿素的片段结构，如内酯、3个甲基、4个次甲基等，并根据南斯拉夫Stefanovic从同一植物中提取的青蒿素B的结构，提出了一个初步的青蒿素结构模型。与此同时，生物物理所的梁丽收集了青蒿素的单晶X光衍射数据，并参考有机所的模型，在1975年的12月确定了青蒿素的相对构型。而青蒿素的绝对构型也于1979年由生物物理所用X光衍射分析最终确定[4]。
青蒿素的药理和药物化学
这种结构以前从未在天然化合物中发现过，也与已有的抗疟药物完全不同，完全没有含氮杂环。青蒿素神奇的抗疟作用的位点就在于过氧桥。疟原虫破坏人体的红细胞，体内含大量的铁。青蒿素能被疟原虫体内的铁所催化，其结构中的过氧键裂解，产生自由基。自由基与疟原虫蛋白发生络合，形成共价键，使疟原虫蛋白失去功能，从而导致疟原虫死亡。这是一个全新的抗疟机理，因此能有效地杀灭已经对奎宁类药物产生抗药性的疟原虫。
青蒿素这样直接应用自由基原理治疗疟疾是人们无论如何不能想到的，与大多数的药物作用方式不同，其作用机理更加接近于局部的“氧疗”。含过氧桥的化合物在以往的药物研究中从未引起过人们的注意，因为这种结构非常不稳定，暴露在空气中就会分解，更不要说进入人体发挥药效了。但青蒿素结构的神奇之处在于，它的过氧桥是被环状结构保护着，使其足够稳定地进入人体，发挥作用后又能很快地分解掉，从而减少疟原虫产生抗药性的可能性。我们不得不由衷地惊叹大自然的精妙绝伦。这也是中草药和动植物药学的独到之处。人脑的凭空想象是远不能与自然的神奇相媲美的，真实远比虚构精彩。青蒿素的研究开启了一扇神奇的大门，极大地开阔了药物研究的视野。这类化合物除了对疟疾、血吸虫等寄生虫病有效外，还有免疫抑制的作用，有望用于红斑狼疮、类风湿等病症的治疗，并且近年来在抗肿瘤方面也有了比较乐观的结果[6]。
但是，青蒿素的环状结构保护了过氧桥的稳定，却也造成青蒿素难溶于水和油，不易制成适当的剂型，使用不方便，生物利用率低。因此，在弄清楚青蒿素的分子立体结构以后，523协作组提出了新的科研课题，对青蒿素结构进行化学修饰，研制功效更好的第二代青蒿素类药物。
青蒿素的结构改造及合成研究
上海药物所在1976年就开始了改造青蒿素的工作。经过各种药理试验，李英合成了脂类、醚类、碳酸脂类三种青蒿素衍生物。它们的抗疟活性均比青蒿素高。经临床研究证实，其中的蒿甲醚不仅保持了青蒿素原有的高效、速效、低毒的特点，而且能使复发率有所降低(约8%)，在治疗抗氯奎恶性疟和凶险型疟疾方面具有确切的疗效。更重要的是它油溶性很大，可以制成针剂，对抢救危重疟疾病人非常有利，蒿甲醚于1981年通过鉴定，1995年载入国际药典，现已被世界卫生组织列为治疗凶险型疟疾的首选药，并且为日后研制的更加高效的抗疟新药——复方蒿甲醚，提供了坚实的基础。
广西桂林制药厂于1977年5月21日开始做青蒿素的结构改造。研究人员发现可以把十位羰基还原成羟基，变成还原青蒿素，在此基础上可以进一步制成酯和醚，也可以做成碳酸基青蒿素。523协作组把桂林制药厂开发的13个衍生物拿到广西医学院做药效筛选，同时在广西寄生虫研究所做临床试验。经过筛选和临床试验发现，刘旭发明的804衍生物（以其室验室命名）可解决水溶性的问题，且疗效提高5倍，这就是青蒿琥酯。
中医研究院1985年开始以还原青蒿素为基础，按一类新药评审要求，将其完善成双氢青蒿素，于1992年7月获得新药证书。双氢青蒿素抗疟疗效高于青蒿素10倍，能以口服途径给药，而且复燃率明显降低。通过临床比较，口服双氢青蒿素片杀虫速度能赶上静脉注射的青蒿琥酯，优于肌肉注射的蒿甲醚。
此外，青蒿素的衍生药物还包括WHO与美国军方合作研制的蒿乙醚和香港科技大学Haynes研制的青蒿砜等。这些虽与523项目协作组没有直接的关系，但都是在中国公开青蒿素的相关研究成果以后，以此为基础所开发的单方类青蒿素药物。
1979年，在测定结构的基础上开始了青蒿素合成的研究，1983年完成了青蒿酸经7步反应合成青蒿素的全过程。1992年Acton和Roth对此进行了改进，缩短了反应历程，共由三步组成：①用NaBH4或NiCl氢化还原；②光氧化过程；③空气氧化过程，总收率可提高到32%。而这一反应路线与植物的生物合成途径比较接近，可用来解释青蒿素在植物体内合成的可能机制，综合利用可以提高植物中青蒿素的含量[7]。同时青蒿素的全合成也在1983年完成，Schmil等首先报道以（-）-异薄勒醇为原料经13步反应完成，总产率为2.1%。青蒿素的全合成在产量上虽高于人工栽培，但合成技术要求比较高，合成步骤多，总收率不高，而半合成收率相对来说比较高，比全合成在大批量生产上有应用前景。
青蒿素环状过氧化合物这一特征是很值得探讨的，首先植物体生源合成中过氧基团是如何引进的不仅是一个基础研究的课题，而且也可能对青蒿素生产提供帮助。青蒿素的化学合成迄今还只是纯学术的课题，主要还是因为缺少高产率引入过氧基团的方法，青蒿素应该成为一种契机，不仅能够合成目前的化合物，更加有意义的是寻找到高效的引入过氧基团的方法。
青蒿素的作用机制、化学生物学研究应该也是一个有深远影响的工作，如果确证青蒿素药物的作用是碳自由基多靶点进攻疟原虫蛋白酶的话，那么是不是就可以减少或甚至消除对产生抗药性的担心；青蒿素类化合物体外有抗癌活性，但体内大多无效，如果活性也是由于形成的碳自由基，那么也有可能找到体内也能生效的方法；与此同时也可能为青蒿素找到更多的用途。生物体内生物分子间通过自由基发生的作用应该说研究得还不是很多，因此青蒿素作用机制的探索，对整个学科是大有意义的。
抗疟事业任重道远
青蒿素的发现是人类医学的里程碑。正如在科学的殿堂上不仅有“圣贤”，还有无数默默无闻的普通工作者。作为基础研究来说，青蒿素带来新的分子结构、新的制剂方法、新的作用理论和为了形成这种结构的合成手段。作为应用角度来说青蒿素为治疗疟疾、肿瘤及其他异质性的疾病提供可能性，同时青蒿素还有助于人们了解疟疾的发病、弱点和耐药性。无论在青蒿素研究的哪一个方面，研究者都会找到成功后的喜悦、征服困难的乐趣、学习新鲜事物的满足感、悬壶济世伟大情绪的宣泄渠道。
从更大范围来看，青蒿素的研制成功不仅仅是青蒿素各个团队的成功，它在各个方面都打上了“中国”烙印。中国人的思维方法、民族性格在其中得到集中的诠释。它源于中药但不是传统意义上的中药；它是团队协作的成果；数十家单位、数十年研究才确保这一治疗恶性疟疾唯一真正有效的药物的问世。
（作者：李秋实）
参考文献：
- 张剑方. 迟到的报告—— 五二三项目与青蒿素研发纪实.广州：羊城晚报出版社.2006
- 屠呦呦.青蒿及青蒿素类药物.北京：化学工业出版社,2009
- 李英，吴毓林.药物化学进展.北京：化学工业出版社,2005,433-503
- 吴毓林. 青蒿素—— 历史和现实的启示. 化学进展,2009,21(11):2365-2371
- 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志. 北京：科学出版社, 1991,76（2）：60-64
- Paul M. O'Neill. The Molecular Mechanismof Action of Artemisinin—The Debate Continues. Molecules 2010, 15,1705-1721
- J. S. Yadav. Total synthesis of (+) Artemisinin. ARKIVOC 2003(iii) :125-139
- Martin Enserink. Malaria's Drug Miracle inDanger.Science.2010,328:844-846
http://life.91sqs.com/html/zazhi/yixuelichengbei/2010/0608/1100.html
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