花色苷对THP-1细胞中ABCG1表达的影响及机制分析

沈静菲

专 业：食品科学与工程   学 号：2007214117  指导老师：张英慧

摘要：目的 研究花色苷矢车菊素-3-O-β-葡萄糖苷（Cyanidin 3-O-β-glucoside, C3G）对人巨噬细胞THP-1中ABCG1表达的影响，并分析相关作用机制。方法 以C3G干预培养诱导分化的THP-1细胞，荧光实时定量RT-PCR检测ATP binding cassette transporter G1(ABCG1)以及其直接调节因子肝脏X受体α（Liver X receptor α，LXRα）的mRNA表达，时间分辨荧光共振能量转移（Time-resolved fluorescence resonance energy transfer, TR- FRET）方法检测C3G与LXRα配体结合域的结合能力。结果 100μmol/L C3G处理THP-1细胞16 h显著增加了ABCG1 mRNA的表达 (为对照组的1.98倍，P<0.05)；尽管在TR-FRET试验中，C3G并未呈现典型的配体结合曲线，50μmol/L 和100μmol/L C3G显著增加了THP-1细胞中LXRα mRNA的表达（分别为对照组的2.21倍和2.83倍，P<0.05)。结论 C3G促进了ABCG1表达，该机制可能通过增加核受体LXRα mRNA表达来实现。

关键词：矢车菊素-3-O-β-葡萄糖苷；ABCG1；LXRα

Abstract： Objective To investigate the effects of anthocyanin Cyanidin- 3-O-β-glucoside (C3G) on ATP binding cassette transporter G1 (ABCG1) expression in the human monocyte/macrophage cell line THP-1, and to explore the mechanisms involved. Methods  The differentiated THP-1 cells were treated with C3G. mRNA expression levels of ABCG1 and its direct regulator Liver X receptor α (LXRα) were detected by real time RT-PCR. The method of time-resolved fluorescence resonance energy transfer (TR- FRET) was utilized to survey the connecting ability of C3G to LXRα ligand binding domain (LXRα-LBD). Results Treatment of 100 μmol/L C3G for 16 h significantly increased ABCG1 mRNA expression to 1.98 folds of control (P<0.05) in the differentiated THP-1 cells. Although no classical ligand binding curve of C3G was observed in TR- FRET assay, LXRα mRNA was significantly increased by 50 μmol/L and 100 μmol/L C3G treatments (2.21 and 2.83 folds of control, P<0.05). Conclusion C3G may augment ABCG1 mRNA by inducing its direct upstream regulator LXRα expression, instead of carrying out as an efficient agonist of LXRα.

Key words：Cyanidin-3-O-β-glucoside; ABCG1; LXRα

花青素（anthocyanidin）是自然界分布最广泛的水溶性植物色素之一，自然状态下常与各种单糖形成糖苷，即花色苷。花色苷是广泛存在于日常膳食中一类类黄酮化合物，常用于食品、药片着色，并有一定的抗氧化作用，近年来此类化合物因具有明显的生物活性而备受关注。其中矢车菊素-3-O-β-葡萄糖苷（Cyanidin-3-O-β-glucoside, C3G）是自然界中分布最广的花色苷，广泛存在于各种植物膳食成分中。研究表明C3G在各种炎症相关的慢性疾病如动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）的防治中发挥重要作用^[1-3]，但作用机制有待深入探讨。

AS被认为是胆固醇在动脉壁沉积而导致的炎症过程，主动脉壁中巨噬细胞的ATP binding cassette transporter G1(ABCG1)在胆固醇清除过程中发挥重要作用^[4]。ABCG1首次克隆发现于1996年，属于ABCG亚家族(包括ABCG1、ABCG2、ABCG3、ABCG4、ABCG5、ABCG6、ABCG7、ABCG8)，位于染色体21q22.3^[5]，基因上有LXR反应元件（LXR response element, LXRE）^[6]。ABCG1作为巨噬细胞中的胆固醇和磷脂转运蛋白，可以直接将胆固醇和氧化固醇转运至高密度脂蛋白（High density lipoprotein，HDL），在胆固醇逆向转运中的作用举足轻重。如果巨噬细胞中的ABCG1含量降低，胆固醇的逆向转运功能受损，细胞中胆固醇大量堆积进而转化为泡沫细胞，沉积于血管内皮下层，并伴有大量炎症因子的分泌和炎症的发生最终导致动脉粥样硬化斑块损伤^[4,7]。

有关植物多酚化合物与ABCG1关系的报道较少，Uto-Kondo等人研究发现咖啡中的酚酸阿魏酸和咖啡酸可通过增加小鼠和人巨噬细胞中ABCG1的表达而促进胆固醇的逆向转运^[8]；Sevov等报道白藜芦醇增加了人巨噬细胞ABCG1和肝脏X受体α （Liver X receptor α, LXRα)的表达^[9]。LXRα与内生配体氧化固醇相结合，激发ABCA1(另一种转运胆固醇的蛋白)和ABCG1途径，使过多的胆固醇流出细胞。

目前尚未见有关C3G影响巨噬细胞ABCG1的报道。本试验采用C3G处理分化的人巨噬细胞THP-1，通过实时定量PCR检测ABCG1表达的改变；并进一步分析其作用机制是否与C3G影响ABCG1上游调节因子LXRα表达有关，我们还利用时间分辨荧光共振能量转移（Time-resolved fluorescence resonance energy transfer, TR- FRET）技术研究了C3G是否是核受体LXRα的直接作用配体。

1 材料方法

1.1 试剂与仪器

人单核/巨噬细胞株THP-1（American Type Culture Collection），RPMI1640培养基（C22400，Gibco公司）、胎牛血清（Gibco公司），佛波酯（Phorbol myristate acetate，PMA)、二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）、LXRα的特异性激动剂GW3965（Sigma公司），逆转录酶M-MLV、Trizol、LanthaScreen? TR-FRET Liver X Receptor alpha Coactivator Assay Kit（Invitrogen公司），2×PCR Mast Mix（ABI公司），二乙基焦磷酰胺（北京鼎国生物技术公司），CO₂培养箱（Haraeus公司），PCR仪（Bio-Rad公司），实时定量PCR仪ABI Prism 7300（ABI公司），核酸蛋白检测仪（Eppendorf公司），TECAN Infinite M200 酶标仪（TECAN公司）；C3G（纯度>97%，Polyphenols Laboratories AS，挪威）粉末溶解于DMSO中制成100mmol/L的贮存液，-80℃避光保存。

1.2方法

1.2.1THP-1细胞培养及干预                        

用RPMI-1640完全培养液(含10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、25 mmol/L Hepes、100 units/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素，pH 7.2)传代培养THP-1细胞株。离心收集对数生长期的细胞，按1×10⁶个细胞/ml的密度接种于6孔细胞培养板，以100 ng/ml PMA诱导分化48 h。PBS洗3次，换成含10%(v/v) 胎牛血清的新鲜培养基培养24 h。每次试验前以无血清的RPMI-1640培养基培养12 h，使试验所用细胞处于静止状态。先以100 μmol/L C3G干预培养细胞8,16,24 h，收集细胞，提取RNA，根据检测结果选择最佳处理时间；再分别以0,10,50,100 μmol/L C3G孵育细胞至最佳处理时间，进行检测。每组设3个重复，每次试验独立重复3次。

1.2.2荧光实时定量RT-PCR检测ABCG1及LXRα的mRNA

 C3G干预培养THP-1细胞之后去掉培养液，每孔加Trizol 1 ml，按说明书步骤提取RNA，利用核酸蛋白检测仪测其在260 nm和280 nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。

ABCG1、LXRα及内参基因β-actin的mRNA扩增采用两步法进行：首先利用逆转录酶M-MLV和随机引物完成RNA的逆转录反应；合成的cDNA用无菌水稀释为4 ng/μl，按表 1 提供的引物序列进行荧光实时定量PCR反应，扩增采用20 μl体系，每个样品设4个重复。PCR 条件：50℃ 2 min →95℃，10 min，→（95℃，15 s→60℃，1 min）×40循环→95℃，15 s→60℃，20 s→95℃，15 s。用2 (-Delta Delta C (T))法分析ABCG1、LXRα mRNA的相对含量。

1.2.3 TR- FRET试验

TR-FRET方法检测C3G与LXRα配体结合域（LXRα-Ligand binding domain, LXRα-LBD）的体外结合变构能力，按LanthaScreen? TR-FRET Liver X Receptor alpha Coactivator Assay试剂盒的使用说明进行操作，简述如下：将C3G和人工合成的LXRα配体GW3965分别溶解到DMSO，配制成最大使用浓度的100倍，而后以DMSO 3倍浓度梯度稀释得到一系列等比稀释溶液，以试剂盒内的含5mM DTT的完全缓冲液将各浓度受试物（C3G或GW3965）稀释为最终使用浓度的2倍，按每孔40 μl分别加入到EP管中。对照加40 μl 2% DMSO。冰上融化带有谷胱甘肽-S-转移酶标签（glutathione-S-transferase tag, GST tag)的LXRα-LBD蛋白, 以冷的完全缓冲液稀释成最终使用浓度的4倍，轻轻颠倒混匀，每孔20 μl加入到已含40 μl 2×C3G、2×GW3965或DMSO的EP管中。用完全缓冲液将连有荧光素的转录辅因子肽链（Fluorescein- TRAP220 /DRIP-2 coactivator peptide） 和偶联铽的抗-GST抗体（LanthaScreen Tb-anti-GST antibody）配制成4×混合液，按每孔20 μl加入到上述EP管中，轻轻颠倒混匀。LXRα-LBD、fluorescein-TRAP220/DRIP-2 coactivator peptide和LanthaScreen Tb-anti-GST antibody的终浓度分别为2.5 nmol/L、10 nmol/L和250 nmol/L。

将EP管中的溶液转移至96孔黑色荧光比色板。设3个重复孔，每次试验独立重复3次。以TECAN Infinite M200酶标仪检测，设置参数如下：激发波长340 nm；发射波长（1）520 nm；发射波长（2）495 nm；延迟时间100 μs；整合时间200 μs。以C3G或GW3965测得的OD520 nm/OD495 nm 减去2% DMSO测得的OD520 nm/OD495 nm计算TR-FRET比率，通TR-FRET比率—浓度的对数作图，曲线形状反应了测试样品同LXRα的结合能力。

表1 ABCG1, LXRα 和 β-actin引物序列

Gene

Accession No.

Forward primer(5’-3’)

Reverse primer(5’-3’)

ABCG1

NM_207627.1

ACTCTTCGAGCTGTTCGACCAG

GCAGTTCAGACCCAAATCCCT

LXRα

NM_005693

TCGAGGTGATGCTTCTGGAGA

TTTGGCAAAGTCTTCCCGG

β-actin

NM_001101.2

GGACATCCGCAAAGACCTGTA

GCTCAGGAGGAGCAATGATCT

1.2.4 数据处理及统计分析

采用SPSS13.0软件包建立数据库，并进行统计分析。结果以 ±s表示。多组均数进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，各组间的两两比较采用Tukey’s honestly法。显著性水准为P<0.05。

2 结果与分析

2.1不同THP-1细胞生长及分化状态

传代培养的THP-1细胞生长状况见图1A，细胞呈球形悬浮于培养液中，多聚集成团，分裂旺盛；THP-1细胞经PMA诱导分化48 h后，大部分开始贴壁生长并伸出伪足，形状逐渐不规则，见图1B。

图1 THP-1 细胞分化前（A)和分化后(B)

2.2 C3G对ABCG1 mRNA表达的影响

图2 C3G 对ABCG1 mRNA 表达的影响

分化的THP-1细胞经100 μmol/L C3G分别孵育8,16,24h后ABCG1 mRNA表达逐渐增加，其中16 h为最佳处理时间（图2A）。在此基础上，选择不同浓度的C3G （10,50,100 μmol/L）干预分化的THP-1细胞 16 h，ABCG1 mRNA表达水平随C3G浓度增加而升高（图2B），其中100 μmol/L C3G处理组为对照组（0 μmol/L C3G）的1.98倍，差异显著 (P<0.05)。

2.3 C3G对LXRα mRNA表达的影响

LXRα是ABCG1转录的直接调节因子，LXRα表达或活性的升高可增加ABCG1 水平。为了进一步探讨C3G影响ABCG1 mRNA表达的作用机制，我们检测了THP-1细胞中LXRα mRNA的表达，发现C3G处理THP-1细胞16h后，显著提高了LXRα mRNA水平，并呈现明显的浓度相关性（图3），50μmol/L和100 μmol/L C3G干预组中LXRα mRNA的表达分别为对照组的2.21倍和2.83倍（P<0.05）。

图4 GW3965 和C3G 分别诱导SRC-1多肽与 LXRα 配体结合域结合的能力

图 3 C3G 对 LXRα mRNA 表达的影响

2.4 C3G与LXRα配体结合域的体外结合能力检测

本试验中人工合成的LXRα激动剂GW3965在1.69～11 111.11 nmol/L范围内随浓度增加而增强了荧光能量转移的能力（TR-FRET比率），以TR-FRET比率—浓度的对数作图，GW3965处理呈现了典型的配体结合的S型曲线，半效应浓度EC₅₀约为250 nmol/L（图4）；需要说明的是当GW3965浓度超过11 111.11 nmol/L时，由于溶解度的影响造成了TR-FRET比率下降（数据未列出）。C3G在1.69 nmol/L-100 000 nmol/L范围内保持良好的溶解性，但未随浓度的改变而显著增加荧光能量转移，亦未呈现激动剂特有的TR-FRET比率—浓度对数S型曲线（图4）。

3 讨论

巨噬细胞抵御胆固醇毒害作用的第一道防线是细胞内过多胆固醇经酶催化反应成为胆固醇酯，疏水的胆固醇酯储存在细胞质的脂小滴，堆积的胆固醇酯导致泡沫细胞的形成。所以减少泡沫细胞的胆固醇酯是改善动脉粥样硬化所必需的。ABCG1被推测是增加胆固醇与质膜上的不同受体的结合能力，使胆固醇被酯化。巨噬细胞抵御胆固醇毒害作用的第二道防线是胆固醇的流出，胆固醇从巨噬细胞、泡沫细胞、或动脉粥样硬化斑块流出被转运至低脂载脂蛋白（lipid-poor apoA-I）和成熟高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL），HDL-C(HDL cholesterol)经肝脏HDL受体运送到肝脏代谢，前者由ABCA1介导，后者主要是由ABCG1推动发生，最后胆固醇以胆汁盐或乳糜状胆固醇排出，这就是胆固醇逆向转运（reverse cholesterol transport，RCT）。巨噬细胞的RCT过程对动脉粥样硬化好转起着至关重要的作用。

本研究发现花色苷C3G可以提高ABCG1 mRNA的表达。近期的报道认为巨噬细胞中的ABCG1不但介导细胞内胆固醇的逆向转运，还可通过增加HDL而提升中和炎症激活剂脂多糖的能力，进一步抑制了炎症因子和趋化因子的表达^[7]。小鼠ABCG1和ABCA1双缺失导致的炎症还发生在心肌、肺、肝脏、脾以及胸腺等器官^[10-13]。炎症和脂质代谢紊乱与AS、肥胖、糖尿病、癌症等多数慢性病的发生发展都相关，ABCG1可将二者联系在一起。文献报道C3G在炎症相关的慢性疾病防治方面效果显著^[14]，近年来有多篇关于其作用机制的报道^[15-17]，C3G与ABCG1的相关性是否是C3G抑制AS和炎症相关疾病的补充机制有待研究。

ABCG1的表达受LXRα直接调控。核受体LXRα表达增加或者被特异性配体激活后可增加巨噬泡沫细胞中ABCG1的表达，促进胆固醇流出并转移至HDL，后者通过肝细胞上的受体进入肝脏代谢，促进胆固醇排出体外^{[4, 6]}。Xia报道C3G增加了小鼠腹腔巨噬细胞中LXRα及其下游基因ABCA1的表达，并促进了胆固醇逆向转运^[18]，Wang Q之前也有研究了C3G对人巨噬细胞中LXRα表达的影响^[19]。本试验中LXRα mRNA的表达随C3G干预浓度的增大而提高，与前期研究的结果相一致。Sevov等在对另一种多酚化合物白藜芦醇的研究中发现，白藜芦醇上调ABCG1的表达与其增加LXRα mRNA有关，并且白藜芦醇提高了LXRα基因启动子上RNA聚合酶Ⅱ的募集。他们推测白藜芦醇通过抑制mitogen-activated protein kinase (MAPK) 信号转导，进而改变转录辅因子的磷酸化，促进RNA聚合酶Ⅱ在启动子上的募集而增加LXRα mRNA的表达，提升其总转录活性^[9]，C3G是否也存在类似的作用机制值得探究。

前期的转染试验表明C3G处理的巨噬细胞中LXRα总转录活性显著提高^{[18, 19]}，但C3G是否可以直接与LXRα结合而发挥激动剂的作用，尚不明确。本试验采用TR-FRET技术，应用LanthaScreen^TMTR-FRET Liver X Receptor alpha Coactivator Assay 试剂盒来检验C3G是否是LXRα的直接配体。在TR-FRET试验中，铽标记的抗GST抗体通过结合在核受体蛋白上的GST标签而对核受体进行非直接标记。受试物如果为核受体的激动剂，会与核受体结合引起构象改变，构象的改变增加了核受体对转录辅因子Steroid receptor coactivator -1 (SRC -1)肽的亲和力，荧光素标记的SRC-1肽与铽标记的抗体相互接近到一定距离就会发生荧光能量转移，产生TR-FRET信号。试剂盒中的LXRα-LBD蛋白与LXRα的配体或激动剂结合后会发生构象改变，新构象对荧光基团标记的共激活因子SRC-1^[20] 多肽（TR-FRET受体）具有更高亲和能力。以铽标记的抗GST抗体（TR-FRET供体）通过抗原-抗体反应结合在LXRα-LBD蛋白上以后，与TR-FRET受体接近至可以发生能量转移的距离范围。铽螯合物在340nm波长的光子激发下，发射495nm的荧光，该波长的荧光可以继续激发邻近的共激活因子SRC-1多肽上标记的Fluorescein，使其发出520nm的荧光。两个波长的荧光强度(Fluorescence Intensity , FI)，FI520nm /FI495nm比率反映了受试物结合LBD并引起构象改变，从而募集SRC-1的能力，这两方面也就是核受体配体/激动剂的基本功能。若受试物不是LXRα的激动剂， 不能与LBD特异结合，Fluorescein标记的共激活因子多肽就无法结合到LBD蛋白上，TR-FRET供体和受体距离较远，荧光共振能量转移不能发生。操作中需要注意的是，检测延迟100微秒可避免系统中其它自发荧光物质或沉淀物散射的干扰。试验结果显示, C3G与LXRα的人工合成激动剂GW3965不同，未能促进LXRα-LBD蛋白介导的荧光共振能量转移，提示C3G不是LXRα直接有效的激动剂。

本研究推测C3G可能通过增加 LXRα mRNA的表达等方式，而不是作为LXRα激动剂来促进人巨噬细胞中ABCG1表达的增加，为进一步探讨C3G促进胆固醇逆向转运和改善动脉粥样硬化等炎症相关慢性疾病的作用机制提供了依据。

4 小结

   100 μmol/L C3G处理THP-1细胞16 h显著增加了ABCG1 mRNA的表达。在TR-FRET试验中，C3G与LXRα-LBD结合并未呈现典型的配体结合曲线，50 μmol/L 和100 μmol/L C3G显著增加了THP-1细胞中LXRα mRNA的表达。C3G促进了ABCG1表达，该机制可能通过增加核受体LXRα mRNA表达来实现。

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