荒原第二季百度云资源:感受太 步骤与原理
来源:百度文库 编辑:中财网 时间:2024/05/04 05:06:09
实验步骤
实验原理
1 挑取一个JM109单菌落于3ml LB(无抗生素)培养基中,37℃,180rpm培养过夜。 让菌复苏,进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。
2 取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB(无抗生素)培养基中,37℃250rpm大约2.5小时)。 减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数,以减少菌的变异。
3 取培养物置于40mL的灭菌离心管中,冰浴10min,4000rpm 4℃离心10min,弃上清。(将所有上清倒光,可以将离心管倒过来) 使细菌的生长停止,代谢减慢。因为这时已经没有培养基了,如果细菌仍有很高的代谢效率,则有大量细菌死亡。
4 菌体重悬于10mL 100mmol/L冰冷CaCl2 中,轻吹,4℃ 30min,4000rpm离心5min弃上清。 生物秀实验频道
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细菌处于00C,CaCl2 低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面(羟基来源于细胞壁上的糖,磷酸来源于DNA ),经短时间420C热激处理,促进细胞吸收DNA复合物。(一定要轻吹,这时细胞壁打开,十分脆弱)
5 菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl2 中,轻吹,用于转化。 除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂,以致大量细胞死亡。(一定要轻吹,这时细胞壁打开,十分脆弱)
6 取感受态细胞100uL,加入2uLpET-21a质粒,冰浴30 min受体菌:感受态细胞100uL,加入2 uL无菌双蒸水阴性对照:0.1mol/LCaCl2溶液100uL,加入2 uL阴性对照 第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性;第二个阴性对照是为了验证CaCl2 溶液和pET-21a质粒未被污染。 冰浴是为了降低细胞代谢率,防止细胞大量死亡。
7 热激 42oC,90s 在低温处理后,热激,可以使细胞壁热胀冷缩,再低温,使细胞壁上黏附的质粒进入细胞体内。
8 冰浴2 min
9 加入800 uL 无抗生素的 LB,37℃复苏1h 用LB复苏细胞,使细胞恢复活力,从而使细胞中的质粒表达抗抗生素的基因,只有这样才能使转化成功的细菌在有抗生素的LB平板上生长。
10 取100ul细胞直接在含50ug/mL Carbenicillin(羧苄西林)的LB培养基上铺平板,将平皿放置37 oC温箱30min至液体被吸收。倒置平皿37 oC培养过夜,出现菌落。 这些菌落为转化成功的菌落,而对照组应该没有菌落。在目的菌落的旁边有可能出现卫星菌落,这是因为亩的菌落的抗性基因似的菌落周围的抗生素失效,长出了转化为成功的菌落。用羧苄西林因其对酸稳定、不易被细菌降解,所以可以降低卫星菌落的数量。 因为抗生素高温易失活,所以应等到LB600C时(热而不烫),加入抗生素。
实验原理
1 挑取一个JM109单菌落于3ml LB(无抗生素)培养基中,37℃,180rpm培养过夜。 让菌复苏,进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。
2 取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB(无抗生素)培养基中,37℃250rpm大约2.5小时)。 减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数,以减少菌的变异。
3 取培养物置于40mL的灭菌离心管中,冰浴10min,4000rpm 4℃离心10min,弃上清。(将所有上清倒光,可以将离心管倒过来) 使细菌的生长停止,代谢减慢。因为这时已经没有培养基了,如果细菌仍有很高的代谢效率,则有大量细菌死亡。
4 菌体重悬于10mL 100mmol/L冰冷CaCl2 中,轻吹,4℃ 30min,4000rpm离心5min弃上清。 生物秀实验频道
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细菌处于00C,CaCl2 低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面(羟基来源于细胞壁上的糖,磷酸来源于DNA ),经短时间420C热激处理,促进细胞吸收DNA复合物。(一定要轻吹,这时细胞壁打开,十分脆弱)
5 菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl2 中,轻吹,用于转化。 除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂,以致大量细胞死亡。(一定要轻吹,这时细胞壁打开,十分脆弱)
6 取感受态细胞100uL,加入2uLpET-21a质粒,冰浴30 min受体菌:感受态细胞100uL,加入2 uL无菌双蒸水阴性对照:0.1mol/LCaCl2溶液100uL,加入2 uL阴性对照 第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性;第二个阴性对照是为了验证CaCl2 溶液和pET-21a质粒未被污染。 冰浴是为了降低细胞代谢率,防止细胞大量死亡。
7 热激 42oC,90s 在低温处理后,热激,可以使细胞壁热胀冷缩,再低温,使细胞壁上黏附的质粒进入细胞体内。
8 冰浴2 min
9 加入800 uL 无抗生素的 LB,37℃复苏1h 用LB复苏细胞,使细胞恢复活力,从而使细胞中的质粒表达抗抗生素的基因,只有这样才能使转化成功的细菌在有抗生素的LB平板上生长。
10 取100ul细胞直接在含50ug/mL Carbenicillin(羧苄西林)的LB培养基上铺平板,将平皿放置37 oC温箱30min至液体被吸收。倒置平皿37 oC培养过夜,出现菌落。 这些菌落为转化成功的菌落,而对照组应该没有菌落。在目的菌落的旁边有可能出现卫星菌落,这是因为亩的菌落的抗性基因似的菌落周围的抗生素失效,长出了转化为成功的菌落。用羧苄西林因其对酸稳定、不易被细菌降解,所以可以降低卫星菌落的数量。 因为抗生素高温易失活,所以应等到LB600C时(热而不烫),加入抗生素。
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