检测物理农业技术处理下的土壤微生物方法

土壤微生物检测方法

物理农业中的核心技术之一“土壤连作障碍电处理机”依赖的基础研究内容涉及到土壤微生物、根结线虫、氧化还原电位等的检测，其实验室检测与实际生产的取样检测相结合，并采取动态监测方式，测定土壤微生物的发展动态和优势种群，进而确定最佳的电处理的程序。

土壤微生物计数法

土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库，所含微生物不仅数量巨大，而且各类繁多，主要包括细菌、真菌和放线菌三大类，是土壤最活跃的成分。土壤微生物数量测定方法可分为三大类：一类是根据在培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物的数量，统称为培养计数法，主要有稀释平板法和最大或然计数法；二类是将土壤微生物染色后，在显微镜下观察计数，称为直接镜检法，包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法等；三类是直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定，主要有离心分离法。

1.1培养计数法

1.1.1概要

在自然条件下，土壤中的大多数微生物处于休眠状态，一旦供给可利用的碳源（如培养基），一些微生物将快速生长繁殖。因此，根据在培养基上所生长的微生物数量，可以估算土壤中微生物的数量。这种土壤微生物数量测定方法称为培养计数法，主要包括稀释平板计数法（简称稀释平板法）和最大或然计数法。

稀释平板计数法的基本原理：土壤微生物经分散处理成为单个细胞后，在特殊的培养基上生长并形成一个菌落，根据形成的菌落数来计算微生物的数量。

最大或然计数法的基本原理：假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并在试管或平板上全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或很少出现微生物菌落。根据没有出现菌落的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度，再用最大或然计数法计算出样品中微生物的数量。

1.1.2稀释平板法

一、试剂配制

常用的培养基各类很多，可根据需要测定的微生物种类选择培养基。按配方配制培养基后，先在121℃下灭菌15min，冷却至45～50℃使用。凝固后的培养基可加热溶解后使用。

二、仪器设备

广口瓶或三角瓶及配套的橡皮塞，移液管（1ml、10ml，吸口用棉花塞住后用牛皮纸包好灭菌）培养皿（9㎝，用牛皮纸包好后灭菌）和显微镜等。

三、操作步骤

（1）土壤系列稀释液制备

取新鲜土壤（＜2㎜）10.00g，放入经灭菌的装有70ml水的广口瓶中，塞上经灭菌的橡皮塞，在振荡机上振荡10min，此为10^-1土壤稀释液。迅速用灭菌的移液管吸取10^-1土壤稀释液10ml，放入灭菌的装有90ml水的广口瓶中，塞上橡皮塞，混合均匀，此为10^-2土壤稀释液。再如此依次配制10^-3、10^-4、10^-5和10^-6系列土壤稀释液。上述操作均在无菌条件下进行，以避免污染。

（2）平板制备和培养

从两个稀释倍数的土壤稀释液中（细菌和放线菌通常用10^-5和10^-6土壤稀释液，真菌用10^-2和10^-3稀释液）吸取1.00ml（吸前摇匀），分别放入五套培养皿中（注意每变换一次浓度，须更换一支移液管）；再向培养皿内注入45～50℃的培养基10ml，立即混合均匀，静置凝固后，倒置放于培养箱中培养。细菌和放线菌在28℃下培养7～10d，真菌在25℃下培养3～5d。

（3）镜检计数

尽管使用不同的培养基，但细菌、放线菌和真菌都可能在同一个培养基上生长，所以必须用显微镜做进一步的观察。明显有菌丝的一般是真菌，真菌的菌丝为丝状分枝，比较粗大；而放线菌菌丝呈放射状，比较细。细菌有球状和杆状，有些细菌也形成细小的菌丝。酵母菌的菌落与细菌的菌落很相似，但在显微镜下容易分辨。酵母菌个体比较大，一般有圆形、椭圆形、卵形、柠檬形或黄瓜形，有些还有瘤状的芽。

在两级稀释度中，选细菌和放线菌的菌落数为30～200个、真菌菌落数为20～40个的培养皿各5个，取其平均值计算出每组的菌落数。如果菌落很多，可将其分成2～4等份进行计数。微生物生物量可以通过微生物细胞个体大小和密度计算得到。

（4）计算

土壤微生物数量（cfu·g^-1）=MD/W

式中M为菌落平均数：D为稀释倍数；W为土壤烘干质量（g）。

1.1.3最大或然计数法（MPN）

一、试剂配制

培养基配制与稀释平板法基本相同，采用试管培养时，培养基中不需加琼脂。

二、食品设备

试管（2㎝×18㎝），其他同稀释平板法。

三、操作步骤

（1）土壤系列稀释液中制备

按稀释平板法制备土壤系列稀释液，一般配制10^-1～10^-6的稀释液。

（2）接种和培养

从上述土壤系列稀释液中各取1ml接种到平板培养基或试管液体培养基中，每个稀释度重复3～5次，同时设置空白对照，以检验是否被污染。因微生物类型和生长速度不同，所要求的稀释倍数、培养基和培养时间都有差别(表1-1)。根据微生物类型分别在28～30℃培养7～30d。培养结束时，记录出现菌落的平板数量或出现特征反应的试管数。

表1-1  几种主要土壤微生物生理群MPN计数方法

   （3）计算

通常将有微生物生长的最后3个稀释度中出现微生物菌落的平板数作为微生物生长指标，从最大或然数表中查出最大或然数近似值，按下列公式计算样品中的微生物数量：

土壤微生物数量（cfu·g^-1）=MD/W

式中M为最大或然数近似值；D为全部出现菌落的最高稀释倍数；W为土壤烘干质量（g）。

例如，某土壤系列稀释液1ml接种到5个平板，经培养后，10^-3～10^-5的稀释液全部出现菌落；接种10^-6稀释液的5个平板只有4个出现菌落；接种10^-7稀释液的只有1个出现菌落；接种10^-8稀释液的全部没有菌落。由此得到土壤的微生物生长指标为541，查最大或然数表（见附录三，表三）得到其最大或然数近似值为17，乘以第一位数的稀释倍数10⁵，再除以土壤烘干质量即可得到土壤微生物数量。

微生物生长的数量指标都应当是三位数。但是不管重复数多少，第一位数字如重复数相等，即代表全部重复都出现菌落的最高稀释倍数的数值。后两位数字依次是以下两个稀释度出现菌落的平板数量。如果以下稀释液还出现了微生物菌落，则将其出现微生物菌落的重复数加到第三位数上。例如，10^-3～10^-8系列稀释液（4个重复）出现菌落的平板数分别为4，4，3，2，1和0.这里10^-7稀释液出现菌落的平板数为1，将其加到前一稀释液（10^-6）的平板数上，即得该土壤的微生物生长指标为433，查表得最大或然数近似值为30，计算得到每克土壤（新鲜重）的微生物数量为3.0×10⁵。

应注意：如果出现微生物生长的稀释度比没有出现微生物生长的稀释倍数低，则说明微生物在稀释液中不是均匀分布的，在这种情况下就需要对实验方案进行核查。

1.1.4方法评论

最初研究土壤微生物的方法是培养计数法，该方法的优点在于可测定土壤中可培养的、不同类型的微生物数量，包括细菌、真菌和放线菌，特别是可用于测定可培养的、具有特殊功能的微生物种群，如氨化细菌、硝化细菌、反硝化细菌、解磷菌和固氮菌等。该方法存在的问题是，仅能测定在培养基上迅速生长繁殖，并能够形成菌落或有某种特征的土壤微生物种群，而大部分土壤微生物种群不能在培养基上生长。另外，在培养基上所形成的菌落可能来自多个细胞，也有可能由菌丝（或多个细胞）发育成菌落。因此，培养计数法所测定的微生物数量，通常不到土壤中微生物实际数量的1%，故不能作为土壤微生物的真实数量。此外，该方法即使用于测定土壤中可培养的微生物数量，测定结果的精确度和重复性较差。

1.2直接镜检计数法

1.2.1概要

由于土壤微生物的特性和培养基的局限性，通过在培养基上生长的菌落数量来间接地计算土壤微生物数量，一般只能测量出土壤中很少的一部分微生物。因此，一些研究者提出了直接镜检计数法，主要包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法。使用一般的染色剂进行涂片染色，镜检时很难区别死的微生物细胞和土壤颗粒，这里仅介绍FDA染色涂片测定活菌丝数和FITC染色测定活细菌数的方法。

涂片法的基本原理：将一定量的土壤悬浮液涂抹在载玻片上，风干染色后进行镜检计数，从而计算出单位质量土壤的微生物数量。由于使用特别的染色剂可着色活细胞，从而可测定土壤活体微生物数量。

琼脂薄片法的基本原理：在制备土壤悬浮液时加入一定量琼脂，在进行土壤分散的同时进行加热，取一定量的土壤-琼脂悬浮液制成琼脂薄片，染色后进行镜检计数，再计算出单位质量土壤的微生物数量。

膜过滤的基本原理：将土壤悬浮液用无菌水稀释，取一定量的稀释液染色后，用微孔膜过滤，对微孔膜上的微生物进行镜检计数，再计算出单位质量土壤的微生物数量。

1.2.2 FDA染色涂片法测定活菌丝数

一、试剂配制

磷酸盐缓冲液（0.06mol·L^-1）：8.28 g  溶于1L去离子水，10.68g  溶于1L去离子水；将两种溶液按28﹕72的比例混合，调节pH值使其与土壤pH值大致相同。

FDA染色液：

琼脂溶液（1.5%）：1.5g琼脂溶于100ml磷酸盐缓冲液中（pH7.6）。

二、仪器设备

三角瓶（200ml），试管（15ml），振荡机，载玻片（图1-1），盖玻片，荧光显微镜等。

图1-1 染色-镜检法涂片

外圆面积1cm²，半径5.64㎜，内圆半径3.64㎜，镜检必须在外圆边缘约1.7㎜以内的区域进行

三、操作步骤

（1）土壤分散

取10.00g新鲜土壤（＜2㎜）于200ml三角瓶中，加入95 ml 0.06 mol·L^-1磷酸盐缓冲溶液，充分振荡15 min。

（2）染色

取1 ml 土壤悬浮液于15 ml的试管中，加入4 ml 磷酸盐缓冲溶液，再加入1 ml FDA染色液。室温下培养3 min 后，加入1 ml 琼脂溶液，混匀。

（3）涂片和镜检

取0.1 ml 上述土壤-染色液-琼脂混合液均匀地涂于如图1-1所求的载玻片上，盖上盖玻片，迅速用荧光显微镜进行镜检计数。镜检计数方法见下文的琼脂薄片法。

（4）计算

土壤活菌丝的生物体积及生物量碳计算方法同琼脂薄片法。

1.2.3  FITC染色涂片法测定活细菌数

一、试剂配制

Tris-盐酸溶液I ：6.35 g 三羟基氨基甲烷溶于800 ml 去离子水，用浓盐酸调节pH值至7.5，定溶至 1 L。

Tris-盐酸溶液II ：25.4 g 三羟基氨基甲烷溶于800 ml 去离子水，用浓盐酸调节pH值至7.5，定溶至 1 L。

INT溶液：2 g 氯化2-（p-碘苯基-3-p-硝基苯 ）-5-苯四氮唑溶于1 L Tris-盐酸溶液II中。

NADH-NADPH混合溶液：0.4 g NADH和0.4 g NADPH溶于100 ml Tris-盐酸溶液II中。

FITC染色液：

碳酸盐-重碳酸盐缓冲液（0.5 mol·L^-1）：42 g 溶于1 L去离子水；53 g 溶于1 L 去离子水。吸取80 ml 和100 ml 溶液混合，加去离子水500 ml并调节pH值至9.6，定容至1 L。

焦磷酸钠溶液（5%， ）：8.39 g 焦磷酸钠（）溶于100 ml去离子水。

碳酸钠溶液 ：10.6 g 碳酸钠溶于100 ml去离子水。

甘油溶液：量取45 ml 甘油于5 ml 1 mol·L^-1碳酸钠溶液中，摇匀。

磷酸盐缓冲液（0.01 mol·L^-1,pH 7.2）：1.38 g 溶于1 L去离子水中，1.78 g 溶于1 L去离子水，将两种溶液按28﹕72的比例混合。

氯化钠溶液 ：8.77 g 氯化钠溶于1 L去离子水。

甲醛溶液：20 ml 甲醛溶于80 ml去离子水。

二、仪器设备

烧杯（100 ml），搅拌机，闪烁计数瓶，超声波水浴器，载玻片（图1-1），盖玻片，荧光显微镜等。

三、操作步骤

（1）土壤分散

取1.00 g 新鲜土壤（＜2㎜）于100 ml烧杯中，加入20 ml Tris-盐酸溶液I，用搅拌机低速搅拌1 min。

（2）培养

取2.0 ml上述土壤悬浮液于闪烁计数瓶中，加入1 ml INT溶液，再加入1 ml NADHNADPH混合溶液，在25℃的黑暗条件下培养4 h。再加入1 ml 20%甲醛水溶液，4℃过夜。

（3）涂片和染色

将上述装有经培养的土壤悬浮液的闪烁计数瓶置于超声波水溶器中，低能量（输出功率50W）超声波处理2 min，加入琼脂使其浓度达到0.01%（ V/V）。取0.01 ml混合液均匀地涂沫于如图1-1所示的载玻片上（使用前用稀酸洗涤），于酒精灯上加热干燥后用FITC染色液染色3 min。染色后置于0.5 mol·L^-1碳酸盐-重碳酸盐缓冲液中浸泡10 min，再转入5%焦磷酸钠溶液中浸泡2 min，取出用去离子水轻轻冲洗。

（4）镜检

洗涤后染色片干燥后，加一滴甘油溶液，盖上盖玻片固定，用荧光显微镜进行镜进行镜检计数，具体方法参见琼脂薄片法。

（5）计算

土壤活细菌的生物体积和生物量碳的计算方法参见琼脂薄片法。

1.2.4琼脂薄片法

一、试剂配制

琼脂-Decon 90溶液：1g琼脂溶于100ml无菌水（过0.20um滤膜），加热溶解，再与20ml Decon 90稀释液（12ml Decon 90于100ml无菌水）混合均匀。

台酚蓝溶液：5g 苯酚溶于100 ml无菌水，1g台酚蓝溶于100 ml无菌水；按照15﹕1的比例混合；再按4﹕1与冰醋酸混合，用0.2um膜过滤。

二、仪器设备

可控温超声波水浴清洗机（300 Ultrasonik NEY），可调慢速搅拌机（1.5V，0～2000rev·min^-1，Kanke and Kunkel EKA-labortechnik），显微镜，显相器（Camera lucida），血球计数板（图1-2），盖玻片（厚0.47㎜），加拿大香脂（Canada Balsam）。

图1-2   血球计数板（改进型）

    三、操作步骤

（1）土壤分散

取1.00～2.00g（根据土壤微生物含量而定）＜2㎜的新鲜土壤于100 ml塑料杯中，加入60 ml 60℃的琼脂-Decon 90混合溶液。将塑料杯置于超声波清洗机水槽中（土壤琼脂混合溶液的液面要低于水面），最大功率处理15 min。在超声波处理过程中，保持水浴60℃，并不断慢速搅拌土壤琼脂悬浮液。处理结束后仍继续搅拌土壤悬浮液，直到取样前30 s停止。取样必须在10 min内完成。

（2）琼脂薄片制备

将吸管（内径1㎜）插入土壤-琼脂悬浮液液面下1㎝处，吸取约0.02 ml悬浮液，迅速放入血球计数板上，立即盖上盖玻片（厚0.47㎜），冷却凝固后一起放入去离子水（用前经0.2 滤膜过滤）中，使琼脂薄片分离。每个样品至少做4个琼脂薄片，即4次重复。

（3）染色

将琼脂薄片放到普通玻片上，干燥后浸泡在台酚蓝溶液中。1h后先用无菌水冲洗，再用95%酒精脱水。在琼脂薄片上加一滴加拿大香脂，盖上普通的盖玻片，即得琼脂薄片，可永久保存。

（4）镜检

将琼脂薄片置于显微镜下，在目镜上放入New Porton G12分格计数板，根据表1-2进行镜检。仅对被染为深蓝色的球形和圆柱形微生物计数，形状不规则（如破裂开）和其他颜色（如黄色、紫红色）的物体均不计数。

球形微生物分为11级（表1-2），直径在0.34～0.97 的为第1组，计数面积为2.0×10² （相应于New Porton G12分格玻璃片左上角的两个方格）。直径在0.97～3.13 的为第2组，计数面积为2.1×10³ （相应于New Porton G12分格玻璃片的全部方格），第1组和第2组在油镜下镜检。直径在3.13～16.00 的为第3组，在500倍下镜检，计数面积为3.7×10⁴ （相应于目镜分格玻璃片的A方格面积）。圆柱形微生物可分为8级，均在500倍下进行镜检，计数面积同球形微生物的第3组。圆柱形微生物的直径用New Porton G12分格玻璃片直接测量，而长度则通过显相器直接描绘在A4纸上，再用测绘轮测定其长度，也可用其他的方法如网格交叉的方法来测定。每一组必须在不同部位镜检20次。如果20次所测定的微生物个数低于40，则必须加测20次。

表1-2  直接显微镜检的视野和放大倍数

（5）计算

根据镜检所测定的微生物数量及所计数的面积计算微生物生物体积，再按其密度（1.1g· ）、干物质含量（25%）和含碳量（47%）估计微生物生物量碳。