快乐隽实营销策划:引物设计step by step

引物设计step by step

1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。

2、用Primer Premier5搜索引物

①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。

②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300～500bp.

③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。

④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况： 3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或 CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.

⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。

3、用Oligo验证评估引物

①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。

②Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3’端的Delta G.3’端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。

③Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower ，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。

④Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。

Analyze中第四项为Composition and Tm，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％ 不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、％GC method和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，Tm 值可以控制在50～70度之间。

第五项为False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。

⑤Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR反应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且Delta G值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。

⑥引物评价完毕后，可以选择File－Print，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有Oligo软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉Tm窗口和Delta G窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR窗口。

4、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。

二、引物设计过程中的心得

1、Primer 5.0搜索引物

①Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。

②PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。

③Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以了。

④搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多，或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。

2、Oligo 6.0评估引物

①在analyze里，Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，The most stable Dimer overall 6.7kcal/mol没有问题。

②Hairpin Formation根据黄金法则

③False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。

④在PCR栏，丁香园战友感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。

⑤Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。 下图引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。

3、其他

①两个评价系统不一样，丁香园战友感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。

②3端的二聚体应该避免，这个要看退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（丁香园战友观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。

③丁香园战友感觉3端有A无A影响不大，3端有T是不是一定不行，不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。

④错配和二聚体谁轻谁重，丁香园战友觉得“到致命的程度”谁都重要，在设计的时候，尽量两个都不得罪。

⑤GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以丁香园战友设计引物的时候，会尽量避免这样的情况出现。

 

PrimerPremier5.0的使用技巧简介
1.功能
“Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计()、
限制性内切酶位点分析()和DNA基元(motif)查找()。“Premier”还具有同源
性分析功能（），但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中
最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA与蛋白序列的互换（）、
语音提示键盘输入（）等等。
有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA来设计引物，由于大多数氨基酸（20种常见
结构氨基酸中的18种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA序列时，会
遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列
组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚
结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模
板DNA的来源以相应的遗传密码规则转换DNA和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结
构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（CiliateMacronuclear）、无脊椎动物线粒
体（InvertebrateMitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（PlantMitochondrion）、
原生动物线粒体（ProtozoanMitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（Vertebrate
Mitochondrion）和酵母线粒体（YeastMitochondrion）。
2.使用步骤及技巧
“Premier”软件启动界面如下：
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其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功
能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10序列，-35序列
等），按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新
限制性内切酶或基元。
进行引物设计时，点击按钮，界面如下：
进一步点击按钮，出现“searchcriteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目
的（SeachFor）有三种选项，PCR引物（PCRPrimers），测序引物（SequencingPrimers），
杂交探针（HybridizationProbes）。搜索类型(SearchType)可选择分别或同时查找上、下游引
物（Sense/Anti-sensePrimer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游
引物为主（CompatiblewithSense/Anti-sensePrimer）。另外还可改变选择区域（Search
Ranges），引物长度（PrimerLength），选择方式（SearchMode），参数选择（SearchParameters）
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等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然
后按，随之出现的SearchProgress窗口中显示SearchCompleted时，再按，
这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物
(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分
为100，即各指标基本都能达标（如下图）。
点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“PeimerPremier”
主窗口，如图所示：
该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些
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性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引
发情况（FalsePriming），及上下游引物之间二聚体形成情况（CrossDimer）。当所分析的引
物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的
窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最
好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾
给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。
在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点，可点击，然后修改
引物序列。若要回到搜索结果中，则点击按钮。
如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规
则，反推至DNA序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。
总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易
使用，是一个相当不错的软件。
Oligo6.22使用技巧简介
1.功能
在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容
易被其复杂的图表吓倒。Oligo5.0的初始界面是两个图：Tm图和ΔG图；Oligo6.22的界
面更复杂，出现三个图，加了个Frq图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物
设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。
2.使用（以Oligo6.22为例）
Oligo6.22的启动界面如下：
图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq，其中Frq是6.22版本的新功能，为邻近6
至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发
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的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade排列方式不太方便，可从windows
菜单改为tili方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo
5.0，只是显示更清楚了。
经过Windows/Tili项后的显示如图：
在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm图块上左
下角的Upper按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选
取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。?G值反映了序列与模板的结
合强度，最好引物的?G值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：）
Tm值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq曲线
为“Oligo6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选
用3’端Frq值相对较低的片段。
当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查
引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或
下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（crossdimer）。二聚体形成的能值
越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，
因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；
与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。
当然，在设计克隆目的的PCR引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，
而且能值不会太低。这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹
结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC含量，以45-55％为宜。有一些模板本身的
GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游
引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果PCR的模板不是基
因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行Falseprimingsite的检测。这项检查
可以看出引物在非目的位点引发PCR反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较
高，就可能出假阳性的PCR结果。一般在错配引发效率以不超过100为好，但对于特定的
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模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的
引发效率为450以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。
当我们结束以上四项检测，按Alt+P键弹出PCR窗口，其中总结性地显示该引物的位
置、产物大小、Tm值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。
由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“PrimerPremier5”的相类似，并且似乎并
不比后者更好用，在此不再赘述。其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求
去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。
除了本地引物设计软件之外，现在还有一些网上引物设计软件，如由WhiteheadInstitute
开发的“Primer3”等（本网站
http://210.72.11.60已引进并调试好该软件，欢迎使用）。该
软件的独特之处在于，对全基因组PCR的引物设计；可以将设计好的引物对后台核酸数据
库进行比对，发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR的用户试用