网页设计师联盟号:连接双酶切

PCR鉴定目的片段是否连接上表达载体

可能的原因，1.表达载体双切不充分，载体量太大，而酶又加的太少，酶切时间短

 2.连接最好是12～16小时，因为你的目的片段和载体的浓度比，不是很合适

3.回收胶的问题

今天酶切时没有和空载体对比，

TE，含有EDTA，会抑制连接酶的活性

洗下来后要先确定一下浓度，浓度太低可定连不上

1：在使用 Wash Buffer 洗涤前，在柱子中加入少量 (200ul) 溶胶液。室温 3-5 分钟后，离心。再接标准洗涤及以后操作。该操作针对胶块大的情况。
2：加入 Wash Buffer 后，静置 1-3 分钟后，再离心。
3：增加 Wash Buffer 的洗涤次数 (少量多次)。

胶的残留导致的问题不是单纯的胶残留问题，同时也会导致溶胶液中盐的残留 - 这似乎对连接影响更大。最好的解决方法是 1；当然，可能会导致得率的小量下降，但质量绝对好。

为了充分去除残留，总结，1.多加一步200ul溶胶液，2.加 Wash Buffer 前空柱离心 30 sec，3.Wash Buffer洗涤时静置及多次

柱子允许胶通过的量是有限的，胶越多或是浓度太大，残留就会更明显，所以切胶时应该尽量要小，假如过大的话分到两个柱子里应该比较好，另外就是溶胶液宁可多加也不能少加

首先要保证待测质粒的纯度,除PCR外,可以对重组质粒做两个双酶切反应：1.ECoR I与Xh0 I双酶切; 2.选一个插入片段中特异存在的切点酶和质粒ECoRI下游到Xba1间的合适位点酶(插入片段中没有的),进行双切,结果 可以预测到.每个双切反应包括酶1单切,酶2单切,双切三个反应,别忘了以空载体做对照.试试看.如果没有得到重组质粒只好再连接反应了.

酶是TAKARA的,方法就是按说明书上做的,酶各1微升,buffer 2微升,质粒5微升,20微升体系.

遇到双酶切可是两个酶没有共用buffer时两种办法：一是低盐buffer的酶先切，然后乙醇沉淀回收，然后高盐buffer的酶再切，乙醇沉淀或切胶回收。 也可以低盐buffer的酶先切，作用时间（一般37℃孵育1小时或更长时间）充分后加高盐buffer的酶再切，然后乙醇沉淀或切胶回收。通过摸索可以积累经验。我记得NEB推荐BamHI和HindIII是分步切。

要将PCR片段连入表达载体中,选的是TaKaRa的BamH I和Hind III,请问这个双酶切是在37度反应还是30度,要酶切多长时间?PCR片段比较难切吗,引物两端都各加了3个保护碱基？
参考见解：一般37度2小时就行，在酶切时，由于你所选用的酶都是效率比较高的，酶切一个小时就已经足够了。不过若不放心，过夜也没问题。buffer需要共用buffer(比如Y buffer)。PCR片段的酶切效率与引物两端所加保护碱基有很大关系。如果保护碱基加的恰当，酶切应该不成问题。PCR产物，由于浓度较低，并不难切，只是在连接转化时难以成功。BamH I一般加CGGGATCCCG的酶切效率高达90%。其它酶的具体情况可以查NEW ENGLAND BioLabs的目录。按new england biolab的介绍，hindIII切割的时间较长，如果，直接切pcr产物再连接有时效率不高，导致转化效率低。如果有条件的话，可以先做at克隆，再酶切。TaKaRa的产品目录的A部分里有关于双酶切所用buffer的详细说明，最好依照执行。

怎么才能鉴定质粒有没有被双酶切？
参考见解：酶切后作个质粒自连实验，在感受态、连接酶等没问题的情况下，如果没有菌落长出，说明双酶切是成功的。当然，如果只长了很少的菌落，也是可以的。如果长了很多的菌落，那说明酶切不完全，这时候就只有一个酶切位点切开了，质粒发生了自连。

目的片断与载体应该是摩尔数之比为3：1～6：1

可以在转化质粒时，以空质粒为对照这样来比较

酶切目的基因及质粒载体后加Loading buffer终止反应,然后要直接进行连接反应,可以吗?要是不行,还有一种方法就是加热灭活限制酶(用的是Hind3/EcoR1双酶切),多高温度适合啊?
参考见解：
1、 一般直接用2倍体积的无水乙醇沉淀目的片段，干燥后直接用水溶解连接即可。比较适用于载体和PCR产物的连接。效果很好。
2、 酶切后要胶回收后再连接,另外酶切结束后,直接电泳回收不用加终止液,对连接没有影响.
3、 有的公司的限制酶（如NEB）是不需要热灭活的，而有的公司的限制酶（如MBI）则需要热灭活，一帮是65摄氏度，10分钟。然后经凝胶回收后再作连接，目的片段与质粒的摩尔比在3～10：1的范围内连接效果都不错。
4、 通常随酶附送的loading buffer是含有SDS起到灭活的作用，但在上样时会产生很多泡沫。

1、 做双酶切的时候用的buffer都是根据公司提供的双酶切最适buffer，每个公司应该都提供双酶切使用的buffer列表。
2、 酶切后电泳条带比较好，切胶回收的效果不好，可能是回收过程中操作出现问题，或者是回收试剂盒有问题。可以尝试更换试剂盒做回收试试，或者看看酶切电泳后目的条带有没有弥散，如果有，切胶回收得不到好的效果。
3、 用于连接的的片段应是单一的，如果将双酶切的质粒直接用于连接，即使得到了转化子，鉴定也比较麻烦，自己都不知道连上的到底是目的片段还是非目的片断。最好用回收产物做连接。
4、 酶切时如果质粒很大>7kb那么希望得到的600bp亮度相对vector太暗了，可能看不到，如果600的带看不到，可以试试加大酶切的质粒的量。相同mol数600 和 4900的带亮度差别会很大。
5、 如果酶没有问题那就要确定双酶切是否已经切开了，已经切开了，只是600bp比较弱的话，可以尝试加大酶切体系（如增大酶切体系为原来的两倍或三倍），酶切后乙醇沉淀富集酶切片断后用小体积TE溶解后电泳，效果可能有所改善。如果根本就没有切开的话，那就要考虑是否是酶的问题，buffer的问题或质粒的问题。

将载体和目的片段（PCR扩增产物，约500bp,两端设有酶切位点）分别用EcoR1和BamH1双酶切后，定向连接。但载体上该双酶切位点间有一个800bp的片段，酶切后电泳可见这一片段，表明酶切成功，胶回收了大片段。连接转化成功后，挑选的单菌落提质粒，PCR鉴定表明有目的片段，约500bp，但双酶切却仍然是800bp的原片段长度。目的片段不含有双酶切位点。请问连接是否成功？若成功了，为何会出现这种奇怪的现象？
参考见解：如果pCR没有污染
1、 假设挑选的是单菌落，则有可能是因为自己引物非特异扩增。PCR比酶切更易出问题，相信酶切结果，没连上。
2、 假如PCR没有问题，最可能是菌被污染，连上了，但有污染。这种可能性大。假阳性产生的可能性极大。
3、 最好重新挑科隆，摇菌。如果不行再用通用引物确定是否没有连上。
4、 应该使用载体引物来作PCR鉴定，因为自己的引物作很有可能出现假阳性。
5、 片断是500bp的，而载体切下来的片断中含有800bp，是否是因为重组质粒的浓度太低，使得800bp的片断可以见到，而没有办法看见500bp的，所以建议将重组质粒酶切量增加，电泳时上样量增加。
6、 可以看到800bp的片断，应该是载体自连接，因为插入片断后载体的酶切位点移位，应该没有办法再次切下800bp的片断，所以建议重新挑菌再作。
7、 如果您能通过PCR检测出您提取的质粒中含有目的片断,而双酶切时却只能显示应该切除的片断,说明可能出现的情况是:您的连接成功,但是您挑取的菌落并不是单克隆,而是包含有假阳性(也就是自连接的质粒菌落)的混合菌落,而且假阳性菌落比例高于需要的阳性菌落,导致在进行摇菌扩增质粒时,同时大量扩增了假阳性质粒,从而出现上面描述的情况.
8、 如果打算从新开始酶切,连接,转化的话,建议加大酶切时酶的使用量，在酶切片断回收时尽量不要切下杂带，这样可以尽量减少自连假阳性的可能性。
9、 如果不打算从新做过，建议在原来已经铺好细菌的LB固体培养基上，再挑取一些菌落，可以一次性多挑几个单克隆（记住，一定要是单克隆，否则很难处理），中心的和周边的，大的和小的，都挑一些，然后用国产质粒提取试剂盒进行小量提取，并且酶切鉴定，这样可以节省大量的时间，并且取的不错的效果，在用试剂盒提取之前每个菌落保留1~2ml菌液，冻存，并标记好对应的试管，如果之后发现那个菌落是阳性克隆的话，回过头来就可以使用冻存的菌液大量提取了。

感受态保存时间不要太长，最好3个月以内，保存负70度，时间长效率会降低的。
如果合适，可以用蓝白筛选阳性菌落，X-GAL和IPTG是40：7，兰色为阴性，白色阳性
保存正确的温度最少是-20℃,一般长期保存需要放置-70℃.就算是-70℃保存,一般经过3个月以上后,质粒会降解非常大.在做转化之前一定是先要鉴定质粒的浓度和质量的.如果有条件可以利用仪器测试浓度,简单的办法就是取一定量(根据质粒浓度决定)进行电泳,然后和marker比较,来测定浓度。
　　转化过程中的温度非常重要,特别是42℃这步,都精确到考虑Ep管管壁厚薄的影响.
　　关于只有第3次长了1各菌落，怀疑没有转好长得杂菌。”首先,16h是不够的,最少也要观察48h,因为转化了质粒的细菌不比正常细菌,受了伤长得很慢而且数量不会很多,有5~6个菌落就是非常好的现象.就算长了一个菌落可以挑出来摇摇看,也许就是需要的。