中财网恒大 校园招聘:Real Time PCR结果分析与实验设计
来源：百度文库 编辑：中财网 时间：2024/04/28 23:42:53
做Real Time PCR的大体有四个目的。
1. 检测某个基因表达水平的上调或下调。
2. 检测siRNA靶基因的下调量。
3. 观测某个基因在一系列细胞中的表达模式。
4. 别出心裁的实验设计。
四种实验对应的数据处理方法是不同的。但原理是一样的，即都基于这个公式：
Ct = -k * log2（X0） + b （1）
其中k=1/log2(1+E)，其中E代表PCR的扩增效率，如每个循环扩增的原DNA的90%，则E=0.9。
b是个无关紧要的常量，除非是绝对定量rt PCR，否则是用不到b的。
所谓的2 delta方法是这样的：
如有基因A，内参基因C，样品甲和乙。欲知基因A在甲中的表达量相对于乙是上调还是下调，上调或下调了多少。
应得到四个Ct值：Ct（甲A），Ct（甲C），Ct（乙A）和Ct（乙C）。
ΔCt（甲）=Ct（甲C）-Ct（甲A）=k*log2[X（甲A）/X（甲C）]
ΔCt（乙）=Ct（乙C）-Ct（乙A）=k*log2[X（乙A）/X（乙C）]
ΔΔCt=ΔCt（甲）-ΔCt（乙）=k*log2[A在甲中的表达量/A在乙中的表达量]
如此则：
R=A在甲中的表达量/A在乙中的表达量=2^（ΔΔCt/k）
这样一来，只要知道k值就可以了。k=1/log2(1+E)，如果扩增效率是100%，则E=1，k=1。否则只要做个浓度梯度，就可把它计算出来。
1. 做siRNA时，R<1，（1-R）*100%即siRNA下调靶基因的量。
2. 表达模式分析只要一个delta就行了。
3. 一通百通，无论怎么弄，都有解决办法。
实验设计时，每板重复三次，做三个板，是为了消除PCR本身和样品本身的误差，是必不可少的。
如同微阵列一样，三次是最少次数。取平均值可以，中数也可以。无论如何,实验设计一定要严谨。