中财网都秀视频聊天苹果版:RT-PCR实验所用器材等总结『经典』 - 二楠的日志 - 网易博客
来源：百度文库 编辑：中财网 时间：2024/04/28 23:29:40
Rt-PCR实验步骤
一、实验器具与材料：
1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl
2、吸头：1ml、200μl、20μl
3、匀浆管：5ml
4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个
5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl
6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）
1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）
7、量筒：50ml、250ml、500ml
8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml
9、试管架：5ml、1.5ml、20μl
10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水
11、铝制饭盒：4个
12、塑料小饭盒：1个
13、大瓷缸：2个
14、锡泊纸：一卷
15、卷纸：2卷
16、三角烧瓶：带盖，稍大
二、实验器具的处理与准备
1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）
先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）
2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）
3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC）
三、试剂配制：
1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
2、75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压）
3、异丙醇：放入棕色瓶中
4、氯仿：放入棕色瓶中
5、琼脂糖
四、几种缓冲液的配制：
1、电泳缓冲液：
Tris 54g
硼酸 27.5g
0.5M EDTA 20ml？ pH8.0
蒸溜水 1000ml
5×TBE （贮存液）
再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液+450ml水——→500ml工作缓冲液
2、上样缓冲液：
0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯青FF
30%甘油
6×缓冲液，4℃保存
五、琼脂糖凝胶的配制：
1、1.0%：
1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。
2、1.5%:
同上，将琼脂糖的量改为1.5g
（生工. Tel. 2236106.）
Taq酶（含MgCl2 Buffer） 200u 70.00
dNTP: 1支
oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega
M-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer)
RNasin: 1支 110
—— -20℃
DEPC 5g 110.00
Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies
—— 4℃
Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00 科威
（1543. 994. 697. 515. 377. 231）
七、引物合成
1、内参照：
GAPDH
正义：5′—ACCACAGTCCATGCCATCAC—3′
反义：5′—TCCACCACCCTGTTGCTGTA—3′
β-actin
正义：5′—CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC—3′
反义：5′—TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT—3′
2、par-4:
正义：5′—GGGACCTCGGAACTCAAC—3′
反义：5′—TGTATCTGCCTGGGACTG—3′
3、退火温度计算
2（A+T）+4（G+C）
正反义平均数，再上下波动度（±4℃，或±5℃）
4、引物各合成5 OD，每OD一瓶分装好
5、引物稀释：
加DEPC水量为（μl）
= ? nmol / OD × 管上所标OD数×100
是为10p mol / μl 浓度的引物溶液
八、PCR产物电泳
先将1-10μl左右PCR产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复吸打混匀后进行电泳，一般电流为10mA，电源100V，电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。
九、几个注意点：
1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴？
2、Rt时，先打开PCR预热30分钟。
3、RNA抽提前，打开离心机预冷。
在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。
在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。
外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。
①电泳缓冲液
1. 50×Tris-乙酸（TAE）缓冲液
成分及终浓度 配制1L溶液各成分的用量
2mol/L Tris碱 242g
1mol/L 乙酸 57.1 ml的冰乙酸（17.4 mol/L）
100 mmol/L EDTA 200ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）
水 补足1L
2. 5×Tris-硼酸（TBE）缓冲液
成分及终浓度 配制1L溶液各成分的用量
445 mmol/L Tris碱 54g
445 mmol/L 硼酸盐 27.5g 硼酸
10 mmol/L EDTA 20 ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）
水 补足1L
②染料
1. 1％溴酚蓝（bromophenol blue）
加1g水溶性钠型溴酚蓝于100ml水中，搅拌或涡旋混合直到完全溶解。
2. 1％二甲苯青FF（xylene cyanole FF）
溶解1g二甲苯青FF于足量水中，定容到100ml。
3. 10mg/ml的溴化乙锭（ethidium bromide）
小心称取1g溴化乙锭，转移到广口瓶中，加100ml水，用磁力搅拌器搅拌直到完全溶解。用铝箔包裹装液管，于4℃贮存。
③凝胶上样液（gel loading solutions）
1. 6×碱性凝胶上样液（室温贮存）
成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量
0.3 N 氢氧化钠 300ul 10N 氢氧化钠
6 mmol/L EDTA 120ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0）
18％聚蔗糖（400型） 1.8g
0.15％溴甲酚绿 15mg
0.25％二甲苯青FF 25mg
水 补足到10ml
2. 6×聚蔗糖凝胶上样液（室温贮存）
成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量
0.15％溴酚蓝 1.5ml 1％溴酚蓝
0.15％二甲苯青FF 1.5ml 1％二甲苯青FF
5 mmol/L EDTA 100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0）
15％聚蔗糖（400型） 1.5g
水补足到 10ml
3. 6×溴酚蓝/二甲苯青/聚蔗糖凝胶上样液（室温贮存）
成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量
0.25％溴酚蓝 2.5ml 1％溴酚蓝
0.25％二甲苯青FF 2.5ml 1％二甲苯青FF
15％聚蔗糖（400型） 1.5g
水补足到 10ml
4. 6×甘油凝胶上样液（4℃贮存）
成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量
0.15％溴酚蓝 1.5ml 1％溴酚蓝
0.15％二甲苯青FF 1.5ml 1％二甲苯青FF
5 mmol/L EDTA 100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0）
50％甘油 3ml
水 3.9ml
5. 6×蔗糖凝胶上样液（室温贮存）
成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量
0.15％溴酚蓝 1.5ml 1％溴酚蓝
0.15％二甲苯青FF 1.5ml 1％二甲苯青FF
5 mmol/L EDTA 100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0）
40％聚蔗糖 4g
水 补足到10ml
6. 10×十二烷基硫酸钠/甘油凝胶上样液（室温贮存）
成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量
0.2％溴酚蓝 20mg
0.2％二甲苯青FF 20mg
200 mmol/L EDTA 4ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
0.1％SDS 100ul 10％ SDS
50％甘油 5ml
水 补足到10ml[/size]