哺乳动物MAPK途径简述

第1部分 MAPK途径简介

1.1哺乳动物MAPK途径的发现

80年代早期，研究者发现PDGF和EGF 刺激可以诱导一个42KD蛋白Tyr基团磷酸化(1)。后在佛波醇脂刺激的细胞中(2)，在一些病毒转化的细胞中，均发现了相同的现象(3)。 与此同时的研究发现胰岛素受体在活化后可以激活一个42KDSer/Thr蛋白激酶(4)，它的激活需要Tyr磷酸化和Thr的双重磷酸化。研究者将其命名为MAPK（有丝分裂原激活的蛋白激酶）。不久，谜底接晓：这两项研究都揭示了一个独特的激酶的存在，它的激活需要其Tyr和Ser/Thr基团同时被磷酸化(5)。 这个42KD蛋白，就是在哺乳动物细胞中最早发现的MAPK途径的核心成员之一－ERK1（extracellular signal regulated kinase 1），MAPK途径也因此得名(6)。很快，与其高度同源的ERK2、ERK3相继被克隆，对哺乳动物MAPK途径的研究从此开始。 ERK被发现与酿酒酵母中的蛋白激酶Fus3、Kss1具有很高的同源性，揭示了单细胞酵母中MAPK途径的存在。之后的研究在多种低等生物（如非洲栗酒裂殖酵母、白色念珠菌、镰刀菌）、植物（如燕麦、烟草）、高等生物（哺乳动物、鸟类、爬行动物、鱼类）中均发现MAPK途径发挥着作用。这证实了MAPK这条古老的途径在所有真核生物中都是保守的。 ERK的发现也是一个开端，研究者很快克隆了它的上游激酶(7)。借助这条途径得天独厚的优势－在哺乳动物细胞和酵母中MAPK途径成员、组织方式之间高度同源性，利用可进行基因组遗传学研究的酵母模型，与哺乳动物中的发现相互印证，终于勾勒出了MAPK途径三酶级联反应的轮廓。 在近20年的时间内，MAPK途径成员相继被发现，相互作用相继被阐明。它们构成了一个庞大、复杂而又精细的网络，成为目前发现成员最多、关系最复杂，也是研究最详尽的途径之一。它们参与细胞生长、分裂、分化、死亡各个阶段的生理活动，调节着一系列复杂的生物功能。

1.2 MAPK途径基本特点(8)

1.2.1 三酶级联反应:

这是MAPK途径最显著的特点。三个激酶构成一个最小的功能模块，被级联激活（示意图如下）。胞外多种刺激因素，从神经递质、激素、生长因子、细胞因子到各种应激刺激如辐射伤害、渗透压变化等等，都可以激活这个三酶级联反应。

MKKK是一个Ser/Thr蛋白激酶，它直接的激活因素也有多种：MKKKK、小G蛋白家族成员Ras、Rho、寡聚化、胞内位置的变化等等。MKKK激活后可Ser/Thr磷酸化激活下游激酶MKK MKK被Ser/Thr磷酸化后激活，作为一个极具特色的Tyr、Thr双功能激酶发挥作用。它识别下游MAPK分子中“Thr-X-Thr”模序，将两种不同的氨基酸分别磷酸化后激活MAPK。 MAPK是一个双磷酸化激活的Ser/Thr蛋白激酶，是MAPK途径的核心。MAPK底物包括一些胞质蛋白激酶、磷脂酶、骨架蛋白，但绝大部分是核内转录因子。 一些特异性磷酸酶对“Thr-X-Tyr”模序的去磷酸化导致MAPK的失活。它们包括：MKP-1(CL100,3CH134,Erp,hVH-1)、MKP-2(hVH-2, Typ-1)、MKP-3(rVH6, Pyst1)、MKP-4、PAC1 VHR、B23(hVH-3)、M3/6(hVH-5)。不同种类的磷酸酶有较高的特异性。 这种复杂的三酶级联反应的分子基础是什么呢？很多科学家认为，它是由MAPK独特的双磷酸化激活的性质决定的。“Thr-X-Tyr”存在于MAPK分子的激活环状结构之中，MKK识别这种三氨基酸形成的特定空间结构，具有很高的特异性，这就使得上游信号对MAPK的调节受到限制。因此，上游MKKK的存在成为必然，它可以被多种因素激活，允许尽量多的上游信号输入。所以显然，MKKK的种类最多，目前在哺乳动物细胞中已发现14种，MAPK12种，MKK种类最少，只有7种。具体家族成员在后文有详细描述。 1.2.2 MAPK的双磷酸化激活 这也是MAPK途径的标识性特点。MAPK具有特定构象的“Thr-X-Tyr”模序的双磷酸化，可以使其活性提高数千倍。具体过程是：两个氨基酸残基的磷酸化，使它们所在的激活环状结构重新折叠，后与分子表面的精氨酸结合位点相互作用，形成激活状态分子构象(9)。 值得一提的是，将Thr、Tyr置换成Glu不能导致MAPK的持续激活，证明双磷酸化后诱发的酶的一系列精巧的构象变化是不能用简单的氨基酸置换代替的。正是这个原因，使点突变对MAPK酶活的促进无能为力。这解释了为什么MAPK从未以癌基因的形式出现，也证实了这条古老的途径对于细胞增殖的调节是相对安全的。

第2部分 哺乳动物MAPK途径的组织

哺乳动物中对MAPK途径的研究，多采用过表达、显性失活、基因敲除等方法。目前，已发现了4种类型MAPK途径，它们以途径的核心－MAPK命名，参与了多种细胞生理活动的调节。 首先应强调两点： 1 许多途径成员都以几种不同形式的异构体存在，每种异构体还有多种剪切方式，更增加途径的复杂性。 2 各条MAPK途径并不是僵化的，许多成员都具有交叉性（见图一）。没有任何一条途径在细胞的某种反应中是独立存在的，每条途径都可以和许多其它途径相整合，它们的强度、相互作用、整合结果决定了细胞的命运。

图一 哺乳动物细胞MAPK途径

2.1 MAPK^erk途径（ERK途径）

这是脊椎动物中克隆的第一个MAPK途径，也是阐述最完全的经典途径。 2.1.1激活因素及上游分子的募集 ERK途径的激活多由细胞表面受体激活引发。这些受体包括：生长因子酪氨酸激酶受体（EGF受体、PDGF受体、胰岛素受体）、细胞因子受体、TCR 、CD28、BCR、G蛋白偶联受体等等。整联蛋白的聚集也可引发这条经典途径。 ERK途径最主要的激活信号来自酪氨酸激酶受体。以EGF受体为例，自身酪氨酸磷酸化激活之后，接头分子Shc通过其PTB结构域结合于受体特定的磷酸化酪氨酸上，被受体激酶磷酸化(10)。Shc磷酸化激活后，又通过其SH2结构域结合另一接头分子Grb2。而Grb2已通过其SH3结构域与 Sos（鸟苷酸交换因子）稳定结合。这样，受体自身磷酸化激活就召集了Sos分子。Sos与受体的结合使质膜Ras·GDP转换为Ras·GTP，Ras分子与MKKK^raf1相作用，激活了ERK级联反应途径（11）。（见图二） 没有激酶活性的细胞因子受体通过召集胞内激酶如Lck、Fyn、Lyn使自身磷酸化，引发相同的反应，通过Ras·GTP这个重要分子激活ERK途径(12)。JAK也可以激活此途径。目前发现，JAK的作用体现在两个水平：磷酸化Shc接头分子(13)、直接磷酸化MKKK。（见图二） 这些上游分子的募集对于不同信号激活MAPK途径是非常重要的。但也并不是所有的ERK途径都必需Ras的参与，最近的一项研究表明，在IL-3依赖的小鼠前B细胞株Ba/F3中，42℃热击可以激活一条未知的不需要Ras激活的ERK途径(14)，这同时也证明ERK途径也可以介导一些应激刺激信号。

2.1.2 三酶模体构成 MKKK：Raf1、A-Raf、B-Raf、Mos、MEKK1、MEKK2、MEKK3、Tpl-2 MKK： MEK1、MEK2 MAPK：ERK1、ERK2 MKKK：以Raf-1为例，其N端调节结构域与上游分子膜蛋白Ras·GTP作用，结合于质膜，Tyr340和Tyr341被膜上的酪氨酸激酶如c-Src等磷酸化激活(10)(11)。此过程详细机理还不十分清楚。Raf-1同时在Ser43、Ser259、Ser499、Ser621、Thr268均被磷酸化，实验证明可能是由PKC介导的(15)。 Raf-1还受其它蛋白调节(16)，例如可被14－3－3蛋白激活，被PKA下调。这提供了MAPK^erk途径与其它相关途径在上游整合的证据。 MAPK途径其它成员也可调节Raf-1活性：下游激酶MEK1可以激活Raf-1，正反馈放大信号(17)。而同是下游激酶的ERK1/2则发挥抑制作用，负反馈调节信号强度。 MKK：MEK1和MEK2高度同源，许多实验结果表明，它们在不同的细胞体系中，不同的胞外信号作用下，分别受到Raf-1、A-Raf、B-Raf不同的调节。 同时MEK作为双功能激酶双磷酸化ERK1/2。MEK中存在NES（排斥入核序列）(18)，在非激活状态下，MEK与ERK结合，迫使ERK驻留于胞质。 MAPK：ERK1/2内部模序“TEY”被双磷酸化激活之后，与胞质激酶MEK脱离，可以转位入核，调节一些转录因子功能。作为一个Ser/Thr蛋白激酶，磷酸化底物“Pro-Leu-Ser/Thr-Pro”模序(19)。底物距磷酸化位点＋1位的脯氨酸对ERK和底物的相互作用非常重要，它介导了二者相互作用。ERK双磷酸化激活后，构象变化，形成特异于脯氨酸的分子表面口袋。 双功能磷酸酶MKP-1、MKP-3、MKP-4特异性下调ERK。ERK去磷酸化失活后，又转位出核，回到胞质与MEK重新结合。其中，MKP-3和MKP-4定位于胞质，提示了MKP-3、MKP-4对ERK途径下调具有特殊的机制。 2.1.3作用底物 由于ERK激活之后可以转位入核，ERK1/2的底物也分别定位于胞质中、核中。 胞质中：ERK1/2苏氨酸磷酸化激活p90rsk激酶。p90rsk随后转位入核，磷酸化c-Fos(Ser362)。同时磷酸化抑制GSK3活性，减弱了GSK3对c-Jun的负调作用，放大了ERK的信号(20)。 磷酸化激活磷脂酶A2(21)，加速其催化反应（类二十烷酸合成中的限速步骤）的进行，提高了参与细胞了许多重要的生理现象的调节分子－花生四烯酸的合成。 ERK1/2还可以磷酸化抑制途径上游分子。它们包括：EGF 受体、Ras交换因子Sos、Raf-1、MEK。这些分子都参与了对ERK的调节，ERK对它们的影响体现了一种负反馈机制(22)。 核中：Erk1/2核中的底物多为转录因子。它转位入核磷酸化激活的转录因子包括：Elk1、Ets1、Sap、c-Myc、 Tal、STAT。而对Myb，则发挥抑制作用。 在这里，简单介绍一下ETS转录因子家族(23)，它的许多成员都是MAPK途径的重要底物。在对Ras－Raf－MAPK途径的研究中，ETS家族不断有新成员被发现。这是一个非常古老的转录因子家族，和MAPK途径一样进化保守。 这个家族所有成员的共同点是拥有一个ETS结构域，负责与DNA序列以单体形式相结合。ETS 结构域形成一个wHTH结构，识别并结合核心区为GGAA/T的10碱基序列，称之为EBS。根据ETS结构域构象和位置不同，ETS家族分为多个亚家族。（见图三）。它们都具有N端保守调控区NCR，MAPK正是通过磷酸化NCR中一个Thr残基，特异性地激活ETS。 值得一提的是，ETS转录因子家族激活后对特定基因表达的调节是通过与其它种类的转录因子在DNA元件上形成某种特异的复合物实现的。目前已发现有多种此类复合物，例如：EBS位点结合的“ETS－AP-1”复合物，SRE位点结合的“SRF－TCF”复合物，组织特异的Ras反应元件结合的“ETS-1－Pit-1”复合物等等（见图四）。 ETS转录因子家族四大特点决定了它们对特定基因表达调节的专一性： （1） 家族成员在不同组织、细胞种类中表达具有很大差异，限制了被调节基因的种类。 （2） 每个家族成员都具有其特异性结合序列，对靶基因选择非常严格。 （3）与其它特异性蛋白因子相互作用。 （4）与其相作用的蛋白因子也受到MAPK途径的特异磷酸化调节。

ETS转录因子家族在MAPK信号途径下游发挥着非常重要的作用，它的许多成员都与细胞转化相关，并关系到人类疾病(24)。这也从侧面反应了MAPK途径的重要性。

图三 ETS转录因子家族成员

2.1.4 ERK途径功能 培养细胞中，ERK途径与细胞的增殖相关。但ERK途径对增殖促进或抑制，因细胞而异，因它在不同的细胞环境中激活的基因而异。 EGF、RDGF等细胞生长因子可以强烈而持久地激活此途径。对MKKK分子Raf1功能的干扰对细胞增殖有明显的抑制，而MEK1的持续激活可促进细胞生长。胞内激活的ERK分子一半结合于胞质骨架上，暗示了它与增殖中胞质骨架的重新组织有关。 但在另一些细胞环境中，它的激活对细胞增殖却有明显的抑制作用。例如在平滑肌细胞中ERK途径的激活引发的PGE2的释放抑制了细胞增殖。 在一些特定的细胞中，ERK途径还可以介导分化信号。 在PC12细胞中，神经生长因子NGF诱导的MEK1和ERK2分子的持续激活可诱导细胞分化。 同样在PC12 细胞中，生长因子EGF和神经因子NGF都可以激活ERK途径，为什么EGF可促进细胞生长，而NGF却介导了抑制细胞增殖的分化信号(25)？区别在于它们对相同的ERK途径激活的时间和强度不同。EGF对这条途径是短暂激活，NGF引发的激活是持续的。总而言之，ERK途径激活的时间、强度不同，效果迥然而异。 ERK途径参与了细胞周期调节。Cyclin D1的转录依赖于ERK的持续激活和核内滞留。在中国仓鼠卵巢细胞中，ERK1/2在G1期和M期被激活，并定位于微管组织中心(26)，但它的下游底物还未发现。 ERK途径的激活可以抗凋亡。目前已发现途径两个成员与凋亡相关：ERK与B-Raf。在L929细胞中，ERK的激活削弱了TNF-α诱导的凋亡信号(27)。在Jurkat细胞中，它的激活又对抗了Fas诱导的凋亡信号(28)，但这种对抗很弱，而且很快就被凋亡引发的Raf1降解削弱了。小鼠基因敲除实验证实B-raf是血管系统发育的关键分子(29)，它的功能推测为保护成熟的红细胞抵抗凋亡。

2.2 MAPK^jnk 途径（SAPK/JNK途径）

1991年，发现了这条途径核心MAPK－JNK，它与ERK有两大区别： 可被多种应激刺激激活、磷酸化转录因子c-Jun N端激活位点（ERK磷酸化其c端抑制位点）。当时，此激酶在人和大鼠中同时被发现，分别被命名为JNK（c-Jun N端激酶）和SAPK（应激激活蛋白激酶）(30)(31)。随后又发现了JNK家族的其它成员。 2.2.1 激活因素及上游分子募集 这条途径的特点之一就是可被多种应激因素激活：热击、γ射线导致的DNA损伤、过氧化物体的产生、高渗等等。 同时，和ERK途径一样，它也可被多种类型的细胞表面受体激活：TNF受体家族、GPCR、酪氨酸激酶受体、细胞因子受体都可激活JNK途径。更多的激活因子仍在探索中。 Ras对JNK途径的激活只可达到1/3。而其它小分子量GTP结合蛋白家族成员Rac 和Cdc42却是JNK途径的强激动剂，它们也可与Ras相协同，最大限度地激活JNK途径。实验证实，舒缓肽等G蛋白偶联受体可以激活Cdc42，生长因子酪氨酸激酶受体EGF可激活Rac，Rac结合并激活下游分子PAK65/PAK1（MKKK），传递特异信号(32)（见图一）。 2.2.2 三酶模体构成 MKKK：MEKK1、MEKK2、MEKK3、MEKK4、TAK1、MUK、Tpl-2、SPRK、 ASK1、MST MKK： MKK4、MKK7 MAPK：JNK1、JNK2、JNK3 JNK目前已发现三种，分别由三个基因编码(33)，JNK1和JNK2在体内广泛存在，JNK3只存在于脑中。三个基因不同的剪切方式共产生了10种异构体，关于它们在体内的表达方式还没有系统研究。但已发现异构体受到不同的调节 JNK也是被双功能激酶MKK4、MKK7双磷酸化“TPY”模序激活。被特异性双功能磷酸酶M3/6、MKP-1去磷酸化失活。 JNK途径中一个重要的分子是JIP-1(34),它作为JNK的抑制因子在小鼠中被发现，可以抑制JNK对转录因子的激活。JIP-1 中存在一个JBD结构域（JNK 结合结构域）。这个结构域可抑制多种JNK的功能，包括激活c-Jun和Elk-1、参与NGF去除引发的凋亡等等。JIP-1也是JNK的底物之一，它的许多功能也可被JBD抑制。最近，JIP-1的大鼠同源蛋白IB-1被发现(35)，有研究者推测JIP-1是它截短的异构体。 2.2.3 作用底物 JNK对底物具有双重识别机制。首先和其它MAPK一样，它识别底物的“Ser/Thr-X-Pro”模序并将其磷酸化，但仅有这一个序列是不够的。证据是具有此序列的JunB不能被JNK有效地磷酸化。有效的磷酸化还需要一个另外的锚定序列。例如c-Jun分子锚定模序的存在加强了与JNK结合，有效地提高了JNK的局部浓度，并指导着JNK对N端的磷酸化。又因为c-Jun可以和AP-1转录因子家族其它成员形成二聚体，它对JNK的锚定为其它没有锚定模序的转录因子被JNK磷酸化提供了一个平台(36)。 JNK和ERK不同之处还在于它没有胞质底物，它的底物均为核内的转录因子。它们是：c-Jun、ATF-2、Elk-1、p53、DPC4、NF-AT4。 以c-Jun为例，JNK磷酸化它的Ser63和Ser73，增强了Jun/Jun同源二聚体和Jun/ATF2异源二聚体的形成，也增强了c-Jun 抗泛肽降解的能力(37)。因此，JNK不仅可以激活转录因子，而且可以提高它们的稳定性，从而促进目的基因表达。 但也有相反的情况。JNK磷酸化转录因子NF-AT4抑制其入核发挥作用。(38)。证据是其磷酸化位点的突变，可以使NF-AT4持续性激活，并滞留于核内。 JNK对Elf-1的激活，则体现了JNK途径与经典ERK途径的会聚。 2.2.4 JNK途径功能 与细胞凋亡相关。生长因子缺乏、应激刺激、DNA损伤、凋亡因子Fas在细胞表面的连接引发的凋亡信号都有JNK途径的参与。对途径中关键分子如MKK-4、c-Jun 功能的干扰可以在某种程度上抵抗凋亡。 目前已发现，前凋亡蛋白FasL的表达需要AP1转录因子复合物的参与，需要JNK途径的激活，这是JNK途径与细胞凋亡途径之间最直接的联系(39)。 小鼠基因敲除实验证实JNK3与红藻氨酸诱导的癫痫相关。癫痫的放电性发作程度反应了脑部海马区细胞的死亡数目。JNK3的基因敲除小鼠对作用剂量的红藻氨酸没有癫痫发作反应，究其原因是海马区没有细胞死亡。这是目前发现的JNK分子与细胞凋亡相关的最好证据(40)。 在一些情况下，JNK途径也参与细胞存活和生长调节(41)。 BAF3前B细胞中，JNK途径与IL-3诱导的细胞增殖有关。T98G细胞中，它又参与了对DNA损伤的修复。 另有证据表明，在T细胞中，JNK途径的激活和TCR与CD28的信号整合相关。两个受体的共同作用激活了JNK途径，参与细胞因子IL-2表达调节。一些证据表明，通路为PKCtheta→calcineurin→CDC42→MEKK1→SEK1(42).

2.3 MAPK ^p38途径（p38途径）

在对LPS刺激单核细胞的研究中，发现了一个38KD的蛋白酪氨酸被磷酸化，这就是p38蛋白(43)。由于发现较晚，有关p38途径的描述较少，认识还很不够。 2.3.1 激活因素及上游分子的募集 目前已知p38途径的激活因素和JNK途径大致相同，它可以被一些应激因素：辐射、渗透压变化、热击、脂多糖、蛋白合成抑制剂等激活。也可以被GPCR和IL-1、TNF-α等细胞因子受体激活。 它的上游激活途径和JNK途径也十分类似，均涉及了小G蛋白Cdc42和Rac1分子，它们激活MKKK－PAK。当然也存在其它未知激酶的作用。 2.3.2 三酶模体构成 MKKK：TAK1、ASK1、SPRK、PAK MKK： MKK3、MKK4、MKK6 MAPK：p38α、p38β、p38δ、p38g MKKK：目前已知TGF-β通过Tab1激活TAK1，TNF-β可激活ASK1，而PAK可以被上游Cdc42激活。而关于MKKK如何通过MKK激活p38激酶，目前还不很清楚，但可以确定，和ERK、JNK途径一样，存在着多种激酶的作用。 MKK：P38途径的MKK3、MKK4与JNK途径相同，也暗示了这两条途径的交叉。它们均可被TAK1、ASK1、SPRK激活，SPRK还可激活MKK6。 MAPK^p38被MKK双磷酸化 “TGY” 模序激活，可以被特异性的双功能磷酸酶M3/6去磷酸化而失活，当然，一些广谱的磷酸酶对它也有作用。

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2.4 MKK5/MAPK^erk途径

关于这条途径知之甚少，迄今还未发现此途径的MKKK。ERK5可以被过氧化、高渗透压等应激条件激活，也可以被一些非应激刺激如血清激活。有实验证实ERK5可以被MKK5激活，激活后转位入核。 在血清刺激下，MKK5、 ERK5的激活，可以激活转录因子MEF2C，它可以诱导c-Jun基因的表达(52)。在格兰氏阴性菌胞壁脂多糖刺激的巨噬细胞中，转录因子MEF2C同时还可以被p38途径激活，这再一次证实了哺乳动物中不同的MAPK途径存在共同的下游靶分子。但是这两条途径作用于MEF2C的磷酸化位点是不同的。

第3部分 MAPK途径特异性的实现

这些纷繁复杂的分子如何精确地组织起来，对相应的外界刺激给予适当程度的反应，确实让研究者头痛。加之体外实验中，一个上游激酶可以激活多个下游分子，一个下游分子可以被多个上游激酶激活，更增加了这个问题的复杂性：MAPK途径对刺激作出反应、级联激活、调节基因表达的特异性如何实现？ 到目前为止，研究者共提出了5种机制：

3.1 酶－底物相互作用(53)

作为酶促级联反应的MAPK途径一大特点就是每一个下游激酶均为上游激酶的底物，因此，这种直接的酶－底物相互作用在信号传递的过程中发挥重要作用。体内、体外实验也均证实某种特定的上游激酶对某几种特定的底物具有很高的特异性，前文已有述及。 这种特异性还体现在于对于相同的底物，不同的MAPK识别机制不同。例如Elk-1可以被三种MAPK磷酸化激活，ERK和JNK结合于它的D结构域，p38的结合却不需要此结构(54)。

3.2 分子平台和接头

对于如此复杂的分子库而言，实现途径的特异性仅有酶－底物相互作用是远远不够的。前文已提到，为了对多种信号作出反应，胞中MKKK数目最多，但是什么机制，使MKKK对下游MKK－MAPK具有选择性？分子平台和接头分子的存在，将相关的分子拉到一起，大大促进了它们之间反应的特异性。这也是在MAPK途径中发现的信号途径通用重要特点之一。它解释了为什么在体外实验中广谱激活的酶在体内却有相当精确的专一性。 分子接头在MAPK途径的作用在ERK途径Ras激活中已有详述。 分子平台，顾名思义，是一个具有多分子结合位点的大分子，它将某条途径相互作用的分子拉到一起。这不仅阻止了其中成员作用于其它途径，降低了途径间的交叉，而且提高了途径成员的局部浓度分布，增加了激活效率。分子平台的存在大大提高了MAPK途径的特异性（见图五） 分子平台的存在，也赋予了途径灵活的调节能力。平台分子内部几个位点分别与途径成员结合，多个弱作用互相协同形成一个稳定的动态大复合物。选择性地破坏其中一种或几种，就可以导致整个复合物的内部结合因失协同而解离。这样，通过调节几个相对弱的蛋白之间的相互作用就可以实现对所有途径成员的调节。而具体的调节方式正是：磷酸化。 平台分子首先在酵母中发现。酵母的交配途径中存在一个重要分子STE5，应用双杂交实验证明它的不同区域可结合交配反应MAPK模体的不同成员ste11、ste7、Fus3、ste4，形成一个多成员复合体(55)(56)。上游信号作用于分子平台ste5之后，它利用RING-H2模序二聚，促使ste11磷酸化激活(57)。 后又在酵母中发现了PBS2分子(58)，它结合高渗反应途径成员，避免了它们与交配反应途径等其它途径的交叉，保证了专一性。需指出这个分子本身也是酶促级联反应的一员，证明了MAPK途径成员也可具有分子平台的功能。 以后的研究证明分子平台在哺乳动物细胞中也普遍存在。1998年MP1作为ERK途径的分子平台被发现(59)。它选择性地结合MEK1和ERK1，区分了高度同源的ERK1/2异构体。Cos细胞中，MP1的过表达加强了ERK1的活性。推测MP1在体内的功能是提高了MEK1－ERK1被MKKK激活的效率。 另一个平台分子与JNK途径相关。前文提到的JIP-1起初作为JNK的抑制因子被发现，因为它的过表达抑制了JNK的活性。后证明它是JNK途径的重要的分子平台(60)，它对JNK抑制作用的原因是过表达时大量与JNK结合，阻止其入核。JIP-1同时特异性结合三酶模体上游激酶HPK-1和三酶模体成员MLK3/DLK、MKK7，形成了一个完整的级联激活通路，选择性地激活JNK。 MAPK途径成员有些也可作为平台分子。如激酶MEKK1，这个196KD的大分子量蛋白可以特异性地结合MKK4和JNK(61)(62)，提高酶促反应效率。它们相互作用的详细机制还有待研究。

图五 分子平台作用示例

需要指出的是，高等生物MAPK途径许多成员本身就是广义的平台分子。例如ERK途径中，Raf与Ras通过一个功能结构域相结合，同时又结合MEK。JNK途径中，MKK4分子的不同形式分别与MEKK1、JNK结合，介导了级联途径不同时段的反应。

3.3 MAPK途径功能模块的空间组织

3.3.1 MAPK途径成员在胞内精确定位。这大大提高了其激活/被激活的特异例如ERK一族与胞质骨架相结合(63)；激活的ERK在有丝分裂不同时期在着丝粒、星中间体存在(64)；激活的JNK与其上游激酶Mlk2共同定位于微管点状结构上(65)。 对这种定位的机制，推测有三种：（1）由底物或上游激酶在胞中的分布决定。如Raf的膜上分布是由于其与上游激活因子－膜蛋白Ras结合。（2）由一些未知的锚定分子决定。（3）由分子内部的定位序列决定。如MEK1、MEK2均具有NES（nuclear export signal），决定了它留在核中。 3.3.2 MAPK激活之后的核转位。以ERK1/2为例，这种核转位分为三步(66)(67)：（1）与MEK相互作用驻留于胞质。MEK由于其序列中的NES只在胞质分布，它提供了ERK一个胞质的锚定点。（2）激活后，磷酸化二聚。（3）二聚体主动运输入核。ERK缺乏NLS，有关其主动运输入核的机制目前还不明了。推测一种可能是与其它有NLS序列的蛋白相结合。另一种可能是ERK中存在一个不连续的NLS，二聚化后可被某种主动运输机制识别。

3.3.3 MAPK通过调节下游底物的胞内空间分布影响其信号功能。如JNK对转录因子NF-AT4Ser163、165的磷酸化，阻止了它入核(38)，从而影响了功能发挥。

3.4 MAPK模块的时间组织

这主要是指MAPK途径激活时间长短对细胞产生特异性反应至关重要。由多种因素决定：

3.4.1 信号上游分子决定。如上文提到过的PC12细胞中，ERK途径的持续激活导致细胞分化，而瞬时激活却促进细胞生长。有人推测这种差异由途径上游使用的小GTP结合蛋白种类决定(68)。Ras介导了ERK途径的早期激活，而Rap-1则引发了它的持续激活。最近，又有研究者提出二者反馈抑制途径的差异也是原因之一(69)。 3.4.2 反馈抑制/激活途径决定。 负反馈机制体现在多个方面：（1）途径激酶负反馈磷酸化上游成员，抑制其活性缩短途径激活时间。如ERK对上游分子的负反馈作用。（2）一些特异性磷酸酶的激活可以通过去磷酸化缩短MAPK途径的激活时间(70)。但需要指出的是，存在于核中的MAPK磷酸酶如MKP-1，它的激活在选择性地关闭MAPK诱导的基因表达变化同时，对胞质中的MAPK无明显影响。（3）广谱的Ser/Thr磷酸酶如PP1、PP2A也可通过对MEK和Raf的去磷酸化调节途径激活时间。 正反馈同时存在。一些途径成员，如MEK、Raf、Sos均可被正反馈磷酸化，这使得MAPK途径持续激活。

3.5 信号的交叉与整合

高等生物中，多种信号途径以网络形式组织起来。MAPK途径也不可避免地与其它信号系统相互作用，共同决定细胞的命运。 这种信号的交叉和整合可以发生在多个环节,试举几例说明：

3.5.1 与其它途径相互作用。 JAK-STAT途径(72)：它与MAPK两条途径在多个环节上存在交叉。 首先，JAK参与ERK途径起始激活。细胞因子受体激活后被JAK激酶磷酸化，它的SH2结构域与Shc结合，随之召集Ras，导致ERK途径起始。 其次，多种转录因子STAT的激活，需要MAPK的辅助作用。转录因子STAT1α、STAT3、STAT4C端均有可被MAPK磷酸化的底物保守序列“XPXSP”模序。而且实验证实STAT在酪氨酸磷酸化之外，还需丝氨酸、苏氨酸磷酸化方可完全激活。关于MAPK激活STAT的具体机制，人们提出了两种模型：ERK激活后入核磷酸化STAT，有些ERK激活后结合于受体磷酸化胞质STAT分子（见图六）。

图六 ERK途径对JAK-STAT途径的激活 图七 ERK途径对PKA途径的激活

PKA途径：ERK途径与cAMP依赖的PKA途径的相互作用也非常复杂，涉及多个方面。 PKA途径可通过对Raf-1活性的抑制阻止ERK途径激活。最近的研究发现，PKA正是通过这种方式抑制了T细胞中IL-2受体α亚基的表达和IL-2产生，从而影响了T细胞激活(73)。 PKA可以磷酸化ERK途径上游分子（如Raf-1、B-Raf），以及Raf激活因子（PKC、Src等等），还可以竞争Ras·GTP，通过多种方式，抑制ERK途径活性(74)。 精母细胞中，PDGF诱导的ERK途径的激活，使细胞自分泌前列腺素E2，与胞膜受体结合后，激活PKA途径，抑制细胞增殖。这样，ERK途径通过激活PKA途径，发挥了生长抑制作用(75)。（见图七） 特定的细胞类型中，在一些情况下，PKA却可以激活ERK途径。此外，PKA途径对JNK途径、p38途径也均发现有抑制作用(74)。总而言之，MAPK途径与PKA途径的相互作用与细胞类型、信号途径成员、PKA靶分子胞内定位、协同作用的刺激信号等多种因素密切相关。

PI3-激酶途径：最近的研究表明，在肌肉细胞的分化过程中，PI-3激酶可能参与了对p38途径的调节(76)。 Ca²通路：ERK、JNK、p38途径均可被钙调素依赖的激酶IV激活。而JNK对NF-AT4的磷酸化失活则体现了JNK途径在某种程度上对Ca2+引发的信号途径的拮抗。 激素信号：ERK通过磷酸化雌激素受体118位丝氨酸，参与了雌激素诱导的信号途径(77)。 当然，目前发现最多的情况是MAPK途径与其它途径协同，共同调节基因表达。最近发现ERK途径与NF-κB途径都参与了IL-1诱导的胶原酶-1的转录激活(71)。

3.5.2 MAPK途径之间相互作用 MAPK途径之间的协同： 最好的例子是以m1蕈毒作用受体为代表的一大类G蛋白偶联受体，可以同时介导几乎所有已知MAPK途径：ERK途径、JNK途径、p38途径、ERK5途径。这些途径互相协同，通过分别作用于转录因子c-Jun启动子区不同的反应元件，调节了基因的转录(78)。 同时，一些配体在激活一条MAPK途径的同时，抑制了另一条的活性，使MAPK途径协同实现其特异性调节。例如胶质成熟因子被受c-AMP调节的PKA磷酸化后，特异性增强了p38激酶的活性，但同时，它也变成了一个ERK激酶的强抑制因子，抑制了ERK通路激活(79)。 上游信号的交叉：途径上游分子的交叉激活是最好的例证，在此不再鏊述。

下游信号的整合：体现在不同的MAPK途径可以同时作用于相同的底物。 胞质底物：ERK、p38均可激活MNK1（MAPK信号整合激酶）(80)、MSK1(81)。三者均可激活MAPKAPK3（MAPK途径激活的蛋白激酶）(82)。 核内底物：许多转录因子都可以被一条以上的MAPK途径调节。如前文提到的Elk-1可以被ERK、JNK、p38三条途径激活。ATF-2可以被p38途径和JNK途径激活(83)(84)。c-Jun可被JNK和ERK途径激活等等(85)。 总而言之，单独一条MAPK如果不放在细胞的整体环境中考虑，是很难阐述其功能的。途径中任何一个反应的发生，都依赖于特定的细胞环境。这也是将来的研究重点。

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The ever evolving mitogen-activated protein kinase (MAP kinase) pathways consist of four major groupings and numerous related proteins which constitute interrelated signal transduction cascades activated by stimuli such as growth factors, stress, cytokines and inflammation. The four major groupings are the Erk (red), JNK or SAPK (blue), p38 (green) and the Big MAPK or ERK5 (light blue) cascades. Signals from cell surface receptors such as GPCRs and growth factor receptors are transduced, directly or via small G proteins such as ras and rac, to multiple tiers of protein kinases that amplify these signals and/or regulate each other. The diagram is organized to illustrate the cascades by the background colors and also the tiers of kinases as indicated down the left hand side and separated by the horizontal dashed lines. In some cascades the first activation tier involves the MAPKKKKs, MAP kinase kinase kinase kinases or MAP4K proteins. The next tier are the serine/threonine MAPKKKs, MAP kinase kinase kinase or MAP3Ks such as RAF, TAK, ASK, and MEKK1. This level has the greatest amount of cross-communication curently known. The serine/threonine/tyrosine MAPKKs, MAP Kinase kinases or MAP2Ks, such as the MKK and MEK kinases, are one step up from the MAP kinase cascade, phosphorylating and activating these kinases. The focal tier, the MAPKs or MAP kinases includes JNK1, p38, and ERKs, and are the kinases that give each cascade its name BR>The endpoints of these cascades, shown in the bottom tier, includes the MAPK activated protein kinases (MAPKAPK) and some of the numerous transcription factors that regulate genes involved in apoptosis, inflammation, cell growth and differentiation NOTES:- The shared color and the bold arrows show the major flow of each cascade. - The smaller arrows indicate cross communication between cascades. In many cases this is restricted to certain cell types or requires additional factors. - Kinases that have been identified as MAP kinases based on sequence or structural homolgies but have not yet been assigned to a cascade have been placed out side the grouping backrgounds. - The PAKs (p21 associated kinases) are not MAPKs but participate in the transduction to the JNK cascade are included for this reason.) - MEK4 appears to function in both the JNK and p38 cascades and so has a mixed color. MEK4 signal is much stronger in the JNK than the p38 cascade and so the bold arrow towards the JNK and the dashed arrow towards the p38 cascade indicate the relative strengths of signaling. - For space and readability concerns not all interactions and stimuli are indicated and the scaffold and phosphatase proteins are not shown.