中财网云朝暮雨空凉的城番外:腹水病 (Virulent ascitesosis disease)和溃烂病(Ulcer disease)致 病病原 四联疫苗制备及 免 疫 牙 鲆 效 果 评 价
来源：百度文库 编辑：中财网 时间：2024/05/09 03:55:20
腹水病 (Virulent ascitesosis disease)和溃烂病
(Ulcer disease)致 病病原 四联疫苗制备
及 免 疫 牙 鲆 效 果 评 价
王 雪 惠 耿 绪 云 孙 金 生
(天津市水产养殖病害防治中心 ) (天津师范大学化学与生命科学学院)
中国天津市河西区解放南路442号 邮编：300221 中国天津市 邮编：300387
【提要 】 腹水病和溃烂病是海水工厂化养殖牙鲆(Paralichthys olivaceus)危害严重的疾病。作者用本实验室分离鉴定的腹
水病 、溃烂病致病菌一迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda，Et)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus，Va1)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas
salmonicida，As)和同行实验室赠予的鳗弧菌(I~brio anguillarum，Van)制备灭活菌苗 ，设计四种不同配比四联疫苗，按正交试验
要求 ，分别腹腔注射接种免疫牙鲆，检测单抗原抗体效价，统计分析筛选出组合合理的四联疫苗，配比为Et：Val：Van：As=2：l：
l：2，并进行了疫苗安全性、稳定性评价及免疫牙鲆效果观察。发现该四联疫苗是安全的，稳定的，可在4oC下存放 1年以上活性
不降低 ，能有效刺激牙鲆特异性免疫系统产生免疫应答，免疫后7天血清抗体效价明显升高，免疫后 14 d血清抗体效价达到最高
水平 ，为2 ；人工攻毒试验测定相对免疫保护率为60％。表明，筛选出的牙鲆腹水病和溃烂病四联疫苗安全有效，可同时预防腹
水病 、溃烂病 的发生和流行。
王雪惠等，2008。腹水病(Virulent aseitesosis disease)和溃烂病(Ulcer disease)致病病原四联疫苗制备及免疫牙
鲆效果评价 ，《现代渔业信息》杂志，23(11)：16—20。
关键词：牙鲆 腹水病 溃烂病 四联疫苗 免疫评价 腹水病和溃烂病是海水工厂化养殖牙鲆中危害严重的
两种细菌病，腹水病能感染养殖牙鲆的各个阶段，患病鱼肝
脏、肾脏肿大，腹部膨胀并充满微黄泛红粘稠的液体，发病
率高达40％，死亡率达到了70％。患溃烂病鱼体表不同程度
出现创伤 ，创伤面积大小不同，分布在身体的多处，发病率
达30％，死亡率为 20％。天津地区每年因腹水病、溃烂病造
成的经济损失占到海水工厂化养殖鱼类全部病害损失的70％
以上，目前尚无有效的针对这两种病的治疗方法和药物，造
成了严重的经济损失，阻碍了海水工厂化养殖业的发展。
传统的方式是利用化学药物和抗生素来控制病害的泛
滥，但长期使用带来的耐药性、药物残留和对生态环境造成
的破坏以及由此引发的食品安全和环境保护等方面的严重
问题，免疫 防治技术在病害防治中的应用已越来越受到重 视。从D·lfr¨发明了世界上第一个渔用疫苗以来，至今国外
已有迟缓爱德华氏菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、杀鲑气单胞菌的
细菌疫苗，鳗弧菌一杀鲑气单胞菌二联疫苗，气单胞菌一鳗
弧菌 一杀鲑弧菌菌苗商品化疫苗 ，我国的草鱼出血病疫苗
和嗜水气单胞菌苗获得国家新兽药证书，但未能实现真正意
义上的生产应用，与发达国家相比存在较大差距，目前国际
上已商品化的渔用疫苗有20多种，渔用疫苗的使用已使挪
威鲑鱼产量由1987年的4．6万t上升到 29．2万t，而抗生素的
使用量降低到 1．03 kg，提高了养殖鱼类的品质，基本达到健
康养殖要求 』。可见通过免疫加强动物自身免疫功能，提高
抗病能力，有效防治病害，是今后防治鱼病最为有效的途径。
我们通过对天津地区腹水病和溃烂病病因调查和致
病病原的分离鉴定，发现天津地区海水工厂化养殖牙鲆、
石斑鱼腹水病和溃烂病致病病原分别是迟缓爱德华 氏菌
(Edwardsiella tarda，Et)、溶 藻 弧 菌(V~brio alginolyticus，
Va1)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida，As)，由于 由
多种细菌致病，因此，急需研制多联菌苗，同时防治危害
严重的腹水病和溃烂病。用本实验室从患病牙鲆、石斑鱼
分离到的迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda，Et)、溶藻弧 菌(Vibrio alginolyticus， 、杀鲑气单胞菌(Aeromonas
salmonicida，As)和同行实验室赠予的由山东地区养殖牙鲆
分离的溃烂病病原菌一鳗弧菌(Pibrio anguillarum，Van) ，
借鉴弧菌与杀鲑气单胞菌二联及三联苗成功制备的经验，
制备了迟缓爱德华氏菌 一溶藻弧菌一鳗弧菌 一杀鲑气单胞菌
(Et—Val—Van—As)四联疫苗，以不同抗原免疫产生的抗体效
价是否都能达到较高水平和峰值持续时间为指标 ，筛选出
组合合理的四联疫苗 ，用筛选出的四联疫苗腹腔注射免疫
牙鲆进行免疫效果评价，发现筛选出的四联疫苗能安全高
效的同时预防腹水病和溃烂病的发生，为建立高效的海水
工厂化养殖鱼类免疫防治技术做了有益探索。
1 材料与方法
1．1试验鱼
试验鱼取 自天津市海发珍品实业发展有限公司海水工
厂化养殖牙鲆，体重为 10±2 g。置室内驯养一周后 ，选取
健康 、摄食正常的牙鲆220尾用于四联疫苗筛选、四联疫苗
免疫接种及效果评价试验。试验在恒温循环水族系统中进
行。试验期间，每天早晚各投喂人工配合饲料一次，根据水
位变化加注新水。养殖水温22±1℃，盐度25‰ ～28‰ ，pH
8．2～8．6。
1．2 试验用四联疫苗的制备
1．2．1 菌苗灭活和四联疫苗的配制
迟缓爱德华氏菌、溶藻弧菌和杀鲑气单胞菌是本实验
室分离鉴定的腹水病和溃烂病的致病菌，鳗弧菌由中科院
海洋研究所莫照兰教授惠赠。采用普通营养琼脂平板扩大
培养上述四种菌。35℃恒温培养48 h后，用无菌生理盐水洗
脱。经 0．5％甲醛28℃灭活48 h后，再分别用无菌生理盐水
洗涤2次，以去除甲醛。用无菌生理盐水调整浓度至 3×10
CFU／mL，即得四种单苗母液。参照《中国生物制品规程》中
的《生物制品无菌试验规程》进行了四种单苗母液的无菌检
测。四种菌苗按照适宜比例混合均匀即为四联疫苗。 +
1．2．2 筛选组合合理的四联疫苗
由于联合疫 苗抗原间易发生抗原竞争，各单苗的比例尤
为重要。为此我们按照正交表 (2 )设计 了四种配比的四
联疫苗(表 1)，把溶藻弧菌和鳗弧菌单苗母液等体积混匀作
为一种单苗母液看待，弧菌(V)总浓度依然是3 X 10。。三因
素分别为迟缓爱德华氏菌苗(Et)、弧菌苗(v)和杀鲑气单
胞菌苗(As)，两水平设为 1 X 10 CFU／mL和2×10 CFU／mL。 选取健康牙鲆 120尾，随机分成4组，分别腹腔注射接
种相应配比四联疫苗，7天后再注射一次，正常条件下养殖。
分别在初次注射后3 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42
d、49 d随机取3尾鱼，尾静脉采血制备免疫血清。应用改良
的微量凝集法，分别用 四种单苗(3 X 10 cFu，mL)做抗原，
测定各血清样品的单抗原抗体效价。统计分析不同因素、不
同水平抗原抗体效价，筛选出最佳组合的四联疫苗。
1_3 组合合理的四联疫苗安全性及稳定性试验
参照《中国生物制品规程》中的《伤寒、副伤寒甲、乙三
联菌苗制造及检定规程》对筛选出的四联疫苗进行安全性检
验。用10倍浓度即3×109CFU／mL腹腔注射健康牙鲆10尾，
注射剂量 0．1 mid尾，对照组 10尾，注射同等体积的无菌生
理盐水，连续观察 1O天 ，看试验鱼是否有死亡及异常状况
出现。
在稳定性试验 中，用本试验室制备的多克隆抗体检测
四联疫苗抗原的免疫反应性，从而间接的反映抗原的免疫
原性。四联疫苗在室温(25 oC)、4℃分别存放2个月、12个
月后 ，能很好的与抗体发生凝集反应。在4~C避光存放，稳
定性良好，保存 l2个月，其抗原活性不降低。
1．4 四联疫苗免疫接种牙鲆及效果评价
选取健康牙鲆 80尾，随机分成2组，免疫组腹腔注射接
种筛选出的四联疫苗，接种剂量为0．1 mL／尾 ，对照组腹腔
注射同等体积的无菌生理盐水，7天后同样方法加强免疫一
次，正常条件下养殖。
1．4．1 抗体效价测定
抗体效价是疫苗免疫效果评价的重要指标，采用改进
的微量凝集法 以四联疫苗为抗原进行免疫后不同时间抗
体效价的测定 ，血清制备及采血时间同1．2．2。
1．4．2 攻毒实验
初免后49 d四联疫苗免疫组及对照组进行人工攻毒实
验，每组各取 10尾，用培养48h以内的四种活菌，比例为Et：
Val：Van：As=2：1：1：2，菌悬液总浓度为3 X 10 CFU／mL，每
尾腹腔注射50 ，正常条件养殖，记录各组发病及死亡情况，
计算四联疫苗免疫组的免疫保护率 。
2 结果
2．1 四联疫苗的筛选
制备联合疫苗时要考虑抗原之间的相互作用，保证每
种抗原 的有效性。采用微量凝集法，分别以四种单苗为抗
原检测四种配 比疫苗注射组不同时间的抗体效价 ，记录于
表2，并绘制单抗原抗体效价消长曲线(图 1～图4)。发现注
射四种配比各组鱼均在注射后7 d检测到抗四种抗原的抗体
产生，但注射不同配比各组单抗原抗体效价达到最高水平
及在最高水平持续的时间不同：注射配比 1组在注射后3-4
周抗四种抗原的抗体效价达到最高水平，为2 ；注射配比
2组在注射后2～3周抗四种抗原的抗体效价达到最高水平，
抗Et和Van的抗体效价最高达到2 ，抗Val和As的抗体效 价最高分别为2 和2。；注射配比3、4组在注射后3周抗Et、
Val、Van抗体能达到较高水平 ，为 。，持续时间不到 1周 ，
抗As的抗体效价较低，只能达到2 ，可见这两组配比疫苗
不能高效的刺激鱼体产生抗 As抗体。同时又按照正交表进
行数据分析(表2)，发现 ：Et两个浓度水平都能刺激抗体效
价达到最高水平，V包括Val和Van两种抗原，浓度水平为
1时产生的抗体效价高于浓度为2时产生的抗体效价 ，As不
同浓度水平的抗体效价差异较大，浓度水平为1的抗体效价
较高。因此最佳组合配比为Et：Val：Van：As=2：1：1：2，抗
四种抗原抗体效价都能达到2 ，抗体稳定表达时间最长。
安全性、稳定性试验结果表明：该四联疫苗是安全的，
十倍浓度注射牙鲆未出现异常及死亡；稳定性良好，25℃
存放2个月，4℃存放 l2个月，分别检测发现抗原活性不降
低，能很好的与抗体发生凝集反应，抗体效价在 1：512水平
上，符合渔用疫苗实用性要求。 2．2 四联疫苗免疫牙鲆效果评价
2．2．1 四联疫苗免疫牙鲆血清抗体效价
抗体效价水平是特异性免疫的重要指标。用筛选出的
四联疫苗(Et：Val：Van：As=2：1：1：2)腹腔注射接种免疫
牙鲆，并在初免后7 d加强免疫一次。采用微量凝集法，以
四联疫苗为抗原检测不同免疫时间血清的抗体效价，绘制
抗体消长曲线 (图5)：对照组的抗体效价水平处在基底水
平，在24—2 水平上；免疫组鱼在初免后7 d即检测到抗体效
价升高，加强免疫后 ，抗体效价水平持续升高，在初免后 14
d达到最高水平，为2 ，并且持续至少两周的时间，之后缓
慢下降，在初免后49 d仍能检测到较高的抗体效价 ，在2 水
平上。可见四联疫苗能有效的刺激鱼体的特异性免疫系统，
产生特异性抗体。 2．2．2 四联疫苗免疫保护率
四联疫苗免疫组和对照组在免疫后49 d进行腹腔注射
攻毒，攻毒后，对照组鱼反应敏感，很快出现腹水、溃烂症
状，腹部膨胀充满积液，体表多处溃烂，并在攻毒后2 d出
现死亡，之后持续发病致死 ，攻毒后 10 d全部死亡；疫苗 免疫组在攻毒后表现游动不活跃，食欲减退，摄食不积极或
根本不摄食，2 d恢复正常摄食，攻毒后 6 d出现死亡。至对
照组全部死亡时，免疫组有6尾鱼存活，存活鱼未出现任何
病症，免疫保护率达 60％，详见表3。应用我们研制的双重
PCR检测试剂盒对死亡鱼进行腹水病病原菌检测，同时检
测到迟缓爱德华氏菌 、溶藻弧菌。应用微生物学细菌分离方
法，从发病鱼肝、肾、脾、腹水中再次分离到迟缓爱德华氏
菌、溶藻弧菌、鳗弧菌和杀鲑气单胞菌。证明试验鱼死亡是
由于病原菌的致病作用 ，而非其它原因。 3 讨论
在天津地区开展海水工厂化养殖鱼类疾病 的流行病
学调查 ，发现腹水病和溃烂病是天津地区海水工厂化养殖
鱼类危害严重的疾病，所造成的经济损失占全部病害损失
的70％以上。天津地区海水工厂化养殖鱼类腹水病的致病
菌是迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda，Et)和溶藻弧菌
(Hbrio alginolyticus，Va1)，其中迟缓爱德华氏菌是海水中的
常在菌，在各地养殖的患腹水病鲆鱼中均被分离到，溶藻弧
菌则是首次被分离鉴定为鲆鱼腹水病的致病菌，杀鲑气单
胞菌(Aeromonas salmonicida，As)是从天津地区海水养殖
鱼类溃烂病的致病菌，鳗弧菌(Hbrio anguillarum，Van)是
莫照兰教授从山东地区患溃烂病牙鲆病灶处分离的致病菌，
是海水工厂化养殖的重要致病菌，为此我们将其列为重点
防疫的病原菌之一。为有效预防腹水病、溃烂病的发生和流
行，结合北方地区海水养殖鱼类腹水病和溃烂病的主要致
病菌，本着既有针对性，又有广普性的原则，本实验室针对
这两种病的四种主要致病菌进行了四联疫苗的制备和筛选，
并免疫牙鲆，进行免疫效果评价。
在制备联合疫苗时，应尽量避免抗原间的竞争作用，
保证每种抗原都充分发挥免疫作用 ，提高联合疫苗免疫效
率，因此必须考虑联合疫苗抗原组合的合理性。Amend和
Johnson 早在 1984年用鳗弧菌、鲁氏耶尔森菌、杀鲑气单
胞菌、鲑肾杆菌联合免疫鲑鱼时没有发生抗原竞争现象，可
见选择合适的多种菌制备成多联疫苗使用完全可能。为了
筛选出四联疫苗的最佳配比，保证四种抗原不发生抗原竞争
作用，我们设计了三因素、两水平正交试验，采用微量凝集
法，检测四种不同配比多联苗注射免疫牙鲆后血清单抗原抗
体效价，对试验数据统计分析发现：三因素(Et、V、As)都 是水平 1效果好 ，即三因素的浓度水平均为1×10 CFU／mL。
通过比较四种配 比单抗原抗体效价，发现 Et的浓度水平及
在多联苗中所占比例对抗 Et抗体效价影响不大，都能达到
较高水平 2 ；抗V(Val&Van)抗体效价水平与浓度水平有
关 ，设计的低浓度水平更能有效的刺激鱼体产生相应抗体 ；
多联苗中As随着所占比例的不同，抗体效价水平变化较大，
因而对四联疫苗配比合理性影响最大，抗As抗体效价水平
随着 As所占比例的增加而增加，当As所 占比例为 1／3时As
抗体效价水平达最高 ，为2 。综上分析，配比1四联疫苗四
种单抗原都能有效的刺激机体产生免疫应答 ，大量表达相
应抗体 ，抗体效价都能达到2 水平，峰值可稳定 2周以上，
是组合合理的四联疫苗。
该四联疫苗经过无菌检测和安全性检验，证明四联疫
苗是安全的。经稳定性试验证明，疫苗在4~C存放至少 1年，
免疫反应性不降低，可间接证明疫苗免疫原性保持 良好。可
见我们制备筛选的四联疫苗是安全、稳定的。
采用腹腔注射免疫的接种方式，用筛选出的四联疫苗免
疫牙鲆，通过检测抗体效价水平和免疫保护率来评价四联疫
苗免疫效果。抗体效价是特异性免疫效果评价的重要指标。
采用微量凝集法检测四联疫苗(Et：Val：Van：As=2：1：1：2)
免疫牙鲆后血清的综合抗体效价，免疫组在初免7 d检测到
抗体效价的升高，并持续上升，在初免 14 d达到最高水平，
并持续至少两周的时间，之后抗体效价水平缓慢下降，在初
免后49 d仍能检测到较高的抗体效价 2 。可见四联疫苗能
快速、持久、稳定有效的激发特异性免疫应答。免疫保护率
是评价疫苗有效性的最有力指标，在初免后49 d疫苗免疫
组和对照组进行人工攻毒实验，对照组很快出现腹水、溃烂
症状 ，并出现死亡，攻毒后 10 d全部死亡；免疫组有未出现
任何症状的正常鱼，至对照组鱼全部死亡时，免疫组有40％
的死亡率。从发病鱼体 中均再次分离到用于攻毒的四种致
病菌，证明死亡个体是由病原菌致死。攻毒实验测得四联疫
苗免疫组的免疫保护率为6o％，说明该四联疫苗可同时有
效的防治养殖牙鲆腹水病、溃烂病。
综上所述，Et：Val：Van：As=2：1：1：2配比，总浓度为
3×10 CFU／mL的四联疫苗抗原间没有竞争作用，可同时高
效的作用于鱼体免疫器官，产生良好的免疫应答，抗体效价
高达2 ，有效的保护鱼体抵抗四种病原菌的同时感染 ，免疫
保护率60％是有效的防治腹水病和溃烂病的高效四联疫苗。
参考文献 略
(Ulcer disease)致 病病原 四联疫苗制备
及 免 疫 牙 鲆 效 果 评 价
王 雪 惠 耿 绪 云 孙 金 生
(天津市水产养殖病害防治中心 ) (天津师范大学化学与生命科学学院)
中国天津市河西区解放南路442号 邮编：300221 中国天津市 邮编：300387
【提要 】 腹水病和溃烂病是海水工厂化养殖牙鲆(Paralichthys olivaceus)危害严重的疾病。作者用本实验室分离鉴定的腹
水病 、溃烂病致病菌一迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda，Et)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus，Va1)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas
salmonicida，As)和同行实验室赠予的鳗弧菌(I~brio anguillarum，Van)制备灭活菌苗 ，设计四种不同配比四联疫苗，按正交试验
要求 ，分别腹腔注射接种免疫牙鲆，检测单抗原抗体效价，统计分析筛选出组合合理的四联疫苗，配比为Et：Val：Van：As=2：l：
l：2，并进行了疫苗安全性、稳定性评价及免疫牙鲆效果观察。发现该四联疫苗是安全的，稳定的，可在4oC下存放 1年以上活性
不降低 ，能有效刺激牙鲆特异性免疫系统产生免疫应答，免疫后7天血清抗体效价明显升高，免疫后 14 d血清抗体效价达到最高
水平 ，为2 ；人工攻毒试验测定相对免疫保护率为60％。表明，筛选出的牙鲆腹水病和溃烂病四联疫苗安全有效，可同时预防腹
水病 、溃烂病 的发生和流行。
王雪惠等，2008。腹水病(Virulent aseitesosis disease)和溃烂病(Ulcer disease)致病病原四联疫苗制备及免疫牙
鲆效果评价 ，《现代渔业信息》杂志，23(11)：16—20。
关键词：牙鲆 腹水病 溃烂病 四联疫苗 免疫评价 腹水病和溃烂病是海水工厂化养殖牙鲆中危害严重的
两种细菌病，腹水病能感染养殖牙鲆的各个阶段，患病鱼肝
脏、肾脏肿大，腹部膨胀并充满微黄泛红粘稠的液体，发病
率高达40％，死亡率达到了70％。患溃烂病鱼体表不同程度
出现创伤 ，创伤面积大小不同，分布在身体的多处，发病率
达30％，死亡率为 20％。天津地区每年因腹水病、溃烂病造
成的经济损失占到海水工厂化养殖鱼类全部病害损失的70％
以上，目前尚无有效的针对这两种病的治疗方法和药物，造
成了严重的经济损失，阻碍了海水工厂化养殖业的发展。
传统的方式是利用化学药物和抗生素来控制病害的泛
滥，但长期使用带来的耐药性、药物残留和对生态环境造成
的破坏以及由此引发的食品安全和环境保护等方面的严重
问题，免疫 防治技术在病害防治中的应用已越来越受到重 视。从D·lfr¨发明了世界上第一个渔用疫苗以来，至今国外
已有迟缓爱德华氏菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、杀鲑气单胞菌的
细菌疫苗，鳗弧菌一杀鲑气单胞菌二联疫苗，气单胞菌一鳗
弧菌 一杀鲑弧菌菌苗商品化疫苗 ，我国的草鱼出血病疫苗
和嗜水气单胞菌苗获得国家新兽药证书，但未能实现真正意
义上的生产应用，与发达国家相比存在较大差距，目前国际
上已商品化的渔用疫苗有20多种，渔用疫苗的使用已使挪
威鲑鱼产量由1987年的4．6万t上升到 29．2万t，而抗生素的
使用量降低到 1．03 kg，提高了养殖鱼类的品质，基本达到健
康养殖要求 』。可见通过免疫加强动物自身免疫功能，提高
抗病能力，有效防治病害，是今后防治鱼病最为有效的途径。
我们通过对天津地区腹水病和溃烂病病因调查和致
病病原的分离鉴定，发现天津地区海水工厂化养殖牙鲆、
石斑鱼腹水病和溃烂病致病病原分别是迟缓爱德华 氏菌
(Edwardsiella tarda，Et)、溶 藻 弧 菌(V~brio alginolyticus，
Va1)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida，As)，由于 由
多种细菌致病，因此，急需研制多联菌苗，同时防治危害
严重的腹水病和溃烂病。用本实验室从患病牙鲆、石斑鱼
分离到的迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda，Et)、溶藻弧 菌(Vibrio alginolyticus， 、杀鲑气单胞菌(Aeromonas
salmonicida，As)和同行实验室赠予的由山东地区养殖牙鲆
分离的溃烂病病原菌一鳗弧菌(Pibrio anguillarum，Van) ，
借鉴弧菌与杀鲑气单胞菌二联及三联苗成功制备的经验，
制备了迟缓爱德华氏菌 一溶藻弧菌一鳗弧菌 一杀鲑气单胞菌
(Et—Val—Van—As)四联疫苗，以不同抗原免疫产生的抗体效
价是否都能达到较高水平和峰值持续时间为指标 ，筛选出
组合合理的四联疫苗 ，用筛选出的四联疫苗腹腔注射免疫
牙鲆进行免疫效果评价，发现筛选出的四联疫苗能安全高
效的同时预防腹水病和溃烂病的发生，为建立高效的海水
工厂化养殖鱼类免疫防治技术做了有益探索。
1 材料与方法
1．1试验鱼
试验鱼取 自天津市海发珍品实业发展有限公司海水工
厂化养殖牙鲆，体重为 10±2 g。置室内驯养一周后 ，选取
健康 、摄食正常的牙鲆220尾用于四联疫苗筛选、四联疫苗
免疫接种及效果评价试验。试验在恒温循环水族系统中进
行。试验期间，每天早晚各投喂人工配合饲料一次，根据水
位变化加注新水。养殖水温22±1℃，盐度25‰ ～28‰ ，pH
8．2～8．6。
1．2 试验用四联疫苗的制备
1．2．1 菌苗灭活和四联疫苗的配制
迟缓爱德华氏菌、溶藻弧菌和杀鲑气单胞菌是本实验
室分离鉴定的腹水病和溃烂病的致病菌，鳗弧菌由中科院
海洋研究所莫照兰教授惠赠。采用普通营养琼脂平板扩大
培养上述四种菌。35℃恒温培养48 h后，用无菌生理盐水洗
脱。经 0．5％甲醛28℃灭活48 h后，再分别用无菌生理盐水
洗涤2次，以去除甲醛。用无菌生理盐水调整浓度至 3×10
CFU／mL，即得四种单苗母液。参照《中国生物制品规程》中
的《生物制品无菌试验规程》进行了四种单苗母液的无菌检
测。四种菌苗按照适宜比例混合均匀即为四联疫苗。 +
1．2．2 筛选组合合理的四联疫苗
由于联合疫 苗抗原间易发生抗原竞争，各单苗的比例尤
为重要。为此我们按照正交表 (2 )设计 了四种配比的四
联疫苗(表 1)，把溶藻弧菌和鳗弧菌单苗母液等体积混匀作
为一种单苗母液看待，弧菌(V)总浓度依然是3 X 10。。三因
素分别为迟缓爱德华氏菌苗(Et)、弧菌苗(v)和杀鲑气单
胞菌苗(As)，两水平设为 1 X 10 CFU／mL和2×10 CFU／mL。 选取健康牙鲆 120尾，随机分成4组，分别腹腔注射接
种相应配比四联疫苗，7天后再注射一次，正常条件下养殖。
分别在初次注射后3 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42
d、49 d随机取3尾鱼，尾静脉采血制备免疫血清。应用改良
的微量凝集法，分别用 四种单苗(3 X 10 cFu，mL)做抗原，
测定各血清样品的单抗原抗体效价。统计分析不同因素、不
同水平抗原抗体效价，筛选出最佳组合的四联疫苗。
1_3 组合合理的四联疫苗安全性及稳定性试验
参照《中国生物制品规程》中的《伤寒、副伤寒甲、乙三
联菌苗制造及检定规程》对筛选出的四联疫苗进行安全性检
验。用10倍浓度即3×109CFU／mL腹腔注射健康牙鲆10尾，
注射剂量 0．1 mid尾，对照组 10尾，注射同等体积的无菌生
理盐水，连续观察 1O天 ，看试验鱼是否有死亡及异常状况
出现。
在稳定性试验 中，用本试验室制备的多克隆抗体检测
四联疫苗抗原的免疫反应性，从而间接的反映抗原的免疫
原性。四联疫苗在室温(25 oC)、4℃分别存放2个月、12个
月后 ，能很好的与抗体发生凝集反应。在4~C避光存放，稳
定性良好，保存 l2个月，其抗原活性不降低。
1．4 四联疫苗免疫接种牙鲆及效果评价
选取健康牙鲆 80尾，随机分成2组，免疫组腹腔注射接
种筛选出的四联疫苗，接种剂量为0．1 mL／尾 ，对照组腹腔
注射同等体积的无菌生理盐水，7天后同样方法加强免疫一
次，正常条件下养殖。
1．4．1 抗体效价测定
抗体效价是疫苗免疫效果评价的重要指标，采用改进
的微量凝集法 以四联疫苗为抗原进行免疫后不同时间抗
体效价的测定 ，血清制备及采血时间同1．2．2。
1．4．2 攻毒实验
初免后49 d四联疫苗免疫组及对照组进行人工攻毒实
验，每组各取 10尾，用培养48h以内的四种活菌，比例为Et：
Val：Van：As=2：1：1：2，菌悬液总浓度为3 X 10 CFU／mL，每
尾腹腔注射50 ，正常条件养殖，记录各组发病及死亡情况，
计算四联疫苗免疫组的免疫保护率 。
2 结果
2．1 四联疫苗的筛选
制备联合疫苗时要考虑抗原之间的相互作用，保证每
种抗原 的有效性。采用微量凝集法，分别以四种单苗为抗
原检测四种配 比疫苗注射组不同时间的抗体效价 ，记录于
表2，并绘制单抗原抗体效价消长曲线(图 1～图4)。发现注
射四种配比各组鱼均在注射后7 d检测到抗四种抗原的抗体
产生，但注射不同配比各组单抗原抗体效价达到最高水平
及在最高水平持续的时间不同：注射配比 1组在注射后3-4
周抗四种抗原的抗体效价达到最高水平，为2 ；注射配比
2组在注射后2～3周抗四种抗原的抗体效价达到最高水平，
抗Et和Van的抗体效价最高达到2 ，抗Val和As的抗体效 价最高分别为2 和2。；注射配比3、4组在注射后3周抗Et、
Val、Van抗体能达到较高水平 ，为 。，持续时间不到 1周 ，
抗As的抗体效价较低，只能达到2 ，可见这两组配比疫苗
不能高效的刺激鱼体产生抗 As抗体。同时又按照正交表进
行数据分析(表2)，发现 ：Et两个浓度水平都能刺激抗体效
价达到最高水平，V包括Val和Van两种抗原，浓度水平为
1时产生的抗体效价高于浓度为2时产生的抗体效价 ，As不
同浓度水平的抗体效价差异较大，浓度水平为1的抗体效价
较高。因此最佳组合配比为Et：Val：Van：As=2：1：1：2，抗
四种抗原抗体效价都能达到2 ，抗体稳定表达时间最长。
安全性、稳定性试验结果表明：该四联疫苗是安全的，
十倍浓度注射牙鲆未出现异常及死亡；稳定性良好，25℃
存放2个月，4℃存放 l2个月，分别检测发现抗原活性不降
低，能很好的与抗体发生凝集反应，抗体效价在 1：512水平
上，符合渔用疫苗实用性要求。 2．2 四联疫苗免疫牙鲆效果评价
2．2．1 四联疫苗免疫牙鲆血清抗体效价
抗体效价水平是特异性免疫的重要指标。用筛选出的
四联疫苗(Et：Val：Van：As=2：1：1：2)腹腔注射接种免疫
牙鲆，并在初免后7 d加强免疫一次。采用微量凝集法，以
四联疫苗为抗原检测不同免疫时间血清的抗体效价，绘制
抗体消长曲线 (图5)：对照组的抗体效价水平处在基底水
平，在24—2 水平上；免疫组鱼在初免后7 d即检测到抗体效
价升高，加强免疫后 ，抗体效价水平持续升高，在初免后 14
d达到最高水平，为2 ，并且持续至少两周的时间，之后缓
慢下降，在初免后49 d仍能检测到较高的抗体效价 ，在2 水
平上。可见四联疫苗能有效的刺激鱼体的特异性免疫系统，
产生特异性抗体。 2．2．2 四联疫苗免疫保护率
四联疫苗免疫组和对照组在免疫后49 d进行腹腔注射
攻毒，攻毒后，对照组鱼反应敏感，很快出现腹水、溃烂症
状，腹部膨胀充满积液，体表多处溃烂，并在攻毒后2 d出
现死亡，之后持续发病致死 ，攻毒后 10 d全部死亡；疫苗 免疫组在攻毒后表现游动不活跃，食欲减退，摄食不积极或
根本不摄食，2 d恢复正常摄食，攻毒后 6 d出现死亡。至对
照组全部死亡时，免疫组有6尾鱼存活，存活鱼未出现任何
病症，免疫保护率达 60％，详见表3。应用我们研制的双重
PCR检测试剂盒对死亡鱼进行腹水病病原菌检测，同时检
测到迟缓爱德华氏菌 、溶藻弧菌。应用微生物学细菌分离方
法，从发病鱼肝、肾、脾、腹水中再次分离到迟缓爱德华氏
菌、溶藻弧菌、鳗弧菌和杀鲑气单胞菌。证明试验鱼死亡是
由于病原菌的致病作用 ，而非其它原因。 3 讨论
在天津地区开展海水工厂化养殖鱼类疾病 的流行病
学调查 ，发现腹水病和溃烂病是天津地区海水工厂化养殖
鱼类危害严重的疾病，所造成的经济损失占全部病害损失
的70％以上。天津地区海水工厂化养殖鱼类腹水病的致病
菌是迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda，Et)和溶藻弧菌
(Hbrio alginolyticus，Va1)，其中迟缓爱德华氏菌是海水中的
常在菌，在各地养殖的患腹水病鲆鱼中均被分离到，溶藻弧
菌则是首次被分离鉴定为鲆鱼腹水病的致病菌，杀鲑气单
胞菌(Aeromonas salmonicida，As)是从天津地区海水养殖
鱼类溃烂病的致病菌，鳗弧菌(Hbrio anguillarum，Van)是
莫照兰教授从山东地区患溃烂病牙鲆病灶处分离的致病菌，
是海水工厂化养殖的重要致病菌，为此我们将其列为重点
防疫的病原菌之一。为有效预防腹水病、溃烂病的发生和流
行，结合北方地区海水养殖鱼类腹水病和溃烂病的主要致
病菌，本着既有针对性，又有广普性的原则，本实验室针对
这两种病的四种主要致病菌进行了四联疫苗的制备和筛选，
并免疫牙鲆，进行免疫效果评价。
在制备联合疫苗时，应尽量避免抗原间的竞争作用，
保证每种抗原都充分发挥免疫作用 ，提高联合疫苗免疫效
率，因此必须考虑联合疫苗抗原组合的合理性。Amend和
Johnson 早在 1984年用鳗弧菌、鲁氏耶尔森菌、杀鲑气单
胞菌、鲑肾杆菌联合免疫鲑鱼时没有发生抗原竞争现象，可
见选择合适的多种菌制备成多联疫苗使用完全可能。为了
筛选出四联疫苗的最佳配比，保证四种抗原不发生抗原竞争
作用，我们设计了三因素、两水平正交试验，采用微量凝集
法，检测四种不同配比多联苗注射免疫牙鲆后血清单抗原抗
体效价，对试验数据统计分析发现：三因素(Et、V、As)都 是水平 1效果好 ，即三因素的浓度水平均为1×10 CFU／mL。
通过比较四种配 比单抗原抗体效价，发现 Et的浓度水平及
在多联苗中所占比例对抗 Et抗体效价影响不大，都能达到
较高水平 2 ；抗V(Val&Van)抗体效价水平与浓度水平有
关 ，设计的低浓度水平更能有效的刺激鱼体产生相应抗体 ；
多联苗中As随着所占比例的不同，抗体效价水平变化较大，
因而对四联疫苗配比合理性影响最大，抗As抗体效价水平
随着 As所占比例的增加而增加，当As所 占比例为 1／3时As
抗体效价水平达最高 ，为2 。综上分析，配比1四联疫苗四
种单抗原都能有效的刺激机体产生免疫应答 ，大量表达相
应抗体 ，抗体效价都能达到2 水平，峰值可稳定 2周以上，
是组合合理的四联疫苗。
该四联疫苗经过无菌检测和安全性检验，证明四联疫
苗是安全的。经稳定性试验证明，疫苗在4~C存放至少 1年，
免疫反应性不降低，可间接证明疫苗免疫原性保持 良好。可
见我们制备筛选的四联疫苗是安全、稳定的。
采用腹腔注射免疫的接种方式，用筛选出的四联疫苗免
疫牙鲆，通过检测抗体效价水平和免疫保护率来评价四联疫
苗免疫效果。抗体效价是特异性免疫效果评价的重要指标。
采用微量凝集法检测四联疫苗(Et：Val：Van：As=2：1：1：2)
免疫牙鲆后血清的综合抗体效价，免疫组在初免7 d检测到
抗体效价的升高，并持续上升，在初免 14 d达到最高水平，
并持续至少两周的时间，之后抗体效价水平缓慢下降，在初
免后49 d仍能检测到较高的抗体效价 2 。可见四联疫苗能
快速、持久、稳定有效的激发特异性免疫应答。免疫保护率
是评价疫苗有效性的最有力指标，在初免后49 d疫苗免疫
组和对照组进行人工攻毒实验，对照组很快出现腹水、溃烂
症状 ，并出现死亡，攻毒后 10 d全部死亡；免疫组有未出现
任何症状的正常鱼，至对照组鱼全部死亡时，免疫组有40％
的死亡率。从发病鱼体 中均再次分离到用于攻毒的四种致
病菌，证明死亡个体是由病原菌致死。攻毒实验测得四联疫
苗免疫组的免疫保护率为6o％，说明该四联疫苗可同时有
效的防治养殖牙鲆腹水病、溃烂病。
综上所述，Et：Val：Van：As=2：1：1：2配比，总浓度为
3×10 CFU／mL的四联疫苗抗原间没有竞争作用，可同时高
效的作用于鱼体免疫器官，产生良好的免疫应答，抗体效价
高达2 ，有效的保护鱼体抵抗四种病原菌的同时感染 ，免疫
保护率60％是有效的防治腹水病和溃烂病的高效四联疫苗。
参考文献 略