7k7k拳皇1.3:微酸性电生功能水对灰葡萄孢菌的杀灭效果研究

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微酸性电生功能水对灰葡萄孢菌的杀灭效果研究 冀盈盈，李保明，赵淑梅，周清，曹薇 （中国农业大学农业部设施农业工程重点开放实验室北京 100083） 摘 要：植物病害是引起植物品质下降和产量损失的主要原因之一。农药的滥用或不当使用，带来了严重的生态环境和食品安全问 题。由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers.: Fr.）引起的植物灰霉病是一种危害性很大的病害。本文旨在将微酸性电生功能水高效、无 污染、无残留和安全的杀菌特性替代化学农药应用于植物病害防治。主要研究了微酸性电生功能水（pH 6.0-6.5 ORP 750-850 mV 有 效氯浓度 21-59 mg/L）对灰葡萄孢菌的杀灭效果。考察了有效氯浓度、杀菌时间和处理温度对微酸性电生功能水杀菌效果的影响。结 果表明：微酸性电生功能水对灰葡萄孢菌具有较强的杀灭效果。有效氯浓度超过 31 mg/L 时，处理 30 s，杀菌率可以达到 99以上； 在 4、22 和 45℃下有效氯浓度为 40 mg/L 的微酸性电生功能水可使灰葡萄孢菌分别降低 2.18、2.88 和 4.72 log10 CFU/mL。 关键词：微酸性电生功能水；灰葡萄孢菌；杀菌 中图分类号：S129 用下，采用无隔膜电解方式电解稀盐或稀酸溶液而得到0 引 言 的具有特殊理化特性的水溶液。其 pH 值接近中性 植物病害是农业生产的大敌， 是引起植物品质下降、 ， （5.0-6.5） 有效氯几乎完全以杀菌效果极强的次氯酸分产量损失的主要原因之一。据联合国粮农组织FAO统 子（HClO）形式存在，其杀菌能力是次氯酸根（ClO）计，每年植物因遭受病害造成的减产损失平均为总产量 的 80 倍左右。研究表明微酸性电生功能水具有与强酸性的 10-15 1。由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers.: Fr.） 离子水以及其他含氯消毒剂同等以上的杀菌能力1314。侵染引起的灰霉病是一种危害性很大的病害。近年来， 日本学者研究了以盐酸为原料制得的微酸性电生功能水随着设施栽培面积的扩大，灰霉病的发病率明显提高， 的物理化学特性及其对蔬菜的杀菌效果，结果表明微酸成为温室和大棚蔬菜生产的重要病害之一2-5。 灰葡萄孢 性电生功能水可以迅速的杀死蔬菜表面的各种致病菌，菌属半知菌亚门葡萄孢属真菌，主要以分生孢子、菌丝 且可以较好的杀死高温下难以杀灭的芽孢杆菌15-18。另体或菌核在病残体和土壤中越冬，翌年越冬病原菌产生 外，腐蚀性小，应用范围广，杀菌后还原成普通水，生新的分生孢子，数量多，体积小而轻，借助气流和雨水 产过程中无氯气排放，对环境和操作人员无危害，属于以及农田操作进行传播6。灰葡萄孢菌寄主范围广，可 安全、绿色、环保的消毒剂。以感染多种蔬菜，水果以及农作物。另外，灰葡萄孢菌 将微酸性电生功能水高效、无污染、无残留、安全不仅感染种子、植株，而且在采后的贮藏、运输过程中 的杀菌特性替代化学农药应用于植物病害防治，对推进也会引起灰霉病。 我国减农药、无农药作物栽培，减少化学农药的使用和 长期以来，植物病害的防治主要依靠化学农药，化 污染，提高我国农产品的安全水平，保障人民的身体健学农药的使用能够在某种程度上有效的控制灰霉病，但 康具有重要的现实意义。本文主要研究了微酸性电生功是长期反复使用会导致抗性菌株的产生。农药的大量使 能水对灰葡萄孢菌的杀灭效果， 考察了不同有效氯浓度、用对生态环境和农产品造成污染的同时，也直接或间接 处理时间、处理温度以及使用量的杀菌处理，确认杀菌的影响到了人类的健康。生物防治作为植物病害防治的 效果，为其在植物病害防治中的推广和应用提供可靠的另一种方法78，是采用天然拮抗微生物保护水果、蔬菜 理论依据。和农作物免受病原体的感染。有些真菌和细菌被证明能够有效控制灰霉病910，并且对人畜安全，不污染环境， 1 材料与方法防治对象不易产生抗性，有利于保持生态平衡，起到长效作用。然而，商业生物控制剂抑制灰霉病仅限于少数 1.1 试验材料和设备真菌和细菌菌株11，且防治效果不如化学农药迅速和明显，易受环境因素影响12。 收稿日期： 修订日期： 项目基金：国家自然科学基金面上项目（30871957） ；教育部高校博士点基金项 近年来，利用电化学技术制备杀菌剂的方法日益受 目（200800190031）；2007 年教育部新世纪优秀人才支持计划到 人 们 关 注 。 微 酸 性 电 生 功 能 水 （ Slightly Acidic 作者简介：冀盈盈（1986－），女（汉族） ，河南洛阳，硕士研究生。研究方向： 农业生物环境工程。E-mail: jyy66qq.comElectrolyzed Functional Water SAEFW SAEFW）又称微 通讯作者：曹薇（1972－），女（汉族） ，江西九江，博士，副教授，博士生导酸性离子水、微酸性氧化电位水，是在外加直流电压作 师。主要从事农业生物环境工程方面的研究。北京市海淀区清华东路 17 号 中 国农业大学（东校区）67 信箱，100083。E-mail: caoweicau.edu.cn 微酸性电生功能水对灰葡萄孢菌的杀灭效果研究1.1.1 供试菌种 葡萄孢菌接种于 PDA 平板，24℃恒温培养 14～21 d待 灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.: Fr.）Am36259，购 菌落充分生长，孢子丰满完全成熟后，无菌操作加入适于中国农业微生物菌种保藏管理中心。 量无菌生理盐水，用灭菌玻璃棒轻轻摩擦菌落表面洗脱1.1.2 主要试剂 孢子，吸取洗脱液至另一无菌试管中，再在微型漩涡混 NaCl、NaOH、 2HPO4、 Na Na NaH2PO4、 2S2O3、 HCl、 合仪上持续震荡 5 min，用八层无菌纱布过滤除去菌丝，葡萄糖等化学试剂均为分析纯；孟加拉红培养基：北京 所得滤液震荡混匀后在显微镜下，用血球计数板进行计奥博星生物技术有限责任公司；去离子水自制；马铃薯 数，将孢子浓度调整至 106 个孢子/mL，置 4℃条件下保购于菜市场。 存待用。1.1.3 仪器设备 1.4 杀菌试验方法 试验采用的电解水制备装置是由沈阳东宇馨波尔公 将制备好的孢子悬液，在微型漩涡混合仪上震荡 5司生产的电解水发生装置改装成的无隔膜单槽实验用电 min，使孢子充分散开。然后取 1 mL 孢子悬液加入到装解水生成装置 （如图 1 所示） 该装置主要由以下几部分 。 有 9 mL SAEFW 的试管中， 经过 0.5～5 min 震荡混合杀组成：塑料电解槽（长 13 cm、宽 13 cm、高 16 cm，体 菌后，取 1 mL 加入到 9 mL 无菌中和剂（1 mL 0.05的积 2704 cm3） 、镀铂钛合金电极（板状，长 19 cm，宽 Na2S2O3 ＋8 mL 0.03 M、pH 7.2 的磷酸盐缓冲液）中终9.6 cm，厚 0.6 cm） 、电源系统以及控制器。电压可调范 止杀菌。 混匀后进行梯度稀释，选择两个合适的稀释度，围为 040 V，极板间距调节范围为 1590 mm。 吸取 1 mL 稀释液于灭菌平皿中，然后将晾至 45℃左右 的孟加拉红培养基注入平皿中，转动平皿使之与菌液混 匀，待琼脂凝固后，倒置于 24℃恒温培养箱中，培养 72 h 后计数，每个稀释度做三个重复。对照为无处理组， 即将 1 mL 孢子悬液加入到 9 mL 无菌生理盐水中， 经过 0.5～5 min 震荡混合后，测定溶液的含菌量。每组试验 至少重复 3 次，结果取平均值。 2 结果与讨论 2.1 不同有效氯浓度微酸性电生功能水对灰葡萄孢菌的 杀灭效果 分别用有效氯浓度为 20、30、40、50、60 mg/L 的 微酸性电生功能水处理灰葡萄孢菌 30 s，微酸性电生功 能水的理化指标及杀菌效果见表 1 所示。 图 1 实验用电解水生成装置 表 1 不同有效氯浓度的微酸性电生功能水理化指标及其对灰葡萄 Fig. 1 Schematic diagram of the SAEFW generator 孢的杀灭效果 其它主要仪器包括：pH / ORP 计（HM-30R，东亜 Table 1 Inhibition of Botrytis cinerea Pers.: Fr by slightly acidicヂィ一タ一タ一株式会社，日本，精度±0.01 / 0.1 mV） ， electrolyzed functional water at different available chlorine高浓度有效氯测定仪（RC-2Z，笠原理化工业株式会社， concentrations日本，精度 1 mg/L） ，电导仪（DDS-11，天津第二分析仪器厂，天津，精度 1 m-1） ，DL-CJ-1DN 医用型洁净 有效氯 菌落数（log10 CFU/mL） 杀菌率 pH ORP（mV）工作台，智能生化培养箱，高压灭菌器，电热恒温水浴 （mg/L） 初始 残存 （）锅，微型漩涡混合仪，血细胞计数板，移液枪等。 20 6.44 789.7 6.26 ± 0.16 4.53 ± 0.68 96.51.2 微酸性电生功能水的制备 30 6.45 757.6 6.10 ± 0.10 3.70 ± 0.59 99.2 用自来水（中国农业大学东区地下水）配制 17 mM 40 6.48 775.4 6.13 ± 0.13 3.14 ± 0.25 99.9NaCl 和 2.3 mM HCl 混合溶液 2 L，在 20 V 电压下，电 50 6.50 765.5 6.00 ± 0.05 2.51 ± 0.59 99.9解不同时间制得具有不同理化特性（pH 值、ORP 值、 60 6.57 824.9 6.11 ± 0.21 1.85 ± 0.21 100有效氯浓度和电导率）的微酸性电生功能水作为供试液 注：每组试验至少重复 3 次，各数据均为：平均值±标准方差备用。对制得的微酸性电生功能水立即进行各项理化指 由表 1 可知，各有效氯浓度的微酸性电生功能水对标的测定，并在制备后 1 h 内使用。 灰葡萄孢菌均有较强的杀菌效果，有效氯浓度超过 311.3 孢子悬液的制备 mg/L 时，处理 30 s，杀菌率可以达到 99以上。随着有 从接种试管斜面挑取少量菌种，以平板划线法将灰 微酸性电生功能水对灰葡萄孢菌的杀灭效果研究效氯浓度的增加，杀菌效果增强，当有效氯浓度为 20mg/L 时杀灭率为 96.5，有效氯浓度为 50 和 60 mg/L 由图 3 可得，同一处理温度下，有效氯浓度高杀菌时，杀菌率分别为 99.9和 100。 效果好。4℃时，用有效氯浓度 20 mg/L 和 40 mg/L 的2.2 不同处理时间下微酸性电生功能水对灰葡萄孢菌的 微酸性电生功能水处理， 杀菌率分别为 90.0和 99.3；杀灭效果 22℃时，杀菌率分别为 98.4和 99.9；45℃时，杀菌 有效氯浓度为 20 和 40 mg/L 的微酸性电生功能水对 率 99.8和 100。 残存菌落数随着处理温度的升高而减灰葡萄孢菌进行不同处理时间的杀菌试验，结果如图 2 少，杀菌效果增强。有效氯浓度为 40 mg/L 的微酸性电所示。 生功能水，4、22 和 45℃时处理，灰葡萄孢菌分别降低 2.18、2.88 和大于 4.72 log10 CFU/mL；有效氯浓度为 20 6.52 mg/L 时，菌落数分别降低 1.00、1.80 和 2.73 log10 ACC20mg/L CFU/mL。 5.52 ） ACC40mg/L（log10 CFU/mL 残存菌落数 4.52 3 结论 3.52 微酸性电生功能水对灰葡萄孢菌具有较强的杀灭效 2.52 果。其有效氯浓度、杀菌处理时间、处理温度以及电解 1.52 水用量均对杀菌效果有影响。有效氯浓度升高、处理时 0 0.5 1 2 3 5 间延长，杀菌率提高。有效氯浓度超过 31 mg/L 时，处 处理时间（ min ） 理 30 s，杀菌率可以达到 99以上；处理温度升高，杀 图 2 不同处理时间下微酸性电生功能水对灰葡萄孢菌 菌效果增强。在 4、22 和 45℃下有效氯浓度为 40 mg/L 的杀灭效果 的微酸性电生功能水可使灰葡萄孢菌分别降低 2.18、 Fig. 2 Inhibition of Botrytis cinerea Pers.: Fr by slightly 2.88 和 4.72 log10 CFU/mL。 acidic electrolyzed water at different treatment time 参 考 文 献 由图 2 可以看出，微酸性电生功能水在 20 和 40 1 侯慧 徐汉虹 林壁润等. 防治植物病害的农用抗生素的研mg/L 有效氯浓度下， 灰葡萄孢菌的残存菌落数均随着处 究及应用J. 河南农业科学 2003 11: 28–31.理时间的延长而减少。有效氯浓度为 20 mg/L 时，杀菌 2 Morgan W.M.. The effect of night temperature and glasshouse率由 0.5 min 时的 96.5增加到 5 min 时的 100；有效 ventilation on the incidence of Botrytis cinerea in a late-planted氯浓度为 40 mg/L 的微酸性电生功能水处理 1 min， 菌落 tomato crop. Crop Prot. 1984 3 243–251.数减少 3.87 log10 CFU/mL， 处理 3 min，菌落数减少 4.61 3 Morgan W.M.. Influence of energy-saving night temperaturelog10 CFU/mL。 regimes on Botrytis cinerea in an early-season glasshouse2.3 不同处理温度下微酸性电生功能水对灰葡萄孢菌的 tomato crop. Crop Prot. 1985 4 99–110.杀灭效果 4 Eden M.A. Hill R.A. Beresford R. et al. The influence of 22 分别用 4、 和 45℃的微酸性电生功能水处理灰葡 inoculum concentration relative humidity and temperature on萄孢菌 30 s，杀菌结果如图 3 所示。 infection of greenhouse tomatoes by Botrytis cinerea. Plant Pathol. 1996 45 795–806. 6.52 5 O’Neill T.M. Shtienberg D. Elad Y.. Effect of some host and ） 5.52 microclimate factors on infection of tomato stems by Botrytis （log10 CFU/mL 残存菌落数 4.52 cinerea. Plant Dis. 1997 81 36–40. 3.52 6 李怀方 刘凤权，郭小密. 园艺植物病理学. 北京: 中国农业 2.52 大学出版社 2001. 1.52 7 Sansone G. Rezza I. Calvente V..
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