野生薯蓣膳食纤维的提取及其对自由基的清除作用

谢嘉虹

专业：食品科学与工程   学 号：2007464231  指导老师：钟希琼

摘要：以薯蓣粉为材料，设计四因素三水平的正交试验，酶法提取膳食纤维，结果表明：0.7%混合酶（a-淀粉酶:糖化酶之比为6:1），处理温度60℃，处理时间80min，0.5%蛋白酶用量 (60℃处理60min)对淀粉和蛋白质的脱除最彻底。以体外试验研究不同浓度（20～140mg/mL）的膳食纤维鲜样对自由基的清除效果，设计三种不同的反应体系：二苯代苦味酰自由基（DPPH）、超氧阴离子自由基、羟自由基（·OH）。结果：薯蓣膳食纤维对三种自由基都有一定的清除能力，平均消除率分别为53.23%、31.67%、30.38%。即对3种自由基清除能力大小顺序为：二苯代苦味酰自由基>超氧阴离子自由基>羟自由基。另外，可溶性淀粉对三种自由基也有轻微的清除能力，其平均清除率分别为2.81%、6.98%、6.48%。

关键词：薯蓣；膳食纤维；可溶性淀粉；自由基；清除

Abstract：Orthogonal test carried out on extraction of dietary fiber from yam by enzymatic method ,the results showed that 0.7 percent of mixed-enzyme(a - amylase:saccharifying enzyme is 6:1)at 60 ℃ to deal with 80 minutes , 0.5 percent of protease at 60 ℃ to deal with 60 minutes , could clear out the carbohydrate and the protein in yam. In vitro , we studied the effect of different concentrations (20～140mg/mL) of the fresh dietary fiber on free radicals scavenging, including the DPPH ,the superoxide anion, the hydroxyl radical. The average scavenging rate was 53.23%、31.67% and 30.38%. The result was this DF had good scavenging faction of the three kind of free radicals and the capacity of clearing on DPPH was the strongest ,and the scavenging rate on hydroxyl radical was as similar as superoxide anion . In addition , soluble starch had mild scavenging faction of the three kind of free radicals. The average scavenging rate was 2.81%、6.98% and 6.48%.

Key words：yam ; dietary fiber ; soluble starch; free radicals ; scavenging

膳食纤维是指不能被人体消化的多糖类碳水化合物和木质素的总称。可分为水溶性膳食纤维和水不溶性膳食纤维，其中水溶性膳食纤维主要有植物细胞内的储存物质和分泌物，另外还包括部分微生物多糖和合成多糖，其组成主要是一些胶类物质和糖类物质，而不溶性膳食纤维的主要成分是：纤维素、半纤维素、木质素、原果胶、壳聚糖等^[1]。水溶性膳食纤维具有调整糖类和脂类代谢的功能，对降低血浆胆固醇含量、预防心血管疾病具有良好效果。非水溶性膳食纤维具有吸收人体水分的特性和良好的预防便秘效果。膳食纤维的功效随着科学研究的深入而逐渐被人们认识，现在被人们称为“第七营养素”^[2,3,4]。

目前，膳食纤维的制备方法主要有化学法、发酵法和酶法等。酶法工艺由于酶的催化率高、作用条件温和、设备要求简单，有效成分的破坏小，污染少，可以很好地保护膳食纤维的组织结构和生理功能，产品成分较理想。

自由基，是含有一个不成对电子的原子团。生物体系主要产生的是氧自由基，例如超氧阴离子自由基、羟自由基、脂质过氧化自由基、二氧化氮和一氧化氮自由基。加上过氧化氢、单线态氧和臭氧，通称活性氧。体内活性氧自由基具有一定的功能，如免疫和信号传导过程。但过多的活性氧自由基就会破坏人体正常细胞和组织，是人类衰老和患病的根源。此外，外界环境中的阳光辐射、空气污染、吸烟、农药等都会使人体产生更多活性氧自由基。自由基对人体的攻击首先是从细胞膜开始的，一旦被自由基夺走电子，细胞膜就会失去弹性并丧失一些功能，更为严重的是自由基对核酸大分子的攻击，可以使基因的结构被破坏，导致基因突变，从而引起整个生命发生系统性的紊乱^[5]。

最新研究表明，增加饮食中膳食纤维的含量可以减少冠心病、肥胖症、高血压、糖尿病的发病率，减轻长期大量饮酒对胰脏的损伤，降低血液中胆固醇的含量，提高肾切除者对氮的排泄功能，摄取适当比例的水溶性和水不溶性膳食纤维，可以改善肠道的吸收功能，预防结肠癌。此外，膳食纤维对自由基有一定的清除作用，在清除外源物有害物质方面也有着独特的功能和效果^[2]。麦麸、米糠等酶法提取膳食纤维及对自由基的清除作用已有报道^[6]。

本试验选择一种野生薯蓣（Dioscorea  batatas）为材料。拟进行酶法提取野生薯蓣膳食纤维及其对自由基的清除作用的研究，为纤维功能性食品的开发提供一定参考。

1 材料与方法

1.1试验材料

薯蓣：购自广东省电白县霞洞镇河南村；a-淀粉酶：2000u/g，广东环凯微生物科技有限公司；糖化酶：10万U/mL，上海晶纯试剂有限公司；木瓜蛋白酶：600万U/g，国药集团化学试剂有限公司；DPPH：SIGMA公司；可溶性淀粉、高锰酸钾、30%过氧化氢、乙醇、硫酸亚铁、草酸、邻苯三酚、HCl等均为分析纯。GF-90粉碎机，HH数显恒温水浴锅，101-2电热干燥箱，752S紫外可见分光光度计，TGL-16G离心机。

1.2 试验方法

1.2.1薯蓣粉的制备  

 取新鲜薯蓣（完好无损），去皮后洗干净，沥干表面的水分称重，然后切成薄片，在65～75℃下烘干至恒重，约需7～8小时，将烘干的样品片状用研钵研成碎片后再用粉碎机粉碎成粉末，称干重，能通过40目筛的粉末作为提取膳食纤维的原料。

1.2.2 薯蓣膳食纤维的提取^[7,8]

称取重量均为5克烘干至恒重的薯蓣粉九份，分别加入45mL蒸馏水，混合酶比例（即a-淀粉酶：糖化酶）分别为5:1、6:1、7:1，混合酶用量分别为0.5%、0.6%、0.7%，混合酶处理温度分别为60℃、70℃、80℃，处理80min后用蒸馏水漂洗至中性，再加入25mL蒸馏水，木瓜蛋白酶用量分别为0.4%、0.5%、0.6%，在60℃下处理60min，再漂洗至中性。采取L₉（3⁴）正交实验方法(即混合酶比例、用量、温度及蛋白酶用量四个因素各设三个水平)进行，重复三次。将提取后的样品于60～70℃下烘干至恒重，约需5～6小时，称重，计算产品得率，以正交实验中对淀粉和蛋白质脱除最彻底的条件进行薯粉膳食纤维提取，将其鲜样配制成不同浓度进行清除自由基的体外实验研究。

1.2.3 H₂O₂浓度的标定

用0.1mol/L的草酸溶液标定高锰酸钾溶液（约0.02mol/L）的浓度；再用高锰酸钾溶液标定H₂O₂（约0.1mol/L）的浓度。

1.2.4 测定不同体系中薯粉膳食纤维清除自由基的能力

将膳食纤维配成7个不同浓度，分别为：20、40、60、80、100、120、140mg/mL。

1.2.4.1 二苯代苦味酰（DPPH）自由基体系^[6]

比色法测定薯粉膳食纤维对DPPH的清除作用：DPPH用95%乙醇配成1×10^-4mol/mL溶液，于试管中加入相应试剂，25℃恒温30min，4000r/min离心10min，取上清液在波长517nm下测定吸光值。其中A₁为5 mL DPPH溶液＋0.5 mL 膳食纤维时的吸光度；A₂为5mL95%乙醇溶液＋0.5 mL 膳食纤维时的吸光度；A₃为5mL DPPH溶液＋0.5 mL蒸馏水时的吸光度。

1.2.4.2 超氧阴离子自由基体系^[9]

采用邻苯三酚自氧化法测定薯粉膳食纤维对超氧阴离子自由基的清除作用：于试管中加入相应试剂，25℃恒温15min，取混合液3mL于比色皿中加入100mmol/L的邻苯三酚（用0.01mmol/L HCl配制）0.1mL，摇匀，反应3min，在波长420nm测定吸光度。其中A₁为9 mL pH=8磷酸盐缓冲溶液＋1mL膳食纤维＋0.1 mL 45 mmol/L的邻苯三酚时的吸光度；A₂为9 mLpH=8磷酸盐缓冲溶液＋1 mL 膳食纤维时的吸光度；A₃为9 mL pH=8磷酸盐缓冲溶液＋1 mL蒸馏水＋0.1mL 45 mmol/L的邻苯三酚时的吸光度。

1.2.4.3 羟自由基体系^[10]

比色法测定Fenton反应产生的羟自由基：于试管中加入膳食纤维0.5mL， 0.5mL 9.1mmol/L水杨酸—乙醇溶液，0.5mL 9mmol/LFe²⁺ 溶液，3.5mL蒸馏水，最后加入5mL 88mmol/LH₂O₂启动Fenton反应，摇匀后于波长510nm处测定吸光度为A₁；用0.5mL的蒸馏水代替9mmol/LFe²⁺ 溶液所测得的吸光度为A₂；用0.5mL蒸馏水代替膳食纤维所测得的吸光度为A₃。

1.2.5 测定不同体系中可溶性淀粉清除自由基的能力

参照上述薯粉膳食纤维清除自由基的方法进行试验。

1.3数据处理

1.3.1  H₂O₂浓度的计算：  ；

标定第一步用去高锰酸钾9.27mL，第二步用去6.53 mL，得出H₂O₂的浓度为88.0mmol/L。

1.3.2  自由基清除率P(%)表示为：

2 结果与分析

2.1 酶法提取薯蓣膳食纤维正交试验结果分析

选择影响薯蓣膳食纤维提取的四个主要因素：混合酶比例、混合酶用量、混合酶温度、蛋白酶用量^[7]，每个因素设三个水平进行L₉（3⁴）正交试验。因素水平见表1，结果见表2。

从极差分析可知：R₄> R₃> R₁ > R₂，所以A、B、C、D四个因素对薯蓣粉中膳食纤维提取影响的主次顺序是D > C > A > B，最佳提取条件组合为A₂B₃C₁D₂，即0.7%混合酶（a-淀粉酶︰糖化酶之比为6:1），处理温度60℃，蛋白酶用量0.5%(60℃处理60min)对淀粉和蛋白质的脱除最彻底。以此条件提取膳食纤维，进行下一步清除自由基的研究。

表1因素水平表L₉（3⁴）

水平

因    素

A                   B                    C                   D

混合酶比例（︰）

混合酶用量（%）

混合酶温度（℃）

蛋白酶用量（%）

1

5︰1

0.5

60

0.4

2

6︰1

0.6

70

0.5

3

7︰1

0.7

80

0.6

表2 正交试验结果

试验号

混合酶比例

混合酶用量

混合酶温度

蛋白酶用量

产品重量(g)

1

5︰1

0.5

60

0.4

0.397

2

5︰1

0.6

70

0.5

0.344

3

5︰1

0.7

80

0.6

0.453

4

6︰1

0.5

70

0.6

0.338

5

6︰1

0.6

80

0.4

0.378

6

6︰1

0.7

60

0.5

0.314

7

7︰1

0.5

80

0.5

0.354

8

7︰1

0.6

60

0.6

0.418

9

7︰1

0.7

70

0.4

0.335

K_1‘

0.398

0.363

0.376

0.37

K_2‘

0.343

0.38

0.339

0.337

K_3‘

0.369

0.367

0.395

0.403

R

0.055

0.017

0.056

0.066

2.2膳食纤维及可溶性淀粉对自由基的清除作用

2.2.1不同浓度膳食纤维及可溶性淀粉对DPPH的清除作用

二苯代苦味酰（DPPH）在有机溶剂中是一种稳定的自由基，在517 nm处有吸收峰，呈紫色。当自由基清除剂存在时，DPPH的孤电子被配对，颜色变浅，在最大吸收波长处吸光度变小，且颜色变化与配对电子数成化学计量关系。因此，可用来评价自由基的清除情况。由图1可知，膳食纤维对DPPH有清除作用，平均清除率为53.23%。其清除作用随着膳食纤维的浓度增大而加强，当膳食纤维浓度大于80mg/mL后，清除作用逐渐趋向平缓。当膳食纤维浓度为140mg/mL时，其清除率达到66.80%。相比而言，可溶性淀粉对DPPH也有轻微的清除作用，平均清除率只有2.81%。

2.2.2不同浓度膳食纤维及可溶性淀粉对超氧阴离子的清除作用

超氧阴离子自由基也是生物体中生成量最多一种氧自由基。其活泼性虽不大，但寿命较长，扩散性强，可引起膜的损伤，使某些酶失活并改变线粒体氧化磷酸化作用。同时，它可转化成为其他种类的氧自由基，对人体也有较大的损害。图2说明膳食纤维对超氧阴离子有清除作用，平均清除率为31.67%。其清除作用随着膳食纤维的浓度增大而加强，当膳食纤维浓度大于100mg/mL后，清除作用逐渐趋向平缓。当膳食纤维浓度为140mg/mL时，其清除率达到38.46%。相比而言，可溶性淀粉对超氧阴离子也有一定的清除作用，平均清除率为6.98%。

图1不同浓度膳食纤维及可溶性淀粉对DPPH的清除作用     图2不同浓度膳食纤维及可溶性淀粉对超氧阴离子的清除作用

图3 不同浓度膳食纤维及可溶性淀粉对·OH的清除作用

2.2.3不同浓度膳食纤维及可溶性淀粉对羟自由基的清除作用

·OH是化学性质最活泼的一种自由基，具有很高的反应速率常数，因此在各种自由基中，它的危害性最大。在生物体内它可进攻细胞膜导致膜的损伤；破坏DNA的糖基和碱基，诱导双螺旋结构解体，甚至导致细胞死亡和基因突变。因此，常用清除·OH的能力来评价一种物质对自由基的清除效果。从图3得知，膳食纤维对羟自由基有清除作用，平均清除率为30.38%，与其对超氧阴离子的清除作用相差不大。其清除作用随着膳食纤维的浓度增大而加强，在20～140mg/mL浓度范围内，清除率直线上升。相比而言，可溶性淀粉对羟自由基也有清除作用，平均清除率为6.48%，与其对超氧阴离子的清除作用相差不大。

3 结论

本研究采用酶解法，设计四因素三水平的正交实验：混合酶比例（即a-淀粉酶︰糖化酶分别为5:1、6:1、7:1)、混合酶用量（分别为0.5%、0.6%、0.7%）、混合酶处理温度（分别为60℃、70℃、80℃）、蛋白酶用量（分别为0.4%、0.5%、0.6%），即L₉（3⁴）正交实验对野生薯蓣粉进行膳食纤维的提取，得出最佳提取条件为0.7%混合酶（a-淀粉酶：糖化酶之比为6︰1）于60℃处理80min、蛋白酶用量0.5%在60℃处理60min。以此条件进行提取对糖类和蛋白质的去除较彻底。

采用酶制剂水解野生薯蓣粉所获得的膳食纤维，在一定膳食纤维的浓度范围内对DPPH、超氧阴离子自由基、羟自由基等都有良好的清除作用，在20～140mg/mL范围内，对三种自由基的平均清除率为53.23%、31.67%、30.38%，说明了该膳食纤维对这三种自由基的清除能力是：二苯代苦味酰自由基>超氧阴离子自由基>羟自由基，膳食纤维对后两种自由基的清除作用相差不大。相比而言，可溶性淀粉对DPPH、超氧阴离子自由基、羟自由基也有轻微的清除作用，其平均清除率分别为2.81%、6.98%、6.48%，且可溶性淀粉对后两者的清除作用相差不大。通过本试验，说明薯蓣粉中对DPPH、超氧阴离子自由基、羟自由三种自由基的起清除作用的主要是膳食纤维，且不同粗粮对不同自由基的清除作用有所不同^{[7,11，12，13]}，所以人们在日常饮食中，应注意食物的多样化。

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