3d直选遗漏统计分析:微生物平板计数法

一、实验目的
学习微生物的平板计数法。
二、原理概述
微生物的稀释平板计数是根据在固体培养基上所形成的一个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成，且肉眼可见的子细胞群体这一生理及培养特征进行的。也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的一系列不同稀释液，并尽量使样品中的微生物细胞分散开来，使成单个细胞存在 ( 否则一个菌落就不只是代表一个菌 ) ，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数，一般用于某些成品检定 ( 如食品等 ) 、生物制品检定、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检定。
三、实验器材
1 、待测样品、所需各类培养基
2 、天平、称样瓶、记号笔、容量瓶、无菌生理盐水、 1ml 和 5ml 无菌移液管、无菌平板、无菌试管
四、操作步骤和内容
1 、样品稀释液的制备
准确称取待测样品 10g 或 10ml ，放入装有 90ml 无菌水并放有小玻璃珠的 250mL 三角瓶中，用手或置摇床上振荡 20min ，使微生物细胞分散，静置约 20-30s ，即成 10 -1 稀释液；再用 1ml 无菌吸管，吸取 10 -1 稀释液 1ml 移入装有 9ml 无菌水的试管中，吹吸 3 次，让菌液混合均匀，即成 10 -2 稀释液；再换一支无菌吸管吸取 10 -2 菌液 1mL 移入装有 9ml 无菌水试管中，即成 10 -3 稀释液；以此类推，一定要每次更换吸管，连续稀释，制成 10 -4 、 10 -5 、 10 -6 、 10 -7 、 10 -8 等一系列稀释度的菌液，供平板计数使用 ( 如图 13 － 1) 。
图 13 － 1 平板计数法中样品的稀释和稀释液的取样
用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时，多采用 10 -7 、 10 -8 、 10 -9 稀释度的菌液；测定土壤细菌数量时，多采用 10 -4 、 10 -5 、 10 -6 稀释度的菌液；测定放线菌和真菌数量时，多采用 10 -3 、 10 -4 、 10 -5 稀释度的菌液。
2 、平板接种培养
平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。该实验采用混合平板培养法计数：将无菌平板编上 10 -7 、 10 -8 、 10 -9 号码，每一号码设置 2 个重复，用 1 毫升无菌吸管按无菌操作要求吸取 10 -7 稀释液各 1 毫升放入编号 10 -7 的 3 个平皿中，同法吸取 10 -8 稀释液各 1 毫升放入编号 10 -8 的 3 个平皿中，再吸取 10 -9 稀释液各 1 毫升，放入编号 10 -9 的 3 个平皿中 ( 由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换 ) 。然后在 6 个平皿中分别倒入已融化并冷却至 45-50 ℃的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷凝后倒置，适温培养，至长出菌落后即可计数。放线菌和真菌同法可得。
3 、结果计算
计算结果时，常按下列标准从接种后的 3 个稀释度中，选择一个合适的稀释度，求出每克待测样品中的含菌数。
计数时应选取菌落数在 30-300 之间的平板作为菌落总数测定的标准，每个稀释度使用两个平板，应取其平均值。这是因为稀释度过高，菌数少，误差大，稀释度过低菌数多，不易得到分散的菌落，也不易数清。
到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于 0 － 4 ℃，但不得超过 24h 。
如果其中一个平板有较大片状菌落时，不宜采用此平板，仅用没有片状菌落的平板即可。如果全部都有片状菌落，但片状菌落不足皿面积的一半，其余菌落分布十分均匀，可以计算半个皿后乘 2 来代表全皿的菌落数。
如果一个平板在 30-300 之间，另外一个不在 30-300 之间，则仅用在 30-300 之间的平板来计数。
当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。
当在琼脂与培养皿的底部、培养基表面、培养基边缘出现水膜样的蔓延菌落时，一般是由于蔓延处发生水汽聚集的缘故。当蔓延超过 1/4 时要避开，超过 50 ％时，应报告为实验室事故。
当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于 300 时），但分布很均匀，可取平板的一半或 1/4 计数。再乘以相应倍数作为该平板的菌落数。
有二个稀释度均在 30-300 之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于 2 取平均数，比值大于 2 则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。
若所有稀释度均不在计数区间。如均大于 300 ，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于 30 ，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于 300 ，有的又小于 30 ，但均不在 30-300 之间，则应以最接近 300 或 30 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于 1 乘以最低稀释倍数报告之。
不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。
菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在 1-100 时，按实有数字报告，如大于 100 时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（ g) 为单位报告，液体检样以毫升（ ml ）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（ cm 2 ）报告。
报告举例表如下：
例次
稀释倍数及菌落数
稀释液之比
菌落总数 cfu/g 或 mL
报告方式
10月1日
10月2日
10月3日
cfu/g 或 mL
1
多不可计
164
20
-
16400
1.6 × 104
2
多不可计
295
46
1.6
37750
3.8 × 104
3
多不可计
271
60
2.2
27100
2.7 × 104
4
150
30
8
2
1500
1.5 × 103
5
多不可计
305
12
-
30500
3.1 × 104
6
27
11
5
-
270
2.7 × 102
7
0
0
0
-
＜ 1 × 10
＜ 10
8
多不可计
多不可计
313
-
313000
3.1 × 105
五、结果
水中总菌数：
稀释度
平板上菌落数
结果
1
2
cfu ／ ml （ g, 或 cm 2 表面积）
对照
六、注意事项
1 、在整个实验过程中的无菌操作。
2 、应根据实验所测的样品决定最高稀释度。
3 、混菌法倒培养基时应当注意培养基不能过烫或过冷。
七、思考题
要使平板菌落计数结果准确，需要注意哪些方面？