肿瘤坏死因子α在暴发性肝衰竭时引起肠粘膜损伤机制的研究

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导出 添加到引用通知 分享到| 下载PDF阅读器目的：自发性腹膜炎(Spontaneousbacterialperitonitis，SBP)是重症肝炎最常见的并发症之一，本实验通过观察暴发性肝衰竭动物模型中异常增高的TNFα对肠粘膜上皮所致的损伤作用，尤其是对紧密连接的影响，进一步研究细菌穿入肠粘膜上皮细胞与TNFα之间的关系；同时在去除细胞免疫和体液免疫影响因子情况下，验证TNFα对体外培养的肠粘膜上皮细胞中紧密连接蛋白(ZO-1)表达的影响，探讨TNFα在重症肝炎时对肠道粘膜所起的作用，为进一步解释重症肝炎并发SBP的发生机制提供依据。 材料与方法 一、试剂： TNFα、抗TNFR1-IgG抗体、LPS、GalN、TNFα血清检测试剂盒、ZO-1抗体、FITC标记山羊抗兔IgG抗体、胎牛血清、谷氨酰胺、非必须氨基酸、细胞培养液DMEM高糖培养基、TRI-zol、细胞及组织裂解液、抗-TNFα-IgG抗体、Caco-2细胞株。 二、动物： 雄性BALB/c小鼠，6-8周龄，体重18-22克。 三、方法： 1.动物模型的制备： 动物分组：取431只雄性Balb/c小鼠，动物随机分为8组。第1组(生理盐水NS对照组)40只，第2组(LPS对照组)40只，第3组(GalN对照组)40只，第4组(肝坏死组：GalN+LPS实验组)120只，第5组(抗TNFα-IgG抗体+GalN+LPS组)8只，第6组(抗TNFR1-IgG抗体+GalN+LPS组)8只，第7组(肝坏死组：GalN+TNFα实验组)135只，第8组(TNFα对照组)40只。 用药：GalN800mg/kg，LPS10μg/kg，均腹腔注射，TNFα(10μg/kg)、抗-TNFα-IgG抗体(100μg/只)和抗-TNFR1-IgG抗体(100μg/只)，均通过尾静脉注射。 2.用生物化学方法测定血清ALT水平。 3.血清TNFα水平的测定用ELISA方法。 4.肝和肠组织标本用HE染色，光镜下观察组织形态学变化。 5.透射电镜下观察暴发性肝衰竭小鼠肠道粘膜上皮细胞形态学改变和细菌穿入肠道粘膜上皮的形式。 6.免疫组织化学技术：用冰切片检测暴发性肝衰竭小鼠肠道粘膜上皮细胞ZO-1表达的变化。采用Envision两步免疫组织化学方法检测ZO-1蛋白在肠粘膜上皮细胞间的分布状态。 7.蛋白杂交印迹技术检测暴发性肝衰竭小鼠及其它实验对照组大肠组织中的紧密连接蛋白的表达水平。 8.细胞系Caco-2培养：按照ElizabethWillott报告的方法培养，细胞生长达到融合，用TNFα刺激，观察紧密连接蛋白ZO-1表达(分布)及其mRNA表达情况。 9.免疫荧光方法观察Caco-2细胞间紧密连接蛋白分布的情况。 10.蛋白杂交印迹技术检测TNFα对Caco-2细胞间ZO-1蛋白表达的影响。 11.逆转录PCR扩增(RT-PCR)技术检测TNFα作用下Caco-2细胞ZO-1mRNA的表达水平。 实验结果 1.动物实验结果： 1.1动物的表现及死亡率：第4和7组暴发性肝衰竭动物模型表现：懒动，摄水和觅食动作减少，皮毛松散，最后行动减慢，甚至抽搐，并于注射后6h开始死亡，总死亡率分别达66.7％(80/120)和69.6％(94/135)。而其它对照组动物无死亡。 1.2肝脏功能：第1组、第2组和第8组小鼠血清ALT水平在各个时间点均正常，第3组血清ALT水平仅在9h有轻度升高(110.09±2.48U/L)。第4组和第7组小鼠血清ALT水平于2h时分别为(22.15±2.78U/L)和(33.7±2.86)，与其它组相同时间点比较无显著性差异(P＞0.05)。6h开始明显升高，各时间点较其它各对照组均有显著性差异(P＜0.01)。而第5和6组9h时血清ALT水平分别为(257.1±83.17U/L)和(904±583.00U/L)，较第4组在9h时相比也有显著性差异(P＜0.01)。 1.3肝脏组织病理：第4组和第7组肝脏组织病理形态学检查结果：9h时病变严重，HE染色呈肝细胞大块或亚大块坏死，肝小叶结构紊乱，肝索消失，肝血窦或间质内出血较重。正常对照组肝病理正常，其它对照组肝脏病变轻微。 1.4血清TNFα水平：在第1组、第2组和第3组中，除第2组动物于2小时TNFα含量为(61.0982±34.5281pg/ml)，6小时为(22.2294±13.7507pg/ml)，其余时间点TNFα含量均低于敏感度以下。而第4组动物的血清TNFα含量于2h时为最高峰446.1800±55.4914pg/ml，6h下降为14.8171±9.0108pg/ml，9h有上升到319.4310±33.7261pg/ml，12h轻微下降，24h下降至(137.8759±46.2482pg/ml)，2h、9h和12h与其它各时间点比较有显著性差异P＜0.01。 2.对FHF小鼠肠粘膜上皮细胞超微结构及细菌侵袭肠粘膜的研究：2.1光镜下肠粘膜表现：各组及各时相点肠绒毛上皮完整，几乎未见上皮脱落及碎屑形成，仅有轻微的水肿和炎细胞浸润。 2.2透射电镜下观察FHF动物模型大肠粘膜超微结构变化： 第4组9h：微绒毛断裂、脱落、变短，紧密连接不完整，细胞器变化明显包括细胞核形状不规则，染色体靠近核膜、色深，内质网肿胀、嵴断裂。对照组动物大肠微绒毛排列整齐，紧密连接完整，细胞核、细胞器基本正常。第5组和第6组9h：肠微绒毛基本正常，上皮细胞排列规则，细胞间及顶端紧密连接无明显破坏，细胞器基本正常。 2.3在肝衰竭组可见细菌直接穿入肠粘膜，其方式主要为胞饮方式，并且细菌穿入肠粘膜上皮屏障区域肠道粘膜上皮细胞紧密连接断裂。在其它对照组中未发现此现象。 3.TNFα对FHF时肠粘膜上皮细胞间紧密连接蛋白表达的影响 3.1免疫组化方法检测各组动物肠道上皮细胞的紧密连接蛋白ZO-1表达情况：在第1组、第2组、第3组9h的大肠组织切片中可见到几乎整张切片上，ZO-1蛋白沿肠粘膜上皮细胞顶端细胞膜上表达很强的棕褐色阳性染色信号。但是在第4组和第7组中，从6h开始可以发现肠粘膜上皮细胞间顶端棕褐色阳性染色明显减弱，9h阳性染色更弱，12h以后阳性染色逐渐恢复。经过抗TNFα-IgG抗体和抗TNFR1-IgG抗体预先进行阻断后，9h大肠组织内阳性信号与正常对照组比较无明显变化。 3.2用Westernblot方法测定各组动物的肠组织ZO-1蛋白含量情况：第1组、第2组、第3组中可见蛋白表达量无明显变化。在第4组中，从6h起ZO-1表达明显减弱，设第1组9h的肠组织ZO-1含量为100％，其它各组占第1组9h的比例为：6h(35.30±7.33)％和9h(25.62±7.03)％与其它对照组相比有显著性差异(P＜0.01)。 4.在体外用TNFα刺激Caco-2细胞的实验结果 4.1免疫荧光方法检测不同浓度TNFα对Caco-2细胞ZO-1蛋白表达的影响：用TNFα0ng/ml，50ng/ml，100ng/ml和200ng/ml与Caco-2细胞共同培养24小时，应用免疫荧光方法检测Caco-2细胞中ZO-1蛋白的表达，发现低浓度(50ng/ml)组细胞核中的荧光信号较细胞膜上的多，总的荧光强度没有改变；100ng/ml和200ng/ml组细胞膜上的免疫荧光明显减少或终断。 4.2用TNFα100ng/ml与Caco-2细胞共同培养，分别在0h、4h、8h和24h时，应用Westernblot方法检测Caco-2细胞ZO-1蛋白，结果24h时ZO-1蛋白表达明显减少。 4.3TNFα对Caco-2细胞紧密连接蛋白ZO-1mRNA表达的影响： 当Caco-2细胞生长达到融合时，分别添加TNFα0ng/ml，50ng/ml，100ng/ml和200ng/ml与Caco-2细胞共同培养，结果24h时，TNFα100ng/ml组，ZO-1mRNA明显降低。 结论 ①选用的暴发性肝衰竭动物模型可信，TNFα在暴发性肝衰竭动物模型中导致肠粘膜损伤方面发挥重要作用。 ②暴发性肝衰竭小鼠存在紧密连接断裂，肠绒毛减少等超微结构变化的病理基础，肠粘膜超微结构异常变化与肝脏病理和血清TNFα水平高低一致。 ③在FHF期间肠道内细菌可直接通过胞饮方式穿入肠粘膜上皮细胞内，细菌穿进肠道粘膜上皮细胞所经途径区域肠粘膜紧密连接断裂。提示肠粘膜紧密连接断裂为肠道内细菌进入肠粘膜提供前提条件。 ④动物实验证实：FHF动物血清中异常高水平的TNFα是造成肠粘膜上皮细胞间紧密连接发生断裂的主要因素之一。同时也是引起FHF动物的肠粘膜上皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1表达减少的原因之一。 ⑤体外实验显示：肠粘膜上皮细胞在低浓度TNFα作用下，ZO-1蛋白在细胞核中分布增加，膜上分布减少；而高浓度TNFα作用下，ZO-1蛋白在细胞膜上和在细胞核中分布均减少。提示TNFα可能通过影响ZO-1蛋白合成及转运使细胞膜上的ZO-1蛋白分布(表达)减少。 ⑥TNFα是通过抑制肠粘膜上皮细胞ZO-1mRNA表达而降低Caco-2细胞ZO-1蛋白的表达，从而影响肠粘膜上皮细胞间紧密连接的完整性。作者：宋红丽学科专业：内科学授予学位：博士学位授予单位：中国医科大学导师姓名：刘沛学位年度：2005语 种：chi分类号：R575.3关键词：肝衰竭  Caco-2细胞株  ZO-1蛋白  TNFα  肠粘膜  腹膜炎  重症肝炎机标关键词：肿瘤    坏死因子α    性肝衰竭    肠粘膜    上皮细胞    粘膜上皮    紧密连接蛋白    动物模型    对照组    细胞间紧密连接    显著性差异    肠组织    血清    免疫荧光方法    肠道粘膜    抗体    检测    蛋白表达    小鼠    实验