吕瑶168张:国立中山大学生物科学研究所

(百度和网页http://etd.lib.nsysu.edu.tw/ETD-db/ETD-search-c/getfile&fi

国立中山大学生物科学研究所
博士论文
指导教授:宣 大 卫 博士
陈 锦 翠 博士
以噬菌体呈现技术探讨猪肺炎霉浆菌
抗原决定位图谱及研发疫苗
Epitopes Mapping and Vaccine Development of Mycoplasma
hyopneumoniae Through Phage Display Technology
研 究 生:杨 文 仁 撰
中华民国九十二年一月
志 谢
五年多前,为了接受更深一层的生物科技知识的洗礼及完成高中
时自我许下的目标,毅然地放弃卫生署预防研究所(现今的疾病管制局)
一份令不少人羡慕的稳定工作,重回到研究生的生活.一路走来虽然
辛苦,终於,经过了许多训练与磨练,完成了阶段性的目标,更淬炼
出自己的坚强的韧性与毅力.
感谢宣大卫老师提供良好的学习环境及平时严格的要求,在实验
上提供宝贵的建议与见解,在生活上细心地关怀与照顾及对论文不厌
其烦巨细靡遗地斧正.除了对本论文的研究之外,也让我参与了高生
物素含量酵母及口服酵母疫苗的研究,从DNA选殖,蛋白质表达,纯
化到发酵槽,让我了解生物技术的基础研究到应用.只可惜因为这些
研究是产学合作计划,无法将研究结果呈现在此论文中.
感谢陈锦翠老师这几年来的照顾,指导及对论文的斧正,在实验
室搬移到花莲后,协助我顺利解决在学校行政上的相关问题.丹麦兽
医研究所的Niels F. Friis博士及丹麦国立血清研究所的J rgen S. Jensen
博士在培养各种霉浆菌上所提供的宝贵意见以及成功大学微免所余俊
强老师提供肺冲洗液技术的指导,使得动物实验得以顺利完成,在此
一并致谢.更感谢各位口试委员,李水龙老师,洪义人老师,翁仲男
老师,廖明一老师,在百忙之中,抽空对本论文加以斧正,并於口试
时提供宝贵的建议.虽然蔡英杰老师,蔡怀桢老师因为有要事无法参
加论文口试,仍然感谢他们在资格考时提供的指导及宝贵意见.此外,
石乐仁(Larry Steinrauf)老师,一位来自印第安那大学的退休教授,很荣
幸地,在他的指导下完成另一篇论文.但很遗憾地,他於2001年因病
辞世,然而他那学者的风范与认真做学问的态度,将永远留在我的心
中,也是我学习的目标.
花莲,一个从未在我的生涯规划中出现的名词,竟然在此「留学」
一年多的时间,除了在此将论文完成,也体验了她的自然美景.从中
山到东华,实验或许因搬迁实验室而耽搁,但是看著新的实验室学弟
妹们渐渐步上轨道,让实验室又充满生气与活力,也算是另一种训练
与收获吧!感谢实验室曾经帮助过我的所有成员,樊琳老师,陈亚雷
老师,栋梁,稚仁,儒德,郁瑢,惜凤,德仁,琼文,易申,毓君,
家伟,人凤,真秀,筱宁,修齐,毓颀,雅琪,仲轩,家宏,信光,
怡君,千惠,雅慧,文忠,杨红,国正,诗雅,昭惠,佳建,立邦,
特正,子璿,孟贤,维萱,致远,柏如,雯珊,玫琪,元佐,芝莹,
效同,我永远记得您们平日的协助与关怀,这难得的缘分,将是我人
生难忘的回忆.
感谢国际霉浆菌学学会(IOM)组织委员会提供的博士班奖学金,让
我得以前往日本福冈参加第十三届IOM会议,让我更了解世界各国在
霉浆菌学方面的研究,特别感谢其将我们的研究成果从175篇报告中
选出来做为interest session中"Selection and application of new
technologies in basic and applied Mycoplasma research"的口头报告.
谢谢我的爸爸 杨竟成先生及妈妈 林清月女士,您们三十几年来
辛苦地养育与教育,给了我一个最温馨的家,您们永远无怨无悔的付
出与关爱,使我能在无后顾之忧的条件下完成学业.感谢「杨家将」
众姊弟妹们的体恤,鼓励及对爸妈的承欢照顾,让我能更专心完成博
士学位.
最后但不是最少(at last, but not at least)要感谢我最亲爱的老婆丽
环,在这几年来不断地给我支持与鼓励,陪我走出许多的挫折与低潮,
百般容忍我的情绪与脾气,更感谢她为我们生下了可爱的儿子亚适,
给了我努力的另一个原动力.老婆,辛苦了,谢谢你!我拿到Ph.D.
学位,你也应该获颁PHT(push husband through)的证书.
完成博士学位不是学习的结束,而是人生另一个阶段的开始,非
常感谢李水龙老师,宣大卫老师及林白翎老师的推荐,让我得以顺利
申请到史丹佛大学(Stanford University)生物系Dr. Yanofsky实验室从事
博士后研究的机会,这将是提升自我能力,拓展更宽广视野的良机.
无论如何,我将以从父母亲身上力行学得以下之座右铭来惕励自己,
迎向未来的挑战.
『大地藏无尽,勤劳兹有生;念哉斯意厚,努力事春耕.』
目 录
页次
目录 ……………………………………………………………………………… Ⅰ
图次 ……………………………………………………………………………… Ⅲ
表次 ……………………………………………………………………………… Ⅴ
中文摘要 ………………………………………………………………………… 1
英文摘要 ………………………………………………………………………… 3
壹, 绪言 ………………………………………………………………………… 5
贰, 背景
一, 霉浆菌 ………………………………………………………………… 6
二, 猪霉浆菌性肺炎(swine mycoplasma pneumonia) …………………… 12
三, 抗原决定位图谱分析 ………………………………………………… 19
四, 噬菌体呈现技术 ……………………………………………………… 19
五, 疫苗类型及发展趋势 ………………………………………………… 24
六, 本实验室先前的研究成果 …………………………………………… 25
七, 研究目的与实验策略 ………………………………………………… 26
参,材料与方法
一,材料 …………………………………………………………………… 27
二,菌种保存双重玻璃管之开封 ………………………………………… 29
三,蛋白质含量之测定 …………………………………………………… 30
四,兔抗猪肺炎霉浆菌抗体IgG的纯化 ………………………………… 30
五,纯化后抗体IgG的活性分析 ………………………………………… 32
六,噬菌体效价(titer)的测定 ……………………………………………… 32
七,生物亲和性筛选 (bio-panning) ……………………………………… 33
八, 接合专一性测试 ……………………………………………………… 34
九, DNA定序反应 ……………………………………………………… 35
十, 猪肺炎霉浆菌抗原决定位图谱之分析 ……………………………… 38
十一, 噬菌体抗原的制备 ………………………………………………… 39
十二, 动物免疫 …………………………………………………………… 39
十三, 抗血清,粪抗体及肺冲洗液的制备 ……………………………… 40
十四, 抗体效价及IgG亚型(subclass)之分析 …………………………… 42
I I
十五, 分析噬菌体免疫产生之抗体对猪肺炎霉浆菌蛋白之辨识及对不同
霉浆菌菌株间的交叉反应 ………………………………………… 43
十六, 猪肺炎霉浆菌生长抑制测试 ……………………………………… 44
十七, 噬菌斑降减试验法 ………………………………………………… 45
肆,结果
一,猪肺炎霉浆菌抗原决定位图谱分析
1. 兔抗猪肺炎霉浆菌抗体IgG的纯化及活性分析 ………………… 46
2. 生物亲和性筛选 …………………………………………………… 47
3. 筛得之噬菌体与纯化抗体结合专一性之确认 …………………… 47
4. 噬菌体外源heptapeptide的基因序列分析 ……………………… 48
5. 噬菌体呈现外源heptapeptide序列分析 ………………………… 48
二,猪肺炎霉浆菌疫苗研发
1. 小鼠免疫反应测试 ………………………………………………… 50
(1) 抗体IgG之效价分析 ……………………………………… 50
(2) 剂量效应 …………………………………………………… 50
(3) 佐剂效应 …………………………………………………… 51
(4) 与市售不活化疫苗(RespiSure)之比较 …………………… 51
(5) 血清IgG亚型抗体之分析 ………………………………… 51
(6) 粪抗体及肺冲洗液之抗体IgA反应 ……………………… 52
2. 筛选之噬菌体诱发的抗体对猪肺炎霉浆菌蛋白之辨识分析 …… 52
3. 猪肺炎霉浆菌之生长抑制测试 …………………………………… 53
4. 噬菌斑降减试验法(plaque reduction test) ………………………… 54
5. 噬菌体疫苗诱发的抗体对不同菌株间之交叉反应测试 ………… 55
伍,讨论 ……………………………………………………………………… 56
陆,参考文献 ………………………………………………………………… 64
柒,图表 ……………………………………………………………………… 74
捌,附录 ……………………………………………………………………… 113
II II
图 次
页次
图一 猪肺炎霉浆菌之菌落型态 ………………………………………… 74
图二 霉浆菌与其他生物大小之比较 …………………………………… 75
图三 猪肺炎霉浆菌与气管纤毛(cilia)之吸附情形……………………… 76
图四 感染猪肺炎霉浆菌之肺脏病变 …………………………………… 77
图五 抗原决定位的种类 ………………………………………………… 78
图六 丝状噬菌体的生活史 ……………………………………………… 79
图七 M13噬菌体的基因排列顺序及蛋白质功能 ……………………… 80
图八 噬菌体呈现系统的型式 …………………………………………… 81
图九 呈现在噬菌体pIII外套蛋白表面之外源peptide ………………… 82
图十 实验策略流程图 …………………………………………………… 83
图十一 外源peptide插入pIII蛋白N端示意图 ……………………… 84
图十二 兔抗猪肺炎霉浆菌血清纯化及活性测试 ……………………… 85
图十三 生物亲和性筛选三回合(three rounds)所冲提之噬菌体数目…… 86
图十四 纯化过之兔抗猪肺炎霉浆菌抗体与筛得的噬菌体结合专一性
之分析 …………………………………………………………… 87
图十五 竞争型ELISA测试 ……………………………………………… 88
图十六 经生物亲和性筛选所得到之噬菌体DNA及其序列 ………… 89
图十七 猪肺炎霉浆菌P 97吸附蛋白之拟抗原决定部位(mimotopes)
分析 ……………………………………………………………… 90
图十八 以PC/GENE软体分析猪肺炎霉浆菌P 97吸附蛋白之抗原决
定部位 …………………………………………………………… 91
图十九 不同时间诱发的抗体IgG效价 ………………………………… 92
图二十 筛选之噬菌体诱发的抗体IgG对猪肺炎霉浆菌之免疫测试 … 93
III III
图二十一 筛选之噬菌体诱发的抗体IgG亚型效价分析 ……………… 94
图二十二 筛选之噬菌体诱发的抗体IgA分析 ………………………… 95
图二十三 筛选之噬菌体诱发的抗体对猪肺炎霉浆菌蛋白之辨识分析… 96
图二十四 Friis培养液吸收光谱图 ……………………………………… 97
图二十五 猪肺炎霉浆菌生长抑制测试 ………………………………… 98
图二十六 噬菌斑降减试验法 …………………………………………… 99
图二十七 筛选之噬菌体及Pfizer疫苗诱发的抗体对不同菌株间之交叉
反应 …………………………………………………………… 100
图二十八 重组DNA与噬菌体呈现技术在疫苗研究策略上之比较 … 101

IV
表 次
页次
表一 柔膜体纲 (Mollicutes) 与其他真细菌类 (eubacteria) 特性的主
要差异 …………………………………………………………… 102
表二 柔膜体纲 (Mollicutes) 的主要特性与分类 …………………… 103
表三 培养基及培养液之配制 ………………………………………… 104
表四 缓冲液及实验试剂之配制 ……………………………………… 105
表五 Friis medium 的制备 …………………………………………… 107
表六 以PC/GENE之QGSEARCH程式进行筛选所得heptapeptides
与猪肺炎霉浆菌蛋白质序列比对之操作步骤 ………………… 108
表七 经生物亲和性筛选所得到噬菌体之外源氨基酸序列 ………… 109
表八 噬菌体呈现phagotopes所对应到之猪肺炎霉浆菌蛋白质 …… 110
表九 噬菌体呈现phagotopes彼此间一致性序列之比对 …………… 111
表十 测试之疫苗诱发的抗体在不同菌株间之交叉反应分析 ……… 112
V V
中文摘要
猪肺炎霉浆菌是导致猪只慢性肺炎的致病因子,因为肺部病变使
得生长速率及饲料换肉率降低,进而造成经济上的损失.虽然近年来
有四种霉浆菌的基因组被定序完成,猪肺炎霉浆菌的基因组定序也接
近完成阶段,但只有少数基因及其蛋白质被深入研究,而且其分子层
次的致病机转也尚未清楚,分子疫苗之研发也在起步阶段.
为了了解更多关於抗原决定位结构的资讯,以做为研发对抗此病
原菌之分子疫苗的基础,本研究采用两个噬菌体呈现逢机七库来
确认由纯化过的兔抗猪肺炎霉浆菌抗体所辨识的抗原决定位.经过三
次的生物亲合性筛选后,挑选出个别的噬菌体以西方墨点分析法及竞
争型酵素连接免疫吸附分析法证明筛选所得噬菌体与纯化抗体间的结
合专一性.进一步将筛选所得噬菌体进行DNA 序列分析,并推导成
氨基酸序列.经由筛选所得噬菌体pIII蛋白所呈现的外源氨基酸序列
之间的比对,发现有六个一致性的序列,包含三至七个氨基酸,这些
一致性的序列可能是猪肺炎霉浆菌重要抗原决定位之所在.经由搜寻
美国国家生物技术资讯中心的蛋白质资料库,比对已知的猪肺炎霉浆
菌蛋白质序列,发现筛选所得的拟抗原决定位主要位在某些表面蛋白
质上.例如P97蛋白质,此蛋白质是猪肺炎霉浆菌附著於纤毛时所必
需的吸附蛋白,分析发现其可能的主要抗原决定位是在第365到382,
395到403及436到452氨基酸的位置,而其重复序列R1及R2也被
拟抗原决定位对应到.
为了评估这些拟抗原决定位是否具有开发成为分子疫苗的潜力,
於是选择某些带有拟抗原决定位的噬菌体为抗原,经由腹腔及鼻腔的
途径进行小鼠的免疫测试.由血清中G型免疫球蛋白,粪萃取液及肺
1
冲洗液的A型免疫球蛋白的分析发现有不错的专一性抗体反应产生.
经由分析血清中抗体IgG亚型的结果,发现主要是以 IgG1为主,可
知在本实验所采取之策略条件下,噬菌体衍生之疫苗是活化Th 2细胞
免疫途径,与测试的不活化死菌疫苗相似,此途径有助於消除附著在
细胞外的微生物.经由西方墨点法分析,发现每一个经由噬菌体衍生
之疫苗所产生的抗体,可以辨识二至五个猪肺炎霉浆菌蛋白质.再配
合生长抑制测试结果,推测其中所挑选的噬菌体 CS 4及φ 58是较佳的
疫苗候选者;而且发现某些蛋白质(97 kDa,56 kDa及30 kDa)在抑制
猪肺炎霉浆菌生长方面扮演著重要的角色.
利用M13 噬菌体感染E. coli是藉由噬菌体pIII外套蛋白的N端
与E. coli性纤毛(F pili)结合而引起感染之特性,本研究提出了噬菌斑
降减试验法来证明以噬菌体衍生之疫苗接种后产生之体液免疫反应
中,含有专一性地针对插在pIII外套蛋白上外源之抗体.
本研究结果提供了关於猪肺炎霉浆菌抗原决定位的更多相关资
讯,经由小鼠实验也发现某些噬菌体呈现之猪肺炎霉浆菌拟抗原决定
位,具有开发成为疫苗的可行性.本研究所采取的策略,可缩短疫苗
的研发时程并提供研发对抗猪肺炎霉浆菌疫苗时的另一选择途径.
2
Abstract
Mycoplasma hyopneumoniae is the etiologic agent causing chronic pneumonia of swine.
The lung lesions of swine produce the slower growth rate and lower feed conversion ratio and
finally cause economic loss. Although four genome projects of mycoplasma species had been
completed, the genome-sequencing project of M. hyopneumoniae also closed to the finished
stage. However, only a few genes and proteins of M. hyopneumoniae have been studied, the
molecular pathogenic mechanism remains elusive. The research of molecular vaccine is still
preliminary.
In order to obtain more information about epitope structures as the basis to develop
molecular vaccine against this pathogen, two phage-displayed random heptapeptides libraries
were used to identify epitopes recognized by purified IgG of rabbit anti-M. hyopneumoniae
hyperimmune serum in this study. Individual phage clones were isolated and verified the
binding specificity to the purified IgG by Western blot analysis and competitive ELISA after
three rounds of biopanning. The selected clones were further characterized by DNA
sequencing analysis and deduced to amino acid sequences. There are six consensus sequences
contained tri- to hepta-peptide existing among the selected phage clones by aligning the
sequences of foreign amino acids displaying on pIII protein. The consensus sequences may be
serving as crucial epitopes of M. hyopneumoniae. By searching the protein database of M.
hyopneumoniae deposited in NCBI, some surface proteins were matched by the selected
mimotopes. Like P97, the essential protein for attaching to cilia of swine, the deduced
epitopes mainly located at a.a. from 365 to 382, 395 to 403 and 436 to 452, the R1 and R2
repeated sequences also matched by the mimotopes.
3
To evaluate the potential of these mimotopes as effective vaccine, several phage clones
were chosen to immunize mice by intraperitoneal and intranasal administration. There are
specific antibody responses to these mimotopes existing in serum IgG, fecal extracts and
bronchoalveolar lavage fluids IgA. The serum IgG subclass profiles analysis reveals that
these are mainly existed in IgG1 subclass. Base on the results of IgG subclass profiles
analysis in sera, the results suggest that the phage-derived vaccines mainly activate Th2
cellular immunity pathway with the strategy used in this study. The similar results were found
in the inactivated vaccine. The Th2 activation will promote the elimination of extracellular
microorganism. Western blotting analysis showed that each serum raised by the phage clones
could recognize 2 to 5 mycoplasma proteins. With the results of growth inhibition assay, we
found that the selected phage clones CS4 and φ58 are better vaccine candidates and some
proteins (97 kDa,56 kDa and 30 kDa) may play crucial roles in block the bacteria growth.
The advantage was taken of the natural property of M13 phage to infect E. coli, which
is initiated by the N terminal of pIII coat protein binding with the F pili of E. coli. Plaque
reduction tests were proposed to demonstrate the humoral immunity responses induced by
phage-derived vaccine containing the antibodies specifically against the foreign peptide
displayed on pIII coat protein.
The present results provide more epitope information of M. hyopneumoniae. The mice
immunization results reveal that the phage-displayed mimotopes can be used as potential
vaccine candidates. The strategy presented in this study can shorten the time course for
vaccine development and provide an alternative pathway for searching vaccine candidates
against M. hyopneumoniae.
4
壹,绪言
霉浆菌是目前所知在自然界最小且最简单的具有复制能力之原核
生物,其基因体仅580 ~ 1350 kb,约为大肠杆菌的六分之一大小.猪
肺炎霉浆菌是造成猪只慢性流行性肺炎的主要致病因子,猪只因为感
染此病而造成畜牧业很大的经济损失,而此疾病的高感染率,更是防
疫工作的重点项目之一.虽然此病可利用抗生素治疗,然而施打疫苗
防范未然仍是最经济有效的策略,目前传统疫苗主要以死菌疫苗为
主,其保护效果有限,而且生产成本高.随著疫苗学相关领域之知识
及技术的进步,研发分子疫苗来控制猪霉浆菌性肺炎乃必然的趋势.
目前对猪肺炎霉浆菌抗原之研究仍相当有限,而分子层次的致病
机制仍待厘清.因为此病菌吸附於猪只气管纤毛细胞而引发病变,一
般认为此菌的表面膜蛋白可能是致病的重要因子.因此,本研究试图
采用纯化过的兔抗猪肺炎霉浆菌血清,对噬菌体呈现库进行生物
亲和性筛选,来分析猪肺炎霉浆菌之抗原决定位图谱,将得到的抗原
决定位相关资讯,做为研发疫苗的基础,并藉由动物免疫及相关试验,
进一步评估开发为猪肺炎霉浆菌疫苗之可行性.
5
贰,背景
一,霉浆菌 (Mycoplasma)
1. 霉浆菌( Mycoplasma )名称之由来
1898年,Nocard 及Roux首先於培养基中加入动物血清,而成功
培养出牛胸膜性肺炎 ( bovine pleuropneumonia ) 病原体.1929年,
Elford发现这一类微生物能通过细菌过滤器,大小约在 125 ~ 150 nm
左右.在1940年以前,科学家们由各种动物,如鸡,人以及腐败植物
或水沟中分离出类似牛胸膜性肺炎菌之微生物而通称为
Pleuropneumonia-like organisms (PPLO).然而对於此类微生物之命名,
学者们仍存在有种种不同的意见.直到1956年,Edward 及Freundt
提出Mycoplasma之属名被采用后,Mycoplasma乃取代PPLO之名称
而被广泛使用.Mycoplasma是衍生自希腊字 "mykes",表示「真菌」
之意;及 "plasma",代表「似霉菌,真菌型态」,此乃Mycoplasma
名称之由来.由於感染昆虫,植物的病原性霉浆菌,除了螺旋霉浆菌
外,尚无法在人工合成培养基上生长,此与动物病原性或腐生性霉浆
菌可以在人工合成培养基上生长者不同, 故早期被暂称为拟霉浆菌微
生物( mycoplasma-like organism;MLO ),目前已经提出用植物霉浆菌
( phytoplasma )来取代( Razin et al, 1998 ).
6
2. 霉浆菌之分离,培养
霉浆菌广泛存在自然界,某些菌种为昆虫,植物,动物和人类的
病原菌.可自动物,人的呼吸及泌尿生殖道中分离出来,而自动物分
离的霉浆菌,有些会造成肺炎,关节或神经炎,有些则是腐生性.在
细菌细胞膜当中,只有霉浆菌细胞膜含有胆固醇( cholesterol ),但霉浆
菌不能合成胆固醇,故培养基中需含此物质.因此,不像一般
prototroph,霉浆菌有非常复杂的营养需求.培养霉浆菌的培养基最适
合之酸碱度为pH 7.2 ~ 7.4,通常需要添加肉汁,血清及酵母抽出物
( yeast extract )等;其中,肉汁以牛心筋浸出液最为优良,而血清以马
血清效果最佳.一般感染动物之霉浆菌的最适培养温度为 37℃,而生
长水沟中之M. laidlawii则可在30℃增殖.故霉浆菌之生长条件与寄主
种类或栖息场所有密切的关系.有些霉浆菌在初代培养时需要空气,
而少数则必须在厌气( anaerobic )状态下培养.某些感染动物的霉浆菌
在初代培养时,必须用液体培养基才能生长,因为这些霉浆菌生长的
营养需求较为严苛,如感染猪的M. hyopneumoniae及M. flocculare需
用液体培养基继代几次后才能接种於固体培养基.霉浆菌於55℃处理
15分钟或60℃加热5分钟即可被杀死(翁等, 1996).某些动物病原性,
腐生性霉浆菌和植物病原性螺旋霉浆菌能在人工合成培养基上生长,
产生很小如荷包蛋( fried-egg shaped )的菌落(图一);其他植物病原性霉
浆菌尚不能培养.植物霉浆菌亦曾尝试以人工培养基,昆虫组织或培
养细胞中培养,结果显示植物霉浆菌较动物之霉浆菌的培养更为困
7
难,有的在初代培养后不能继代培养( subculture );有的虽可继代培
养,但生长不良.因此,植物霉浆菌的培养方法仍为今后重要之研究
课题(蔡,2001).
3. 霉浆菌之性状
霉浆菌是原核生物,为革兰氏阴性菌,不具有鞭毛,不形成孢子.
霉浆菌与其他细菌主要不同点为缺乏细胞壁,因此,其菌体可随不同
环境条件及生长阶段而呈球形,棒状或多形性等形态.一般呈直径约
0.1 ~ 1.0 m之球形,棒状可长达150 m,螺旋霉浆菌( Spiroplasma )
则呈螺旋形.霉浆菌比天花病毒还小,可通过0.45 m孔径的滤膜,
因此曾经一度被误认为是滤过性病毒,霉浆菌与其他生物大小之比较
如图二所示.菌体构造主要由原核性核( prokaryon ),胞浆及胞膜组成,
外表被一单位胞膜(共三层)包住,厚度约10 nm.内层及外层主要为醣
类与蛋白质,中间层含有大量胆固醇及磷脂质,此等物质对菌体生长
及细胞膜之完整性,扮演重要的角色(Tully et al, 1979).细胞内含有核
糖体,但不具有粒线体和高尔基氏体.细胞内含有DNA及RNA,基
因组大小约580 ~ 1,350 kb,% G + C为23 ~ 40 %,使用的基因密码与
一般生物不同之处在於UGA codon,在一般生物为终止密码(stop
codon),而在霉浆菌则被转译为色氨酸( tryptophan ).繁殖方式以二分
裂法生殖为主,形成球形或丝状细胞;某些行出芽生殖( budding ).对
8
四环霉素( tetracycline ),氯霉素( chloramphenicol )敏感,而对青霉素
( penicillin )有抗性.此与L-form细菌不同,L-form细菌是指一般细菌
在某种条件下丧失细胞壁而成为球形体( spheroplast )者,不过此类细菌
仍具有重新制造细胞壁的能力,例如Agrobacterium tumefaciens.霉浆
菌与其他真细菌类( eubacteria )的主要差异如表一所述( Razin et al,
1998 ).
4. 霉浆菌的致病机转
霉浆菌的致病过程包括菌体对宿主的吸附( adhesion ),菌落形成
( colonization ),寄生在宿主表面或是进入组织细胞内,逃避宿主免疫
系统的作用,进而造成宿主生理上的疾病.因此,致病过程可就霉浆
菌本身的致病性( pathogenicity )及引发宿主的免疫反应两方面加以探
讨.以猪肺炎霉浆菌为例,Mycoplasma hyopneumoniae吸附到猪气管
表皮,与纤毛(cilia)紧密结合,进而使得纤毛剥落(图三),导至降低或
丧失机械性防御过滤能力,甚至造成纤毛上皮细胞变性坏死,助长其
他病原侵入滋生(DeBey and Ross, 1994).在霉浆菌感染初期,会抑制
呼吸道免疫系统,并降低肺泡吞噬细胞对病原的吞噬及清除能力,使
肺脏对二次细菌感染的抵抗力下降,更易并发严重的化脓性支气管肺
炎(Asai et al, 1996).另外有研究显示霉浆菌可经由释放superoxide
9
(Almagor et al, 1984),nuclease (Paddenberg et al, 1998;Bendjennat et al,
1999)来破坏宿主细胞.目前只了解少数与霉浆菌致病相关的基因,其
中以导致人类肺炎的Mycoplasma pneumoniae之黏附蛋白( adhesin ) P1
基因了解最为透彻,显示其transcription的机制与原核生物类似,但遗
传密码使用略有不同(Su et al, 1987).大部分霉浆菌附著在呼吸道或泌
尿生殖道的表皮,很少侵入组织,因此被认为是表面寄生.但在AIDS
或器官移植病人,发现某些霉浆菌(如M. fermentans及M. penetrans )
会侵入组织及细胞内( intracellular )的位置(Taylor-Robinson et al,
1993).近年来,科学家们陆续完成了M. genitalium (Fraser et al, 1995),
M. pneumoniae (Himmelreich et al, 1996),M. pulmonis (Chambaud et al,
2001)及M. penetrans (Sasaki et al, 2002)全部基因组( genome )的序列定
序;加上以M. pneumoniae及M. genitalium为对象的蛋白体学
( proteomics )研究进展(Regula et al, 2000;Balasubramanian et al,
2000),将使我们能藉由霉浆菌与宿主之间蛋白质的变化情形,进一步
探讨霉浆菌的致病机制.
5. 学术研究上的重要性
霉浆菌(Mycoplasma) 是目前所知自然界中最小,最简单可自由独
立存活及自我复制能力的原核生物.在目前分类学上的定位是属於柔
膜体纲(Mollicutes);霉浆菌目(Mycoplasmatales);霉浆菌科
10
(Mycoplasmaceae)(表二).由於霉浆菌为目前所知自然界中构造最简单
的自营原核生物,接近所谓"最小细胞"之观念(Razin et al, 1998).因此
了解其基因组之构造,功能及调控方式,不但在基因分子生物学有其
特殊意义,亦可略窥基本生命形态之奥秘,使其成为研究细胞生物学
很好的模式.而找出维持生命基本基因以求进一步重组,合成出生命
的理论,一直以来都是基因研究领域中的尖端议题.1999年12月,科
学(Science) 杂志发表了科学家利用霉浆菌 (Mycoplasma genitalium)进
行实验,利用跳跃子产生突变(transposon mutagenesis)的方式,分别阻
断四百多个基因并观察其表现.发现在M. genitalium的480个基因中
有265到350个在实验室生长条件下是必需的,多数是与产生能量或
复制(replication)等功能相关的基因,其中有100个基因功能未明
(Hutchison et al, 1999).此研究显示该细菌维持基本生命所需要的基因
已经成功排出序列,亦即找出维持生命的最基本基因组合,对未来遗
传工程学的发展有很大帮助.而在已知最简单细胞的必需基因中有著
如此多未知功能的基因,表示所有构成细胞生命基础的基本分子机制
仍待进一步研究.虽然,霉浆菌的组织结构与其他生物有很大差距,
科学界要藉此技术创造多细胞生命,还言之过早.但这是基因学发展
过程非常重要的突破,可做为进一步了解更复杂生命体的基础.
11
二,猪霉浆菌性肺炎(swine mycoplasma pneumonia)
1. 病原及传染途径
猪霉浆菌性肺炎又称为猪地方性肺炎(swine enzootic pneumonia,
SEP),感染猪只的霉浆菌主要有M. hyopneumoniae,M. hyorhinis及
M. hosynoviae三种,引起猪霉浆菌性肺炎的病原为Mycoplasma
hyopneumoniae.霉浆菌肺炎於各年龄层猪只皆会感染,大致上以肥育
期约35 ~ 60公斤之猪只感染最为严重.主要传染途径是咳嗽飞扬的泡
沫经由空气传播,鼻头接触到后,吸入呼吸道而感染,散播距离可达
2.5 ~ 3公里.哺乳中的仔猪如母猪为带菌者,容易经由母猪垂直传染
给仔猪,通常於2 ~ 6周龄发病.另一途径是藉由感染猪只与健康猪只
间的接触而传染(廖, 1996).
2. 流行率
猪霉浆菌性肺炎是极为普遍的一种猪病,在世界大多数地区都有
发生.台湾地处亚热带海岛型气候,高温潮湿,很适合微生物的发育
繁殖,且本省养猪场密度高,饲养的猪只太密集,因此本病的发生相
当严重.从屠宰场猪只肺脏病变检查发现有些猪场之屠宰猪,霉浆菌
肺炎发生率高达百分之百,可见本病感染之严重程度(翁, 2001).
Yagihashi等人针对日本境内感染猪霉浆菌性肺炎调查指出,在411头
12
母猪中,72%为血清抗体阳性(seropositive),在一到六个月龄的3267
头育肥猪只中,以四到六个月龄的血清抗体阳性比例最高(Yagihashi et
al, 1993).此外, Young 针对 Iowa 境内不同猪龄的种猪所做的调查
发现:7321 个血清中有 22% 有补体固定(complement fixation)抗体反
应.而在 597 个猪场中,60% 的猪场为猪霉浆菌性肺炎阳性感染场
(Young et al,1983).
3. 临床症状
实验感染猪肺炎霉浆菌的潜伏期约12~15日,自然感染为17~30
日.本病为慢性呼吸道疾病,其主要特徵是乾咳,气喘,食欲不佳,
生长发育迟缓,亦可发现眼神呆滞,眼结膜充血.单纯感染猪肺炎霉
浆菌造成轻度至中度病变的猪只,临床症状最明显的是长期的乾咳,
食欲及精神尚佳,并无明显的发烧情形,对於生长效率的影响也不显
著,病猪外表上与健康猪相似,但比较不丰满.若合并感染繁殖呼吸
症状群病毒(PRRSV)再并发二次细菌性感染,例如巴斯德杆菌
(Pasteurella multocida),放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae),链
球菌(Streptococcus spp.),博德氏菌(Bordetella bronchiseptica),猪只将
呈现食欲衰退,发高烧,精神萎靡,被毛粗刚和逐渐消瘦,除严重咳
嗽外,肺部常形成脓疡,还有腹式呼吸症状,并发肺虫症时会产生肋
膜炎,最后形成石头猪而被淘汰或死亡(邱,2001;廖, 1996).
13
4. 诊断
病理学诊断:单纯感染霉浆菌肺炎,其肺脏病变甚轻微,只限定
於两侧尖叶,心叶,横膈膜的尖端呈肉样坚实(图四A ),病灶切面处
细支气管腔内有清澈分泌液,在组织病理病变上,以支气管性间质性
肺炎 (Bronchointerstitial pneumonia)为主,主要特徵为在血管和细支气
管周围有明显类淋巴小结 (Lymphoid follicle)增生聚集.若合并感染繁
殖呼吸症状群病毒(PRRSV)再并发二次性细菌感染时,将转至重度肺
炎病变,肺脏两侧之尖叶,心叶及横膈膜叶呈现弥漫性之肺炎病灶,
外观呈鱼肉样且甚坚实,病灶区的切面可见从支气管腔流出黄色浓稠
之脓液,甚至有大小不一之脓疡散布於肺炎病灶区中 (图四B),在组
织病理方面,除可见间质性肺炎外,於支气管腔及肺泡腔内有大量中
性球及少量淋巴球和吞噬细胞浸润,而形成了化脓性支气管肺炎
(Purulent bronchopneumonia)之永久性病变(邱, 2001).
血清学诊断:包括间接血球凝集反应(indirect hemagglutination test,
IHA),补体结合反应(complement fixation, CF),凝集反应
(hemagglutination test, HA) ,酵素连结免疫吸附试验(enzyme linked
immunosorbent assay , ELISA)及乳胶凝集反应(Latex agglutination tests,
LAT)等.
病原学诊断:包括病原分离培养及鉴定,PCR侦测病原及电子显
微观察肺脏病材切片.
综合上述病理学,血清学及病原学诊断三者结果均为 Mycoplasma
hyopneumoniae 所引起之霉浆菌肺炎者,是为确定病例(翁, 2001).
14
5. 防治之道及疫苗研发现况
猪霉浆菌性肺炎系属高传染率低死亡率的慢性病,对於猪只霉浆
菌性肺炎的防治之道,主要包括饲养管理,药物的使用及疫苗的接种.
单独以药物来清除控制猪霉浆菌肺炎极为不易,随时有合并感染病毒
及细菌的可能,造成生长不良或死亡而导致经济损失,此时最好进行
霉浆菌疫苗接种,若能配合良好的饲养管理(例如早期离乳),以阻断病
原体由母猪传染至仔猪的传染途径,卫生消毒,畜舍通风及适时投药,
疫苗的防治效果会更好.但是疫苗效果也会受到其他病原感染所影
响,如猪瘟,假性狂犬病,猪繁殖呼吸症候群,放射杆菌肺炎和沙门
氏杆菌症等,尤其是猪瘟,假性狂犬病的防疫计画需执行彻底,霉浆
菌肺炎的防治才能够有较佳的效果.
(1) 饲养管理
有效的防治措施最重要在於有良好的饲养环境,包括良好的空气
品质,通风,温湿度,降低粉尘及适当的饲养密度;在感染场中,严
格的统进统出(all-in/all-out)管理似乎是唯一也是最有效的方法(廖,
1996).
(2) 药物的使用
因为霉浆菌没有细胞壁,所以大部分抗生素的效果并不佳.只有
少数药品如泰霉素 (Tylosin),泰妙素(Tiamulin),林可霉素
(Lincomycin),氧四环霉素(Oxytetracycline)和氯四环霉素(Chloro-
tetracycline)等有效,其中以泰妙素和氧四环霉素一起使用效果最好,
15
但是也只能抑制霉浆菌生长而不能完全清除,因此要靠投药来降低本
病的感染程度有一定的限制.此外在感染发生之前投予四环霉素
(tetracycline)可以抑制组织病变的形成(廖, 1996).虽然有报告指出奎林
类药物能有效治疗猪霉浆菌肺炎,但仍然无法将猪场中的猪肺炎霉浆
菌完全清除(Hannan et al, 1989).
(3) 疫苗接种与研发现况
对於猪霉浆菌肺炎,疫苗的接种是预防控制此病的最佳途径.目
前传统疫苗大多以不活化之死菌加入不同佐剂制成,但免疫保护效果
有限.在国内,养猪科学研究所翁仲男所长曾以福马林不活化菌体加
上水溶性抗原,以氢氧化铝为佐剂制成疫苗,发现免疫保护效果良好
(邱, 1990),并以微胶囊包埋技术制成口服疫苗(Weng, 1992).而市售的
猪霉浆菌肺炎不活化菌苗有美国辉瑞(Pfizer)药厂制造的RespiSure ,
法国龙马跃(Merial)公司生产的Hyoresp ,美国惠氏(Wyeth)药厂生产的
Suvaxyn Respifend MH及德国百灵佳(Boehringer Ingelheim)公司制造
的Ingelvac M.hyo.
猪肺炎霉浆菌次单位疫苗(subunit vaccine)之研发仍在起步阶段,
目前关於猪肺炎霉浆菌蛋白之研究有:
(1) 54 kDa cytopathic factor,是一种膜蛋白,等电点为6.2,可诱使猪
及人类肺纤维母细胞产生病变(Geary and Walczak, 1985).
(2) 65 kDa protein,经分析发现是一表面脂蛋白(surface lipoprotein),其
C端是免疫原区域(immunogenic domain)所在,但其功能为何则未知
16
(Kim et al, 1990).
(3) 36 kDa protein,经氨基酸序列比对及生化活性分析,显示是一种
lactate dehydrogenase, 以此抗原产生的抗体并无法抑制猪肺炎霉浆
菌的生长,评估未具有开发成为疫苗之潜力(Haldimann et al, 1993).
(4) 46 kDa protein,是一表面蛋白,已被用来做为猪肺炎霉浆菌的
ELISA之诊断,其N端具有与原核生物脂蛋白的典型signal peptide
相似的序列,推测可能是一种surface lipoprotein (Futo et al, 1995).
(5) Fagan等人分离出猪肺炎霉浆菌的11 kDa抗原,其序列相似於原核
生物 ribonucleotide reductase的R2 subunit,将其与β-galactosidase
构成重组蛋白,以此做为疫苗,测试结果发现可明显降低猪的肺部
病变(Fagan et al, 1996).并以减毒的Salmonella typhimurium为载体
(carrier)将此抗原做成口服疫苗,在小鼠及猪只进行测试,结果显示
可刺激肺部黏膜免疫反应并降低猪的肺部病变(Fagan et al, 1997,
2001).
(6) P97蛋白,是一个outer membrane- associated protein,与猪肺炎霉浆
菌附著於纤毛细胞有关,研究发现此蛋白C端的R1重复序列
AAKPV(E),在纤毛吸附作用上扮演重要角色 (Hsu and Minion,
1998;Minion et al, 2000).此R1重复序列被结合到改造过的
Pseudomonas exotoxin A上,做成次单位疫苗,在小鼠及猪只的实
验中均发现有明显的IgG抗体反应(Chen et al, 2001).此蛋白的C
端包含R1,R2重复序列区域,被成功的结合并表达在经减毒之
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Erysipelothrix rhusiopathiae YS-1的表面蛋白SpaA.1上,以此做为
减毒疫苗,经猪只免疫试验发现在呼吸道产生抗P97的IgA抗体
( Shimoji et al, 2002).
(7) 124 kDa Mhp1 protein,此蛋白质被结合到glutathione S-transferase
(GST)上,形成GST-Mhp1融合蛋白,以此做为重组疫苗对猪只进
行免疫测试,发现可降低猪肺部损伤及咳嗽症状,但效果并不显著
(King et al, 1997).
(8) P42/65蛋白,在M. hyopneumoniae中表达出65 kDa的蛋白质,经
序列比对结果显示,与Mycoplasma genitalium 的HSP70 (heat shock
protein 70)基因有62% 的一致性;与Bacillus subtilis 的dnaK基因
则有56% 的一致性,经证实此蛋白是热休克蛋白(Chou et al, 1997).
(9) P60/72蛋白,是一个cytosolic protein,在M. hyopneumoniae中表达
出72 kDa的蛋白质,经序列比对及实验证明此蛋白为
phosphoenolpyruvate-sugar phosphotransferase enzyme I (PTSI),其转
录起始点及启动子的位置也已被分析(Chung et al, 2000).
由上述研究成果可知,猪肺炎霉浆菌的基因重组疫苗或次单位疫苗仍
有待进一步研发.此外,Moore等人以Expression library immunization
(ELI)的方式,从含有20,000个clones的原始library中,筛选出五个
sub-libraries进行动物试验,结果发现其中二个含有96个及480个clones
的sub-libraries具有良好的保护作用,将进一步研究这些具有保护作用
的clones,以做为开发重组次单位疫苗之用(Moore et al, 2002).
18
三,抗原决定位图谱分析
常见的抗原决定位图谱分析方法(Brian and Ronald, 1996),包括(1)
以各种蛋白质酵素(protease)将蛋白质切割成各种片段,再确认具有与
抗体反应的片段,并加以分析其氨基酸序列.(2)以化学修饰法修饰不
同的氨基酸,再看哪些位置因修饰作用而改变与抗体的反应,进而确
认其抗原决定位之位置.(3)以人工方式合成一系列可涵盖抗原氨基酸
序列的peptides,再确认具有与抗体反应的片段,此方法适用於分析线
性的抗原决定位(linear epitope)(图五A).(4)以核磁共振光谱(nuclear
magnetic resonance,NMR)或X射线绕射法分析结晶体,了解抗原结构
后,再分析其抗原决定位.(5)将任意的peptides片段或抗原的cDNA
片段选殖到噬菌体的外鞘蛋白基因上,进而呈现於噬菌体表面,与抗
体进行亲和性反应后,经由分析外鞘蛋白上的插入氨基酸序列,再与
抗原氨基酸序列比较,即可推知抗原决定位可能的位置,此方法适用
於分析构型性的抗原决定位(conformational epitopes) (图五B).
四,噬菌体呈现技术
噬菌体呈现技术(phage display techniques)首先由Smith GP於1985
年所发展的(Smith, 1985).此技术是将标的基因连接於丝状噬菌体之外
套蛋白 pIII 或 pVIII基因的N端或C端,使得标的基因以融合蛋白
的型式呈现於重组噬菌体表面.由於pIII分子较少,用pIII融合展示
19
系统可以筛出与目标物具亲合力 (affinity)片段; 相对的,pVIII分子较
多,因此适用筛选具结合力 (avidity) 片段.
1. 丝状噬菌体(filamentous phage)
Ff class的噬菌体包括M13,fd,f1等,属於潜溶性的(lysogenic)
病毒,其生活史如图六所示,丝状噬菌体首先藉由外套蛋白pIII (gene
III之产物)附著於细菌的F pilus,启动其感染周期.接著经由细胞膜之
内化作用(internalization)将噬菌体的单股DNA(ssDNA)导入细胞中.噬
菌体以此正股ssDNA在细胞中做为模板,合成负股DNA,而成为具
有复制能力的双股DNA (replicative form,RF DNA).RF DNA在pII
及pX蛋白的协助下,进行滚动环状复制(rolling circle replication),而
形成子代正股DNA.此正股ssDNA与pV蛋白形成复合体,运送到细
菌细胞膜附近,在突破细菌细胞膜时,pV蛋白被黏附於其上的几种噬
菌体外套蛋白所取代,包括数千个形成阵列的pVIII蛋白分子及其他四
种minor coat proteins (包括5个插於噬菌体尾端的pIII蛋白分子),而
产生新的噬菌体.丝状噬菌体穿出细菌细胞时,并不将细胞破坏分解,
因此这类噬菌体称为温和型(tempered)噬菌体.
M13噬菌体形状呈细丝状,直径6.5 nm,长约900 nm,为单股环
状DNA,长6.4 kb的基因组序列中,包含10种与复制,型态,外壳
形成有关的不同蛋白质,其基因排列顺序及蛋白质功能如图七所示.
此噬菌体只感染带有F episome的细菌,其pIII蛋白与细菌的纤毛(pilus)
20
的尖端接合,再将其DNA经由纤毛穿透进入细菌中.pIII吸附蛋白分
子量为42.5 kDa,以类似火柴棒的形状存在,N端含有18个氨基酸的
引导序列.功能上而言,由内部双硫键结可区分成三个区域(domains),
N端区域包括负责辨认细菌性纤毛及穿透作用(penetration),C端区域
位在噬菌体外鞘(envelope)内,与型态形成(morphogenesis)及膜的镶嵌
(anchorage)有关,缺乏吸附蛋白明显地降低噬菌体感染能力.
pVIII是主要的蛋白质外套蛋白,在噬菌体表面约有2700个pVIII
蛋白分子,每一个pVIII蛋白由50个氨基酸组成,C端的碱性区域连
接到噬菌体的DNA,中间疏水性区域为pVIII次单位间交互作用所需,
N端的酸性区域则朝外.噬菌体与细菌吸附之一端由少数外套蛋白
(minor coat protein) pIII及pVI组成,另一端则由pVII及pIX蛋白组成,
每一蛋白约有3~5个分子.当细菌复制时,会制造形成噬菌体颗粒所
需的所有蛋白质.噬菌体的组合(assembly)发生在细菌的细胞质膜
(cytoplasmic membrane),新合成的外套蛋白储存於此.细菌的一个生
命周期(life cycle)可产生100 ~ 300个噬菌体.
2. 噬菌体呈现系统的型式
主要有二种不同的载体系统用於噬菌体呈现技术.一种是噬菌体
系统,标的蛋白的基因序列被选殖到pIII或pVIII基因的引导序列与编
码区域(coding region) 之间.因此只有pIII或pVIII融合蛋白被呈现,
称为3型或8型(图八);另一系统是噬质体(phagemid)系统,此载体只
21
含pIII或pVIII基因,细菌及噬菌体的复制起始点.因此,若要产生新
的噬菌体,尚需要靠辅助噬菌体(helper phage)提供组成完整噬菌体所需
之蛋白质才能达成.因为辅助噬菌体提供野生型的pIII及pVIII,因此,
野生型及融合蛋白混合呈现在噬菌体表面,称为3+3型或8+8型(图
八).噬质体系统不只是可以提升噬菌体的感染力及制造效率,在呈现
较长序列时,主要以单价(monovalent)的形式呈现,有利於高亲和性配
位体的筛选.当以噬菌体系统取代上述噬质体系统时,野生型及融合
基因同时存在噬菌体基因组中,呈现出来的重组噬菌体称为33型或88
型(图八).8+8或88型系统可以负载约50 kDa的融合蛋白,而8型系
统只能携带5 ~ 6个氨基酸(Smith, 1993).
3. 噬菌体呈现库(peptide library)及抗体库(antibody library)
呈现在噬菌体表面之外源可分为constraint及unconstraint两
种(图九).constraint的形式是在外源两端分别接上一个cysteine,
而形成双硫键结,使得外源以立体构形呈现,也使得此的易
弯曲性(flexibility)较unconstraint差.因为外源以立体构形呈现,
所以从constraint的库筛选出来之clones较自unconstraint库
筛选出者具有较高的亲和力.目前呈现的外源长度可达38个氨基
酸,然而,由6个逢机的氨基酸序列可产生6.4 × 107不同的序列变异
度;而12个逢机的氨基酸序列可产生4 × 1015不同的序列变异度.目
前噬菌体呈现库的大小约为108~109不同的变异度之clones.因
22
此,大於7个氨基酸序列所形成的噬菌体呈现库,仅能代表所有
可能序列之一部份,无法涵盖所有的序列.
在1990年,英国Medical Research Council (MRC)的John
McCafferty等人,首先应用噬菌体呈现技术,将anti-lysozyme抗体D1.3
的重链及轻链变异区(VH/VL)之基因,用flexible linker (Gly4-Ser)3连接
到fd CAT1载体中,以单链变异区片段(single chain Fv, scFv)的方式呈
现於噬菌体上,模拟抗体之结构与功能,称为噬菌体呈现抗体,并以
Western analysis加以证实(McCafferty et al, 1990).此外,MRC的Tim
Clackson等人则利用半抗原(hapten) 2-phenyloxazol-5-one (phOx)免疫
小鼠,以RT-PCR选殖出小鼠的抗体基因,并将此基因利用噬菌体呈
现技术,表达於fd噬菌体的外套蛋白,构筑成第一个噬菌体呈现抗体
库(Clackson et al, 1991).至今,英国的Medical Research Council在噬
菌体呈现技术上仍居於领先的地位,并提供噬菌体呈现抗体库给学术
界做为研究之用.
4. 在生物科技上的应用
基本上而言,任何有关分子间的辨识,尤其是蛋白质分子间的作
用,均可运用噬菌体呈现技术加以解决.近年来,许多实验室发展出
呈现各种长短不同的库及各种抗体库,成功地应用於:(1)抗原决
定位图谱分析(Cortese et al, 1994;Petersen et al, 1995).(2)蛋白质配位
体(ligand)的确认,进而应用於tumor marker之寻找(Rasmussen et al,
23
2002).(3)模拟碳水化合物等非蛋白质的大分子物质(Grothaus et al,
2000).(4)疫苗及新药的研发(Jefferies, 1998).(5)功能性蛋白质的呈现,
如抗体片段(scFv,Fab'),荷尔蒙,酵素及酵素抑制剂,并藉由抗体-
抗原,荷尔蒙-荷尔蒙接受器,酵素-酵素抑制剂之间功能性的交互作
用,挑选出专一性之噬菌体,来进行相关的研究(Smith and Petrenko,
1997).(6)确认转录作用调节机制中的effectors,如activactor及repressor
(Mazzarelli and Ricciardi, 2001).
五,疫苗类型及发展趋势
目前使用的疫苗类型仍以传统的减毒驯化活菌疫苗及不活化死菌
疫苗为主,此类疫苗大多以病原菌本身或其代谢产生之物质为主要抗
原,常见的主要成分包含蛋白质,脂质及多醣类等,种类多而复杂,
容易大量刺激免疫系统而引发宿主不必要的免疫反应,浪费能量用於
非专一性B细胞及T细胞的活化,既无法消灭病原,甚至产生副作用.
由於近年来分子生物技术的进步,对於病原菌的相关研究更加透
彻,为了改善传统疫苗的缺点,发展免疫反应专一性高的分子疫苗乃
成为目前新型疫苗的研发趋势.分子疫苗大致包括:重组蛋白质疫苗,
合成疫苗,DNA疫苗及噬菌体呈现疫苗.分子疫苗主要由病原菌
的某个或数个抗原蛋白质,甚至只包括一个至数个抗原决定位的分
子.因此,具有比传统疫苗更多的优点,包括可引发宿主产生更专一
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性的免疫反应,即可有效的中和并清除病原菌,减少副作用产生的机
会,也可避免宿主能量的浪费及降低因接种疫苗而感染致病的危险.
六,本实验室先前的研究成果
在猪肺炎霉浆菌相关抗原之研究方面,本实验室以兔抗猪肺炎霉
浆菌抗血清,对猪肺炎霉浆菌lambda EMBL3 基因库进行免疫筛选,
得到表达10 kDa (P10), 36 kDa (P36), 38 kDa (P38), 42 kDa (P42)及60
kDa (P60)之重组 phage clones.经过DNA序列比对及特性分析,发现
P10可能为GTP-binding protein的N-端;P42则为一65 kDa蛋白的一
部份,是一热休克蛋白,可能具有chaperon之功能(Chou et al, 1997).
P60 则为一72 kDa蛋白的一部份,经互补实验,确定其为
phosphoenolpyruvate : sugar phosphotransferase system之enzyme I,参与
糖类吸收代谢等过程(Chung et al, 2000).P42蛋白经上述实验评估具有
开发为疫苗之潜力,因此将其基因选殖到pcDNA3 表现载体上,以此
做为DNA疫苗,进行免疫反应分析,发现能诱发小鼠体液免疫及细胞
免疫,产生的抗体可以抑制猪肺炎霉浆菌的生长 (Chen et al, 2003).

25
七,研究目的与实验策略
猪霉浆菌性肺炎是造成养猪事业经济损失的重要疾病,而此疾病
的高感染率,更是防疫工作的主要目标之一.目前市售疫苗主要以死
菌疫苗为主,其保护效果有限,生产成本高.因此,研发有效的疫苗
是刻不容缓的工作.随著免疫学及分子生物学相关知识,技术的进步,
研发猪肺炎霉浆菌之分子疫苗来控制此疾病是必然的趋势.本研究的
目的是期望藉由对此病原菌抗原决定位图谱之了解,进一步探讨研发
分子疫苗的可行性.
猪肺炎霉浆菌吸附於猪气管纤毛黏膜细胞即可引发病变,一般认
为与此菌的细胞膜表面蛋白有关,目前对其抗原之研究仍相当有限,
而分子层次的致病机制也不十分清楚.因此,本研究的实验策略(图十)
乃以实验室先前制备的兔抗猪肺炎霉浆菌血清,配合噬菌体呈现
库,对猪肺炎霉浆菌做抗原决定位图谱之分析,以所得到的相关资讯
为基础,研发以噬菌体呈现为主的疫苗,进行动物免疫试验,藉
以评估此等疫苗是否有开发为疫苗之潜力,并提供抗原决定位的资
讯,做为开发猪肺炎霉浆菌其他型式之分子疫苗(如疫苗,DNA疫
苗)的参考.
26
贰,材料与方法
一,材料
1. 菌种
霉浆菌菌株Mycoplasma hyopneumoniae 232,系得自美国爱荷华州
立大学R. F. Ross博士的实验室.菌种解冻后,接种於含有20 %猪血
清的Friis液体培养基中,置於37℃轻微震荡80 rpm,约3 ~ 5天,因
为霉浆菌生长代谢会产生酸,可使液体培养基中所含之指示剂酚红
( phenol red )的颜色由红转变成黄色,来判定菌株是否活化生长.另外
的霉浆菌菌株M. pneumoniae (ATCC 15531),M. pulmonis (ATCC
19612),M. hyorhinis (ATCC 29052),M. gallisepticum (ATCC 15302)则
购自美国菌种中心(American Type Culture Collection),置於37℃轻微震
荡80 rpm培养於含有20 %马血清的Friis液体培养基中,培养时间则
依菌种生长速度不同而有所差异.
E. coli ER2537是一株F+的大肠杆菌,其基因型为[F' lacIq (lacZ)
M15 proA+B+/fhuA2 supE thi (lac-proΑΒ) (hsdMS-mcrB)5 (rk
-mk
-Mcr
BC-)],具有快速生长并适合M13噬菌体繁殖的特性.为了维持E. coli
ER2537的pili,可将其培养在minimal medium(表三)中.
27
2. 药品及试剂
见附录一.
3. 培养基及培养液
见表三.
4. 缓冲液及实验试剂
见表四.
5. 噬菌体呈现库
本研究使用两种噬菌体呈现库(购自New England Biolabs公
司),一个称为Ph.D.-7噬菌体呈现库,是将逢机的七个
(heptapeptide)接至M13噬菌体次要外鞘蛋白( minor coat protein,pIII )
的N端起始点,并以一小段spacer (Gly-Gly-Gly-Ser)连接(图十一),此
一库的复杂性(complexity)约为2.8 ×10 9 transformants.另一个称
为Ph.D.-c7c噬菌体呈现库,是在逢机的七个的两端接上半胱
氨酸(cysteine),并於第一个半胱氨酸之前接上一个丙氨酸(alanine),第
二个半胱氨酸之后再以spacer (Gly-Gly-Gly-Ser)连接至pIII的N端(图
十一),由於两端的半胱氨酸会自动形成双硫键结(disulfide cross-link),
28
使得噬菌体呈现出环状(cyclized peptides),此一库的复杂性约
为3.7 ×10 9 transformants.
6. 实验动物
本研究使用的实验动物为六至八周龄无特定病原( specific
pathogen free,SPF ) 的近亲繁殖( inbred )母小鼠,品系为BALB/cByJ,
购自国科会国家实验动物繁殖及研究中心.实验动物送达后,先饲养
至少一周使其适应环境后,再进行实验,以避免因运送及环境改变所
造成紧迫而影响实验.每一加滤网盖的鞋盒型动物笼中饲养三只小
鼠,水及饲料采任食方式餵食,每周固定时间更换垫料,笼具以维持
洁净状态.饲育室光照期为12小时光照;12小时黑夜,室温控制在
23 ~ 25℃,相对湿度维持在40 ~ 70 %.
二,菌种保存双重玻璃管之开封
本实验室向美国菌种中心订购的菌株,收到时是以双重玻璃管包
装保存,需在无菌操作条件下将菌种取出,进行活化培养.首先以70%
酒精擦拭双重玻璃管的外管,在火焰上加热外管的尖端,待外管很烫
时,滴数滴无菌水於加热处,使外管破裂,再以无菌镊子将玻璃拨开,
取出隔热纤维纸和内管,以灭过菌的镊子取出内管之棉塞.用无菌吸
29
管吸取0.5 ~ 1 ml的无菌水,加入内管中,回溶样品直到均匀悬浮.再
将悬浮之菌液加入培养液中,於37℃进行培养.某些菌种经过冷冻乾
燥保存后,迟滞期(lag phase)变得较长,需要较久的培养时间才能活化
生长,经继代(subculture)培养后可恢复正常生长速率.
三,蛋白质含量之测定
样品之蛋白质含量是采用Bio-Rad protein assay染剂进行测试,取
160 l待测样品於96孔微量滴定盘中,加上40 l染剂均匀混合后,
於室温静置5分钟,以微量滴定盘测光仪读取595 nm波长之吸光值.
标准曲线是以牛血清白蛋白(bovine serum albumin;BSA)为样品.
四,兔抗猪肺炎霉浆菌抗体IgG的纯化
兔子抗猪肺炎霉浆菌血清来自本实验室前人所制备用以作为免疫
筛选之用(Ro et al, 1994),为了避免兔子抗猪肺炎霉浆菌血清中的其他
蛋白质对亲和性筛选的影响,乃以protein A来纯化抗体中的IgG,其
主要步骤如下:
1. 管柱的充填与保存
以protein A-agarose充填管柱约0.5 ~ 1公分,用5 ~ 10倍管柱体
30
积的起始缓冲溶液(100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl)清洗管
柱,再以3 ~ 5倍管柱体积的0.1 M glycine-HCl (pH 2.5)清洗污染物,
最后用5 ~ 10倍管柱体积的起始缓冲溶液平衡(equilibrate)管柱.若此
时欲保存,可加入0.02 % NaN3,存放在4℃.
2. 抗体溶液的制备
将兔子抗猪肺炎霉浆菌血清离心10,000 x g,10分钟,以移除杂
质.取等倍体积的抗血清与起始缓冲溶液混合,以达到适当的pH值与
离子强度.
3. 抗体的吸附
取抗体溶液置入管柱中,藉由重力作用使其通过管柱,收集流过
管柱的溶液,侦测其OD280的吸光值.抗体IgG会与protein A结合而
吸附在管柱中,需注意抗体的量勿超出protein A的结合容量(binding
capacity).用10倍管柱体积的起始缓冲溶液清洗管柱,直到洗出液的
OD280吸光值达到背景值.
4. 抗体的冲提 (elution)
以0.1 M glycine-HCl (pH 2.5)将抗体冲提下来,并立即以1/10体
积的1M Tris-HCl ( pH 8.0 )进行中和.收集冲提出来的溶液,此即为纯
化所得之IgG.依据其OD280吸光值( 1 OD280 = 0.75 mg/ml ),可估计出
所含IgG的浓度.
31
五,纯化后抗体IgG的活性分析
为了证实经protein A纯化过的抗体IgG仍具有辨识猪肺炎霉浆菌
的活性,以先前实验自猪肺炎霉浆菌lambda EMBL3 基因库中筛选出
表达P10,P42,P60,P72等clones及M. hyopneumoniae的total protein
为抗原,利用纯化过的抗体IgG作为一级抗体,再以碱性磷酸酶复合
之山羊抗兔IgG为二级抗体,进行西方墨点分析法,以了解抗体IgG
是否因纯化过程而失去辨识猪肺炎霉浆菌的活性.
六,噬菌体效价(titer)的测定
首先培养ER2537大肠杆菌至log phase阶段,分装200 l到1.5 ml
离心管中,分装管数依待测定样品数而定.离心3000 ×g ,5分钟,
移除上清液,以200 l的10 mM MgSO4将沉淀物回溶.将噬菌体以
TBS做10倍的系列稀释,取10 l系列稀释的噬菌体,加入以MgSO4
回溶的ER2537大肠杆菌中,混合后置於室温30分钟,使噬菌体吸附
感染大肠杆菌.此时,以微波炉溶化top agar并分装3 ml於试管中,
每一待测定样品一管,保持於45℃水浴以免凝固.将混合的噬菌体及
大肠杆菌加入top agar中,混合均匀后立即倒入37℃预热过含有
IPTG/Xgal的LB培养基,使其均匀散布在培养基上,置於37℃隔夜培
养.隔日,计算培养基上溶菌斑形成单位( plaque forming units;pfu )
32
的数目,再乘以稀释倍数,即可推算出噬菌体的效价,可用每10 l
含有多少溶菌斑形成单位来表示.
七,生物亲和性筛选 (bio-panning)
将protein A纯化的抗体IgG溶於0.1 M NaHCO3( pH 8.6)的黏覆溶
液中,最终浓度为100 g/ml.取150 l加入96孔的微量滴定盘的孔
洞中,盖上盖子,置於4℃隔夜.移除上清液后,加入250 l 填塞溶
液( 0.1 M NaHCO3, pH 8.6, 含5 mg/ml bovine serum albumin),置於4
℃,2小时.移除上清液后,以TBST ( TBS 含 0.1%, v/v, Tween-20)
清洗6次.加入溶於100 l TBST的噬菌体2 ×1011 pfu (取自噬菌体呈
现库),在室温轻微震荡1小时.移除上清液后,以TBST ( TBS 含
0.1%, v/v, Tween-20)清洗10次,将未与IgG接合的噬菌体移除.最后
加入200 l的冲提溶液(含有1 mg/ml BSA之0.2 M glycine-HCl, pH 2.2 )
於室温反应10分钟,将接合在IgG上的噬菌体冲提下来,并立刻以
30 l的1M Tris-HCl,pH 8.0溶液进行中和至中性(取出微量以pH试
纸测试).取出微量噬菌体进行效价测试,其余的噬菌体进行增殖.
将噬菌体加至20 ml大肠杆菌ER2537培养液中(为early log phase
阶段)进行增殖,培养於37℃剧烈震荡4.5小时.将培养液移至30 ml
离心管中,於4℃离心10,000 ×g,20分钟.吸取80% 的上清液至新
的30 ml离心管中,加入1/6体积的PEG/NaCl,置於4℃至少2小时
33
以上,於4℃下15,000 ×g离心30分钟,将噬菌体沉淀下来,最后回
溶於1 ml 的TBS,并移至另一新的1.5 ml离心管中,再於4℃下15,000
×g离心30分钟,以移除残存的大肠杆菌细胞.吸取上清液至另一新的
1.5 ml离心管中,加入1/6体积的PEG/NaCl,置於4℃至少2小时,
於4℃下15,000 ×g离心10分钟,将噬菌体沉淀下来,最后回溶於200
l TBS,於4℃下15,000 ×g离心1分钟,移除不溶物质.吸取上清液
至另一新的1.5 ml离心管中,此即为增殖后的噬菌体.重复上述亲和
性筛选二次,并将后两次的TBST所含的Tween-20提高为0.5% (v/v),
挑选最后一次所筛选出的噬菌体,与纯化之兔抗猪肺炎霉浆菌抗体进
行接合专一性测试及DNA定序反应.
八,接合专一性测试
为了了解筛选所得之噬菌体对纯化过的兔抗猪肺炎霉浆菌 IgG
接合专一性,采取西方墨点分析法及竞争型ELISA加以证实.西方墨
点分析法,首先将野生型及筛选所得重组噬菌体的蛋白质以
SDS-PAGE分离,再转印至硝化纤维纸上,以纯化过的兔抗猪肺炎霉
浆菌 IgG做为一级抗体,再用碱性磷酸酶复合之山羊抗兔IgG为二级
抗体,以NBT/BCIP呈色后,比较野生型及筛选所得重组噬菌体band
的位置,若band位在重组噬菌体pIII蛋白上,而且不会与野生型噬菌
体pIII蛋白结合,即表示纯化过的兔抗猪肺炎霉浆菌 IgG与噬菌体之
34
接合是具有专一性.
竞争型ELISA方法,以黏覆缓冲液(sodium bicarbonate buffer, pH
9.5)稀释猪肺炎霉浆菌5 g/ml,於96孔微量滴定盘上每孔加入100
l,在4℃静置隔夜.次日,移除上清液,以100 l TBST (150 mM NaCl,
50 mM Tris-HCl, 0.05% Tween-20, pH 8.0)清洗三次,加入100 l的脱脂
奶粉黏覆缓冲液(5 mg/ml),置於37℃一小时,以TBST清洗三次,再
以固定量纯化过的兔抗猪肺炎霉浆菌IgG与筛选所得的噬菌体(数目渐
增)进行竞争接合到孔洞中吸附之猪肺炎霉浆菌上,置於37℃一小时,
移除上清液,以TBST清洗三次.於每一孔中加入100 l 适当稀释的
酵素连结抗体(碱性磷酸酶复合之山羊抗小鼠IgG或山羊抗小鼠IgA),
置於37℃一小时,移除上清液,以TBST清洗三次.最后加入100 l
酵素受质p-nitrophenyl phosphate (PNPP),置於37℃暗处呈色30分钟,
以微量滴定盘测光仪读取405 nm之吸光值.
九,DNA定序反应
1. 噬菌体DNA的制备
经过三次生物亲和性筛选之后,挑出单一噬菌体依上述步骤进行
增殖,在第一次离心后,取750 l含噬菌体的上清液至新的1.5 ml离
心管,加入300 l PEG/NaCl,混和后置於室温1小时,离心30分钟,
移除上清液后,将沉淀物溶於100 l iodide buffer,再加入250 l酒精,
35
置於室温10分钟.离心10分钟,移除上清液后,以70% 酒精清洗沉
淀物,置於室温风乾,最后溶於10 l ddH2O,以此抽取的单股DNA
进行定序反应.
2. DNA定序反应
DNA定序反应是依据Sanger的dideoxy nucleotide chain-
termination方法,采用T7 Sequenase v2.0 DNA sequencing kit进行定序
反应.取7 l上述抽取的单股DNA,加入2 l的T7 Sequenase buffer
及1 l引子( 0.5 pmol/ l,序列为5'-CCAGACG TTAGTAAATG-3'),
於65℃反应2分钟,使其逐渐自然冷却至35℃以下(约15 ~ 30分钟),
进行引子黏合作用( annealing ),置於冰上备用.在等待上述黏合反应
同时,配制以ddH2O稀释5倍的labeling mix并在标记有A,T,C,G
的1.5 ml离心管中,分别加入2.5 l的ddNTP termination mix (含有50
mM NaCl,80 mM dTTP,dCTP,dGTP以及各别的ddNTP).分别取1
l Dithiothreitol (DTT, 0.1M),1 l Mn buffer (0.15M sodium isocitrate,
0.1M MnCl2),2 l稀释过的labeling mix,0.5 l [α-35S] dATP ( > 400
mCi / mmol )及2 l稀释过的T7 DNA polymerase,加到冰的annealing
DNA溶液中,混合均匀置於室温2 ~ 5分钟,各取3.5 l的反应溶液,
分别加到装有ddNTP termination mix 的A,T,C,G四管中,混合均
匀置於37℃反应5分钟,最后每管分别加入4 l stop solution ( 95%
formamide,20 mM EDTA,0.05% xylene cyanol FF ),终止反应进行.
於75℃加热2分钟,即可进行电泳分析.
36
3. 聚丙烯醯胺胶体(polyacrylamide gel)电泳
定序用之胶体为含有8M urea的6% 聚丙烯醯胺胶体,将胶体安
装至电泳设备上,於上下电泳槽内倒入1x TBE缓冲液,以1900伏特
进行预跑( prerun ) 20 ~ 30分钟,关掉电源,将完成定序反应的样品,
依A,T,C,G顺序各取4 l注入样品槽中.以1900伏特进行电泳,
依指示染剂的位置来追踪电泳的情形,待第一条染剂跑至玻璃底部
时,即可停止电泳.将胶体以5% 醋酸+ 15%甲醇混合溶液浸泡10分
钟,以移除胶体中的尿素.最后将胶体黏附在剪裁适当的Whatman
3MM滤纸上.
4. 胶体乾燥
将黏附在chromatography paper的胶体移至胶体乾燥器上,胶体朝
上并覆盖保鲜膜,再盖上胶体乾燥器的胶套.设定温度80℃,抽气乾
燥60分钟,以盖革计数器侦测乾燥胶体之放射性强度.
5. 自动放射显影
将黏附在Whatman 3MM滤纸上的乾燥胶体连同保鲜膜放入压片
匣中,於暗房内将X光底片(35 x 43cm)置於胶体上,让底片在压片匣
内由放射线感光24 ~ 36小时.在暗房内取出底片,以显影液及定影液
冲洗,晾乾后即可判读DNA的序列.
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十,猪肺炎霉浆菌抗原决定位图谱之分析
经由定序得知插入在pIII的外源DNA序列后,将其推导成氨基酸
序列.将得到的氨基酸序列藉由NCBI (National Center for
Biotechnology Information)网站www.ncbi.nlm.nih.gov的蛋白质比对程
式BLASTP进行比对.选择其中搜寻短片段序列几近精确比对(Search
for short nearly exact matches)的程式,使用non-redundant资料库设定
PAM30 matrix与目前存放在GenBank中的猪肺炎霉浆菌蛋白质序列进
行比对.将比对所得之猪肺炎霉浆菌蛋白质存入PC/GENE软体
(IntelliGenetics, USA)的资料库中,再以其中Quick global search for a
subsequence程式加以分析,详细操作步骤如表六所示.若在比对的7
个氨基酸序列中至少有4个(以上)与猪肺炎霉浆菌蛋白质上的氨基酸
序列相同,则此段即定义为拟抗原决定位(mimotope).经比对得到
之蛋白质的抗原决定部位也以PC/GENE软体中的Hopp and Woods
methods加以分析.
另外将得到所有的heptapeptides序列之间做一比较,寻找是否具
有共同的氨基酸序列存在,这些共同的序列可能是猪肺炎霉浆菌的抗
原决定位所在.将得到的heptapeptides排列,比较彼此之间的关联性,
若在heptapeptides序列中有3个(以上)氨基酸位在同一位置,而且至少
存在於3个不同的噬菌体,此等相同的氨基酸序列将其定义为一致性
序列(consensus sequence).

38
十一,噬菌体抗原的制备
将105 pfu噬菌体加至20 ml大肠杆菌ER2537培养液中(为early
log phase阶段)进行增殖,培养於37℃剧烈震荡4.5小时.将培养液移
至30 ml离心管中,於4℃离心10,000 ×g,20分钟.吸取80% 的上
清液至新的30 ml离心管中,加入1/6体积的PEG/NaCl,置於4℃至
少2小时以上,於4℃下15,000 ×g离心30分钟,将噬菌体沉淀下来,
最后回溶於1 ml 的TBS,并移至另一新的1.5 ml离心管中,再於4℃
下15,000 ×g离心30分钟,以移除残存的大肠杆菌细胞.吸取上清液
至另一新的1.5 ml离心管中,加入1/6体积的PEG/NaCl,置於4℃至
少2小时,於4℃下15,000 ×g离心10分钟,将噬菌体沉淀下来,最
后回溶於200 l TBS,於4℃下15,000 ×g离心1分钟,移除不溶物质.
吸取上清液至另一新的1.5 ml离心管中,此即为噬菌体抗原.测定其
titer后,再稀释至免疫所需之浓度.
十二,动物免疫
为了评估筛选所得之重组噬菌体做为疫苗之可行性,於是选取了
一些纯化过的噬菌体来进行小鼠免疫测试.采用之策略如下:免疫途
径分别采用腹腔(intraperitoneal, i.p.)注射及鼻腔(intranasal, i.n.)投予两
种途径.测试之样品包括φ51,φ58,代表一致性序列CS2,CS4及CS5
39
的一群噬菌体(表九).免疫剂量是将1012 pfu之噬菌体与等体积佐剂
TiterMax Gold混合,100 l用於腹腔注射;20 l用於鼻腔投予.另
外以φ58噬菌体1010 pfu及1014 pfu做剂量反应(dose response)分析及未
加佐剂之φ58噬菌体1012 pfu测试佐剂效应.TBS及野生型M13做为阴
性反应对照组;Pfizer公司生产的死菌疫苗(RespiSure)做阳性反应对照
组,同样以100 l用於腹腔注射;20 l用於鼻腔投予.每一样品免疫
3只小鼠,免疫时程为:腹腔注射在第3, 5, 7及14周追加注射;鼻腔
投予在第1, 3, 5, 7周连续三天追加投予,第14周最终追加投予一次.
每次追加注射后一周采集血液及粪便进行抗体免疫反应测试.第15周
牺牲小鼠收集血清及肺冲洗液进行测试.
十三,抗血清,粪抗体及肺冲洗液的制备
1. 抗血清的制备
免疫过后的老鼠,用尾巴采血法采集血液,首先将小鼠尾巴末端
剪破,从尾巴基部往末端方向推压,使血液自末端伤口流出,收集流
出之血液,分别放入1.5 ml离心管中,置於室温1~2小时,待血液凝
固,以6,000 ×g离心10分钟,吸取上清液,即为血清样品,保存於-20
℃备用.
40
2. 粪抗体的制备
粪抗体之萃取是参考deVos及Dick所发表的方法来制备(deVos
and Dick, 1991),收集待测日期之新鲜粪便,装入1.5 ml微量离心管,
秤重后,每0.5克粪便加入1 ml含有50 mM EDTA及25 g/ml trypsin
inhibitor的缓冲溶液.将粪便溶解捣碎,10,000 x g离心10分钟,吸取
上清液,即为待测粪抗体样品,保存於-20℃备用.
3. 肺冲洗液的制备
让小鼠吸入过量之乙醚或CO2使其安乐死.以腋下或心脏采血方
式放血,收集血液至1.5 ml 离心管,待其凝固,离心后制备血清.将
小鼠固定在解剖台上,以75%酒精消毒腹部皮肤,从腹面颈部喉咙处
沿著腹部方向剪开并移除表皮,再用75%酒精消毒.剪开胸部肌肉组
织,打开胸腔,移除胸骨,肋骨及其邻近软骨.将气管剪一个开口,
勿将其剪断,移除气管附近的肌肉及结缔组织,并将一段绵线套在气
管外围.再以接在1 ml注射针筒(25G x 1"针头)的动物插管(Intramedic
polyethylene tubing,PE-50)插入气管中(约0.5公分),用绵线绑住气管
及插管,使其固定.将注射针筒内的0.8 ml缓冲溶液(PBS包含0.1 mg/ml
trypsin inhibitor)缓缓推入,使肺泡膨胀,来回冲洗3 ~ 5次,再将冲洗
液吸出.收集此冲洗液於1.5 ml 离心管,置於冰上.离心3000 rpm,
4℃,10分钟,取上清液即为肺冲洗液.保存於-20℃备用.
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十四,抗体效价及IgG亚型(subclass)之分析
抗体效价及IgG亚型之分析是以ELISA进行测试.以黏覆缓冲液
(sodium bicarbonate buffer, pH 9.5)稀释噬菌体或猪肺炎霉浆菌抗原
5 g/ml,於96孔微量滴定盘上每孔加入100 l,在4℃静置隔夜.次
日,移除上清液,以100 l TBST-X (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl,
0.05% Tween-20, pH 8.0)清洗三次,加入100 l的脱脂奶粉黏覆缓冲液
(5mg/ml),置於37℃一小时,以TBST-X清洗三次,加入适当稀释倍
数的待测样品100 l,於96孔微量滴定盘上做二倍系列稀释,置於37
℃二小时,移除上清液,以TBST-X清洗三次.於每一孔中加入100 l
适当稀释的碱性磷酸酶复合之山羊抗小鼠IgG抗体,置於37℃一小
时,移除上清液,以TBST-X清洗三次.最后加入100 l酵素受质
p-nitrophenyl phosphate (PNPP),置於37℃暗处呈色30分钟,以微量滴
定盘测光仪读取405 nm之吸光值.以吸光值达0.2时(背景值的3倍)
之样品稀释倍数的倒数,定为该抗体之效价.IgG亚型的分析乃将酵
素连接的二级抗体换成碱性磷酸酶复合之山羊抗小鼠IgG1或IgG2a来
进行分析测试.
42
十五,分析噬菌体免疫产生之抗体对猪肺炎霉浆菌蛋白
之辨识及对不同霉浆菌菌株间的交叉反应
噬菌体免疫产生之抗体,是否能辨识猪肺炎霉浆菌之蛋白质 本实
验采用西方墨点法加以分析.将猪肺炎霉浆菌离心后,移除上清液,
以TBS清洗三次,最后以ddH2O回溶,加入等体积的SDS loading buffer
(2x),置於沸水浴中5分钟,蛋白质样品即处理完成.以10% SDS-PAGE
进行电泳.电泳完毕后,将胶体中的蛋白质转印至硝化纤维纸上.以
TBST清洗及5% 脱脂奶粉(溶於TBST)进行黏覆作用后,再用TBST
清洗,将硝化纤维纸依照电泳样品槽大小切成长条状,分别不同噬菌
体及死菌疫苗免疫小鼠所产生之抗体作用,於室温反应2小时.以
TBST清洗,加入酵素连结之二级抗体(碱性磷酸酶复合之山羊抗小鼠
IgG 抗体)於室温反应2小时;以TBST清洗,置於20 ml 碱性磷酸酶
缓冲液中5分钟,最后与受质45 l BCIP及35 l NBT作用,直到讯
号出现.本实验同时以感染猪肺炎霉浆菌恢复期(convalescent stage)的
猪血清做为对照组,其使用的二级抗体为碱性磷酸酶复合之兔抗猪IgG
抗体.
为了了解噬菌体免疫产生之抗体在不同霉浆菌菌株之间的交叉反
应情形,我们以实验室既有的霉浆菌菌株M. pneumoniae,M.
pulmonis,M. hyorhinis,M. gallisepticum做测试,并以大肠杆菌ER2537
做对照组.各菌株的蛋白质样品在同一片SDS-PAGE胶体进行电泳
后,再以免疫小鼠所产生的抗体,个别进行西方墨点分析法的测试.
43
十六,猪肺炎霉浆菌生长抑制测试
为了评估是否具有开发为疫苗之潜力,藉由经噬菌体疫苗免疫后
产生之抗体是否能抑制猪肺炎霉浆菌生长来加以验证.由於猪肺炎霉
浆菌培养液中含有phenol red,当菌体生长代谢产生酸时,使得培养液
颜色由红转变为橙黄色,经由肉眼即可判断猪肺炎霉浆菌是否生长.
颜色变化单位(Color changing units;CCU)是将菌液以Friis medium做
系列稀释,培养3 ~ 5天后,观察培养液颜色变化,以颜色不再改变时
之稀释倍数,推算原始菌液中的霉浆菌数目,CCU是目前最常用来评
估霉浆菌数目的单位.
为了了解颜色变化及吸光波长之间的关系,於是将培养液Friis
medium及猪肺炎霉浆菌生长后之培养液分别以分光光度计(Model
7800,Jasco Spectrophotometer Co., Japan)进行340 nm到1100 nm之间
吸光光谱的扫描,期找出最大吸光波长所在,做为测量猪肺炎霉浆菌
是否生长的指标.
生长抑制测试是在无菌的96孔微量滴定盘中进行,样品先以0.45
m之滤膜过滤成无菌样品.每一测试样品以Friis medium系列稀释,
血清样品稀释范围从1:10到1:1280;肺冲洗液样品从1:2到1:
256.取100 l猪肺炎霉浆菌(106 CCU/ml)加到含100 l系列稀释待测
样品之微量滴定盘中,盖上盖子并以胶带封住滴定盘四周,放置於37
℃培养3天,再以微量滴定盘测光仪读取570 nm之吸光值.对照组为
Friis medium及含有猪肺炎霉浆菌之Friis medium.当测试之样品颜色
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不再改变,而其OD570相当於对照组Friis medium时,此时的稀释倍数
即可定义为生长抑制的效价.
十七,噬菌斑降减试验法(plaque reduction test)
为了证实以噬菌体呈现疫苗免疫小鼠后所产生的抗体反应,确实
具有针对其所呈现的7个外源氨基酸之抗体,本实验乃采取噬菌斑降
减试验法加以证实.此方法依据的原理乃因为本实验所采用的噬菌体
呈现库是将外源接合在pIII蛋白的N端起始位置(图十一),
而此位置正是噬菌体感染E. coli的起始部位,若此部位与抗体结合而
被占据,则无法进行感染作用.因此,在培养皿上噬菌斑(plaques)的数
目会因此减少甚至不会出现.
首先将免疫产生的抗体进行系列稀释,再将稀释之抗体与固定数
目的噬菌体(约500 pfu)混合,置於37℃一小时或4℃隔夜,再将此混
合物感染E. coli进行噬菌体数目的测定,计算培养皿上噬菌斑的数
目.比较加入抗体与未加抗体或相同抗体对不同噬菌体所测得的噬菌
斑数目,即可证实产生的免疫反应是否有针对其所呈现的7个外源氨
基酸之抗体的存在.
45
参,结果
一,猪肺炎霉浆菌抗原决定位图谱分析
1. 兔抗猪肺炎霉浆菌抗体IgG的纯化及活性分析
由於血清中含有许多除了抗体以外的蛋白质,会影响生物亲和性
反应之进行,而筛选出非专一性与兔抗猪肺炎霉浆菌抗体结合之噬菌
体,因此需将抗体IgG从血清中分离出来.首先利用protein A agarose
resin来纯化IgG,经吸附,冲洗及冲提等过程,以OD280侦测每次收
集样品的蛋白质含量.如图十二(A)所示,可知经由此纯化过程,已经
移除血清中抗体IgG以外大部分的蛋白质.估算冲提后收集所得之IgG
浓度为0.93 mg/ml (1 OD280 = 0.75 mg/ml).
为了了解冲提下来之溶液是否含有抗体存在及纯化过的抗体IgG
是否仍能辨识猪肺炎霉浆菌之蛋白质,以西方墨点法分析测试的结
果,发现纯化过的抗体可辨识在E. coli中所表达之猪肺炎霉浆菌P10,
P42,P60,P72等蛋白质及M. hyopneumoniae的total protein(图十二
B),可知纯化过的抗体仍具有辨识之活性.

46
2. 生物亲和性筛选
以纯化过之抗体与二个噬菌体呈现库(ph.D.-7及ph.D.-c7c)进
行生物亲和性筛选,经由三回合(three rounds)的筛选,由於经过冲提,
放大及筛选之步骤后,具有较强亲和性的噬菌体成为主要族群,因此
第二,三回合所冲提下来之噬菌体数目会逐渐增加(图十三).
3. 筛得之噬菌体与纯化抗体结合专一性之确认
为了确定所得之噬菌体并不是经由非专一性地结合而被筛选出
来,於是采用西方墨点法及竞争型ELISA来加以测试.由图十四可知,
纯化过的抗体并不会与野生型M13噬菌体的pIII蛋白结合,但可以辨
认ph.D.-7及ph.D.-c7c 库筛选所得的噬菌体之pIII蛋白.由此可
知,筛选的噬菌体是经由纯化过的抗体与呈现於pIII蛋白上的
heptapeptide间之专一性结合而得到.
此外,利用竞争型ELISA来测试筛选所得的噬菌体是否会与猪肺
炎霉浆菌竞争其与纯化之抗体的结合部位.由图十五可知,竞争型
ELISA的OD405并未因野生型M13噬菌体数目之增加而显著下降,显
示并不会影响猪肺炎霉浆菌与纯化抗体间的结合;而筛选所得的噬菌
体φ51 (AEPVAML),φ58 (SISNLLL)的OD405则因其噬菌体数目之增加
而下降,明显影响猪肺炎霉浆菌与纯化抗体间的结合.
由以上西方墨点法及竞争型ELISA的结果,可以确认筛选所得之
噬菌体是经由与纯化抗体间的专一性结合而来,而非逢机筛选的结果.
47
4. 噬菌体外源heptapeptide的基因序列分析
经过三回合生物亲和性筛选之后,逢机挑取单一噬菌体,抽取其
DNA(图十六A),进行DNA序列分析.由图十一A可得知,自ph.D.-7
library筛选所得之外源heptapeptide是插在Ser及Gly两个氨基酸之
间,由定序结果之判读可推知外源基因是位在5'-ACC及5'-AGA序列
间(图十六B左);由图十一B可得知,自ph.D.-c7c library筛选所得之
外源heptapeptide是插在两个Cysteine之间,由定序结果之判读可推知
外源基因是位在5'-GCA及5'-ACA序列之间(图十六B右).经DNA
序列的判读后,再依据基因密码表推导成氨基酸序列,即可得知此外
源heptapeptide之序列.本实验经生物亲和性筛选所得之所有
heptapeptide序列如表七所示.
5. 噬菌体呈现外源heptapeptide序列分析
经定序结果推导所得之外源heptapeptide序列,即相当於猪肺炎霉
浆菌之epitopes.因此将所得之heptapeptide序列,利用BLASTP中的
PAM30 matrix与目前存放在GenBank中的猪肺炎霉浆菌蛋白质序列进
行比对分析.再将heptapeptide序列与比对所得之猪肺炎霉浆菌蛋白
质,以PC/GENE软体的Quick global search for a subsequence程式加以
分析,来寻找猪肺炎霉浆菌之拟抗原决定位(mimotope).
依照筛选所得之heptapeptide序列对应到猪肺炎霉浆菌蛋白质上
的数目来分析,表八列出了所对应到之蛋白质及其相关资讯.其中主
48
要是对应到猪肺炎霉浆菌P97蛋白及一些膜表面蛋白,根据前人研究
发现P97蛋白与附著作用(adhesion)有关,为猪肺炎霉浆菌附著到气管
纤毛所必需(Hsu et al, 1997).研究也发现其C端的重复序列R1及R2
在与气管纤毛结合时扮演重要的角色(Hsu and Minion, 1998).拟抗原决
定位与P97蛋白之对应分布情形如图十七所示,大部分对应在P97前
半段之位置,在第365 ~ 382,395 ~ 403及436 ~ 452氨基酸的位置,
有许多mimotopes重复对应在此区域,可能是主要epitope-clusters所在
的位置.C端的重复序列R1及R2也有拟抗原决定位AEPVAML及
SPNQLKL与其相对应.
此外,利用PC/GENE软体来分析P97蛋白之抗原决定位,此软体
是依据其氨基酸序列的亲水性来预测,其预测最有可能之epitope位置
为图十八的虚线所示,此结果是设定参数为每七个氨基酸为一个计算
单位而得.而本实验所筛选之部份heptapeptides也有对应到其预测可
能之epitope所在.
此外,我们也将筛选所得heptapeptides序列彼此之间做一比对,
在7个氨基酸中有3个(以上)位在同一位置,而且来自至少3个不同的
噬菌体,依据此准则,我们得到了六个主要含有3 ~ 7个氨基酸的一致
性序列CS1 ~ CS6 (表九),这些序列可能是猪肺炎霉浆菌表面上重要的
抗原决定位所在.
49
二,猪肺炎霉浆菌疫苗研发
1. 小鼠免疫反应测试
为了评估筛选所得之拟抗原决定位是否具有开发成为疫苗之潜
力,於是选取了φ51(AKPVAML),φ58(SISNLLL),具有代表一致性序
列CS2,CS4及CS5的一群噬菌体进行动物免疫测试.由於设备及经
费上之限制,以小鼠为实验对象,进行免疫注射及疫苗研发之相关测
试,结果分述如下:
(1) 抗体IgG之效价分析
经由腹腔注射及鼻腔投予两种免疫途径不同时间诱发的抗体IgG
反应,如图十九所示,虽然免疫途径不同,但均能诱发不错之抗体反
应,Pfizer疫苗所产生对抗猪肺炎霉浆菌的抗体效价约为51,200.由图
二十可得知以筛选之噬菌体免疫后第15周产生对抗猪肺炎霉浆菌的抗
体效价约在200 ~ 1600之间,其中以CS4及φ58产生较高之抗体效价;
而以野生型M13噬菌体及TBS免疫产生之抗体效价则很低.
(2) 剂量效应
为了测试使用剂量对免疫反应产生之影响,以1010 pfu,1012 pfu
及1014 pfu的φ58做剂量效应分析.由图二十可以得知,1014 pfu产生较
高之抗体效价,显示有剂量效应存在.
50
(3) 佐剂效应
虽然有研究指出噬菌体本身即是很好之抗原,并具有佐剂之功
用,因此在免疫时不需另外加佐剂(Willis et al , 1993).为了了解本实验
采用之佐剂TiterMax Gold的效果,以φ58未加佐剂进行对照比较,结
果如图二十所示,虽然未加入佐剂之φ58即可引起不错之抗体反应,但
在佐剂之作用下,效果更加显著.
(4) 与市售不活化疫苗(RespiSure)之比较
本实验采用Pfizer公司之猪肺炎霉浆菌不活化疫苗(RespiSure)做
阳性对照组.由图二十A可知,以腹腔注射此疫苗产生之抗体在1:
1600时,仍具有很高之OD405吸光值,显示其抗体效价很高,而测试
的噬菌体疫苗最高抗体效价约为1600.然而,在鼻腔投予时,小鼠在
几次投予之后,呈现呼吸急促,行动缓慢之现象,第6周起陆续先后
死亡,因此图二十B中无法显示此疫苗之效价.
(5) 血清IgG亚型抗体之分析
本实验利用ELISA的方法来测定筛选之噬菌体及不活化疫苗经免
疫注射后对其抗原所引发的IgG抗亚型之产生情形.如图二十一所
示,以腹腔注射第8周之血清样本,测定其对M13噬菌体或猪肺炎霉
浆菌抗原之IgG1及IgG2a的产生情形.结果显示噬菌体诱导之IgG亚
51
型主要为IgG1;不活化疫苗也是相同情形.但噬菌体产生之IgG1/IgG2a
的比值较高.
(6) 粪抗体及肺冲洗液之抗体IgA反应
研究显示,猪肺炎霉浆菌是吸附在猪的气管的上皮细胞,从未在
细胞内发现(Tajima and Yagihashi , 1982).因此黏膜IgA的分泌物被认
为是提供猪只保护作用的重要因子(Roth , 1993).为了了解黏膜IgA的
分泌情形,本实验采集粪便及肺冲洗液进行抗体IgA之测定.在测定
粪抗体样品对猪肺炎霉浆菌的反应方面,以1:16之稀释倍数下测得
各样品之OD405吸光值如图二十二A所示.普遍而言,腹腔注射比鼻
腔投予有较佳之粪抗体IgA反应.
在测量肺冲洗液中抗体IgA对猪肺炎霉浆菌之反应方面,在1:5
之稀释倍数下测得各样品之OD405吸光值(图二十二B),显示鼻腔投予
比腹腔注射有较佳之肺冲洗液抗体IgA反应,因为以鼻腔投予Pfizer
疫苗之小鼠均已死亡所以在图中没有数据显示.
2. 筛选之噬菌体诱发的抗体对猪肺炎霉浆菌蛋白之辨识分析
为了了解测试之噬菌体疫苗产生之抗体是否能辨认猪肺炎霉浆菌
上之蛋白质,采用西方墨点法加以证实.结果如图二十三所示,CS 2
与φ51诱发之抗体主要可辨识97及56 kDa二种蛋白质;CS 4与φ58诱
52
发之抗体主要可辨识97,76,56及30 kDa四种蛋白质;CS5之抗体
则主要辨识56 kDa蛋白质及二个微弱的bands (145及76 kDa);Pfizer
疫苗产生之抗体可辨识许多蛋白质主要5个为145,97,56,46,30 kDa
及许多微弱之bands;感染肺炎霉浆菌之恢复期猪血清则可辨识84,
56,30,23 kDa四种主要的蛋白质及些许微弱的bands;而pre-immmune
血清,野生型M13及TBS免疫产生之血清均没有辨识到任何猪肺炎霉
浆菌之蛋白质.
3. 猪肺炎霉浆菌之生长抑制测试
生长抑制测试是用来评估是否具有开发为疫苗潜力的重要指标.
由於在固体培基进行生长抑制测试需在显微镜下观察抗体对猪肺炎霉
浆菌生长产生之抑制区(inhibition zone)来判定(Fagan et al, 1997),培养
及观察均不易进行,而且样品多时更增加操作上之不便.於是本实验
采用液体培养基中phenol red之颜色变化来加以判定抗体对猪肺炎霉
浆菌之生长抑制情形.
由於文献上使用＂颜色变化单位″均是以肉眼判定培养液之颜色
变化,为了了解颜色变化与吸光波长之间的关系,找出培养液之最大
吸光波长所在,分别将Friis培养液及菌体生长后之培养液进行吸收光
谱扫瞄,结果如图二十四所示.发现Friis培养液的最大吸光波长在570
nm,当菌体生长代谢产生酸后,使得培养液中的phenol red由红变黄,
其吸光值下降.因此本实验采用波长570 nm吸光值的变化来判定抗体
53
抑制猪肺炎霉浆菌生长之情形.
测试之样品包括腹腔注射后所得之血清(图二十五A),肺冲洗
液(图二十五C),鼻腔投予所采集之血清(图二十五B)及肺冲洗
液(图二十五D).由图二十五可知,腹腔注射之Pfizer不活化疫苗
的血清生长抑制效价为1280以上,而其肺冲洗液之生长抑制效价为
32.然而,筛选所得之噬菌体,以CS4及φ58的生长抑制效果较佳,
最佳之血清生长抑制效价为160;肺冲洗液之生长抑制效价为8.CS5
所产生之血清及肺冲洗液生长抑制效价最低.而野生型M13及TBS
产生之血清及肺冲洗液均无法抑制猪肺炎霉浆菌之生长.在鼻腔投予
之样品的测试方面,得到相似的结果,而投予Pfizer疫苗之小鼠均已
死亡,所以在图中没有数据显示.

4. 噬菌斑降减试验法(plaque reduction test)
为了证实以噬菌体免疫小鼠后产生之抗体反应中,确实含有针对
其所呈现之外源heptapeptide的抗体,本实验采用噬菌斑降减试验法加
以证实.如图二十六所示,稀释的抗体58(φ58免疫产生之抗体)分
别与噬菌体φ58及φ51作用,当未加入抗体58时,噬菌体φ58散布整个
培养基(图二十六A,左);加入抗体58与噬菌体φ58作用时,则噬
菌斑数目显著减少(图二十六,右).此乃因为抗体与噬菌体之pIII
蛋白之N端起始位置结合,以致於噬菌体不能感染E. coli,因此无法
形成噬菌斑.
54
然而,当未加入抗体58时,噬菌体φ51散布整个培养基(图二十
六B,左);当加入抗体58与噬菌体φ51作用后,噬菌斑仍散布整个
培养基;显示抗体58无法结合噬菌体φ51之pIII蛋白的N端起始位置,
使得φ51仍能感染E. coli而形成噬菌斑.由於φ51及φ58二者主要之差
异在於pIII蛋白的N端之外源heptapeptide,因此可推知噬菌体φ58所
诱发之体液免疫抗体反应中,确实含有针对其外源heptapeptide之抗体
产生.
5. 噬菌体疫苗诱发的抗体对不同菌株间之交叉反应测试
为了了解噬菌体疫苗产生之抗体是否对其他霉浆菌菌株有交叉反
应,将抗体与M. pneumoniae, M. pulmonis, M. hyorhinis, M.
gallisepticum进行西方墨点法分析.结果如图二十七所示,CS2及CS4
抗体与测试之所有霉浆菌菌株均有交叉反应;φ51及φ58抗体对M.
hyorhinis及 M. pulmonis有交叉反应,但不会辨识M. pneumoniae及 M.
gallisepticum之蛋白质;CS5抗体只辨识M. pulmonis上之113,150 kDa
蛋白,对其他三种霉浆菌则无交叉反应;而上述抗体对E. coli均无交
叉反应.Pfizer不活化疫苗产生之抗体不但对其他霉浆菌菌株有明显的
交叉反应,而且对E. coli也有交叉反应发生,交叉反应结果整理於表
十.
55
肆,讨论
噬菌体呈现库及抗体库已被广泛地应用於基础研究及生物科
技的相关领域(杨等, 2002),噬菌体呈现拟抗原决定位也被研究做为疫
苗成份之可行性(Bastien et al, 1997 ; De Berardinis et al, 2000 ; Frenkel
et al, 2000),此mimotope不一定与原来抗原决定位完全相同,而是在
结构或功能上模拟原来的抗原决定位.本实验以protein A纯化过之兔
抗猪肺炎霉浆菌IgG与二个噬菌体呈现heptapeptide libraries进行三回
合的生物亲和性筛选,挑选出与纯化过之 IgG具有较高亲和力的噬菌
体,而其pIII蛋白所携带之外源heptapeptide则代表IgG所能辨识的各
种抗原决定位,亦即相当於猪肺炎霉浆菌上之抗原决定位.
从疫苗研发观点来看,本实验以多株抗体(polyclonal antibody)进行
生物亲和性筛选而非利用单株抗体(monoclonal antibody),其优点为以
多株抗体得到之epitope资讯是针对整个猪肺炎霉浆菌而非某个特定蛋
白质,亦即是整体epitope profile.虽然有些许的猪肺炎霉浆菌蛋白被
研究(Chou et al, 1997 ; Chung et al, 2000 ; Fagan et al, 1996 ; Hsu et al,
1997),但分子层次的致病机转仍未清楚.在未知何种蛋白质是真正致
病因子之情形下,若以单株抗体来筛选,除了抗体制备过程繁琐外,
而且得到的epitope资讯仅是针对特定蛋白质而非整个病原菌之整体
epitope profile.而本实验采用兔抗猪肺炎霉浆菌之hyperimmune血清
进行生物亲和性筛选,主要因为此血清为本实验先前所建立(Ro et al,
56
1994),在材料取得上较便利.当然,若有猪的hyperimmune血清进行
筛选,所得到的epitope资讯将更接近猪只自然感染之情形.
以西方墨点法分析纯化之兔抗猪肺炎霉浆菌抗体与筛得的噬菌体
结合专一性结果(图十四),发现硝化纤维纸上有强弱不同的bands产
生,可能是因为筛选所得噬菌体与纯化之兔抗猪肺炎霉浆菌抗体的结
合力强弱程度不同所造成.M13的pIII蛋白质分子量大小为42.5 kDa
(图七),而SDS-PAGE的结果,其大小为65 kDa,此现象可能是由於
unusual glycine-rich spacer region所造成.
本实验中筛选之mimotopes对应到许多已知的猪肺炎霉浆菌蛋白
(表八),包括P97吸附蛋白,P146似吸附蛋白,P110膜蛋白及未知功
能的蛋白质(YX2及ORF3).P97是最多mimotopes所对应到的蛋白质,
其可能之epitopes主要位在第365 ~ 382,395 ~ 403及436 ~ 452个氨
基酸的位置,以及C端的R1和R2重覆序列.将筛选所得之
heptapeptides间的序列加以分析,发现有6个主要的一致性序列CS1 ~
CS6(表九),此6个一致性的序列虽然并未发现位在目前已知的蛋白质
上,可能是conformational epitope所在或是在未知蛋白上之epitope,
值得更一步探讨.
在筛选之外源heptapeptide中,有些序列出现频率较高,可能是因
为使用之IgG是来自polyclonal血清,其中存在各式各样之抗体,而某
些抗体所占的比例较多或某些序列与抗体结合力较强所致.此外,在
比对各个heptapeptide序列对应到已知猪肺炎霉浆菌蛋白质时,发现有
57
些序列在同一蛋白质上对应到不只一个位置;有些序列可同时对应到
许多蛋白质上,如此之mimotope可能是许多蛋白质共有的序列,广泛
存在不同的蛋白质上.例如φ58 的SISNLLL序列,比对结果发现对应
到14种猪肺炎霉浆菌蛋白质上的31个位置.
虽然以本研究方法筛选所得之epitopes位置与电脑软体预测之
epitopes位置不尽相同(图十七,十八),如同其他研究显示,比较epitope
mapping实验的结果与电脑演算法预测之epitope位置的一致性相当有
限,大部份之演算法预测epitope是根据一小段氨基酸之最高亲水性来
判断,不同的氨基酸长度,将会产生不同的结果(Westhof et al, 1984 ;
Viudes et al, 2001).如图十八所采用Hopp and Woods之演算法中所提
及,以7个氨基酸为计算单位,将会产生30%预测错误的可能性,而
且conformational epitope也无法以此方法预测出来.因此,抗原决定位
之判定应该以实验研究加以确认,例如本实验所采用之方法,电脑演
算法预测之结果仅能提供参考之用.
传统上,利用各种方法找寻抗原上可能之epitopes后,通常是以
化学方法合成来进行测试,本研究原本拟采用此策略进行动物试
验.然而,以合成较昂贵且无法在本实验室自行合成,因为该
片段即位在噬菌体的外套蛋白上,所以改采以噬菌体进行测试相关
测试.因为噬菌体的培养快速而且所需培养基较便宜,其衍生之疫苗,
除了能取代某些难以培养的病原菌做为抗原,也可避免使用昂贵之培
养基而大幅降低生产成本.
58
在黏膜分泌IgA抗体方面,如图二十一所示,腹腔注射比鼻腔投
予有较佳之粪抗体IgA反应;而鼻腔投予比腹腔注射有较佳之肺冲洗
液抗体IgA反应.此结果显示局部性的黏膜IgA反应与免疫途径有密
切关系.腹腔注射接近消化系统附近之黏膜系统,引起较佳之粪抗体
IgA反应;鼻腔投予为呼吸道之黏膜系统,故引起较佳之肺冲洗液抗
体IgA反应.
在噬菌体呈现疫苗之免疫途径方面,有报告指出,以小水滴的形
式进行鼻腔投予是一种有效而且是比较不具侵入性的疫苗投予方式
(Wu and Russell, 1993).除了本研究所采用的两种途径以外,有研究以
口服投予方式进行,测试在强烈胃酸环境下是否能维持抗原知完整形
式.经过测试,噬菌体在通过pH 2-3的胃酸环境后仍保有其感染性,
能顺利引发实验动物之抗体反应(Zuercher et al, 2000).此外,有研究以
活的噬菌体与UV不活化之噬菌体来测试其是否有免疫反应上之差
异,结果发现并没有显著的差别(Delmastro et al, 1997).
不同之免疫策略(免疫时程,剂量,途径…等)及抗原特性(蛋白质,
DNA,多醣体)等因素,会活化不同类型的辅助性T细胞( Helper T
cell ),进而影响诱发产生不同之抗体亚型.若第二型辅助性T细胞( Th
2 )被活化,则会促进IgG 1亚型之产生;而第一型辅助性T细胞( Th 1 )
被活化,则会促进IgG 2a亚型之产生.研究报告指出Th 1 细胞藉由
细胞免疫( Cellular immunity )的作用来对付细胞内(intracellular)的病原
菌;而Th 2细胞则会刺激体液免疫(humoral immunity)的作用来对付细
59
胞外(extracellular)的病原菌(Abbas et al , 1996).本实验结果显示,不论
是噬菌体呈现疫苗或是Pfizer的不活化死菌疫苗,IgG1是在本实验采
取之免疫策略所产生的主要抗体亚型,可推知测试之噬菌体主要是活
化Th 2细胞,进而诱发体液免疫来对抗外来抗原.因为猪肺炎霉浆菌
是附著在气管纤毛细胞表面,因此本实验采用之免疫策略有助於产生
体液免疫来清除该病原菌.
在Pfizer不活化疫苗的鼻腔投予试验的小鼠中,在经过数次追加
投予之后,逐渐出现呼吸急促,行动缓慢现象,第6周起陆续先后死
亡,真正的死因未明.依据该疫苗之使用说明是采用肌肉注射之途径
来免疫一周龄的小猪,每次2 ml的剂量,两周后追加注射一次.或许
是本实验追加投予之数次太多而造成小鼠死亡,也可能是该疫苗不适
合采用鼻腔投予之免疫途径,造成小鼠之肺部,气管受损而死亡.
依据生长抑制试验的结果(图二十四),再配合测试疫苗产生之抗体
所辨认猪肺炎霉浆菌上之蛋白质(图二十二)来看,推论97,56及30 kDa
三种蛋白质在抑制猪肺炎霉浆菌生长上扮演重要的角色.图二十二所
呈现的主要蛋白质为何 值得进一步确认,因为这些蛋白质都具有开
发成为疫苗之潜力.
综合各项免疫测试及生长抑制试验结果,因为不活化疫苗是以整
个猪肺炎霉浆菌为抗原制备而成,可以预期的,其所诱发的抗体反应
及抑制病原菌生长的效果最佳.然而,在本实验所挑选之噬菌体φ58
及CS4衍生疫苗中,也获得相当程度的抑制病原菌生长之效果.若能
60
找出更重要具有代表性的mimotope 之噬菌体clones,以cocktail方式
找出最佳组合,应该可以得到更佳的效果.
猪肺炎霉浆菌有很严苛的宿主专一性,而只在猪只的特定器官形
成菌落(Frey, 2002),到目前仍无其他动物模式试验系统被建立.虽然
小鼠与猪的免疫反应不尽相同,然而,因为经费及设备之限制,先以
小鼠做测试进行初步筛选可能之疫苗候选者,再依此结果进一步以猪
只进行临床试验,仍是值得尝试.然而,攻毒试验(challenge experiments)
无法在小鼠上进行,因为M. hyopneumoniae无法感染小鼠.因此本实
验采用以免疫产生之抗体进行猪肺炎霉浆菌之生长抑制测试来评估开
发疫苗之可行性.亦即以in vitro的方式,测试血清及肺冲洗液对猪肺
炎霉浆菌生长之抑制情形,来了解系统免疫及黏膜免疫产生之抗体是
否能抑制猪肺炎霉浆菌之生长.
为了评估以噬菌体呈现为疫苗所产生之体液免疫反应,必需
证明所产生之抗体是针对噬菌体所呈现之外源,利用ELISA或西
方墨点法是比较常用之方法,但这些方法不易区分产生之抗体是针对
噬菌体外套蛋白或是插在外套蛋白上之外源.本研究利用M13噬
菌体感染E. coli是藉由噬菌体pIII外套蛋白的N端与E. coli性纤毛(F
pili)结合而引起感染之特性,提出了噬菌斑降减试验法来证明产生之免
疫反应中,含有针对插在外套蛋白上之外源的抗体.此方法藉由
比较抗体与不同噬菌体之间的作用及计算噬菌斑之数目来证明.由於
计算噬菌斑的方法是从事噬菌体实验之实验室必备的基本方法,无需
61
再额外合成费时又昂贵的(一般实验室也无法自行合成)来做
ELISA或西方墨点法分析.此研究成果已被接受发表於Journal of
Immunology Methods期刊上(Yang and Shiuan, 2002).
筛选之噬菌体诱发的抗体在不同菌株间交叉反应分析方面所有的
抗体均会辨识M. pulmonis之蛋白质,CS2及CS4抗体与所有的菌株均
有交叉反应产生,CS5抗体除了对M. pulmonis有交叉反应外,不会辨
识其他菌株上之蛋白,专一性较佳.CS5 mimotope或许可提供区别菌
株鉴定时之应用.此外,由於目前ELISA来测定血清中之猪肺炎霉浆
菌抗体,使用之抗原大多为菌体本身或其溶解之蛋白质,培养费时且
成本昂贵,若能将筛选所得之噬菌体mimotope取代ELISA使用之菌
体抗原,可降低成本并节省培养之时间.但需配合大量之临床或田野
收集之血清来加以测试,才能找出最佳之噬菌体mimotope取代检验用
的菌体抗原.已有研究利用噬菌体呈现库与一系列抗体做生物亲
和性筛选,而得到一些序列做为检验莱姆病(Lyme disease)之用
(Kouzmitcheva et al, 2001).
本实验策略的优点为直接利用免疫注射病原菌后得到的抗体,对
总体的抗原决定位进行分析,筛选出具有拟抗原决定位(mimotope)的噬
菌体,即可进行动物免疫试验.即使对病原之致病机制及致病分子仍
不清楚亦可适用,大大缩短疫苗研发的时程.相对地,若以重组DNA
策略来研发DNA疫苗或重组蛋白质疫苗,需先了解并确认可能之致病
因子,再将其基因选殖到表现载体上,以此做为DNA疫苗或表达此蛋
62
白质,将此蛋白质纯化或去毒化,再进行动物免疫试验,需花费较多
的研发时间.而最重要的,若不清楚其可能之致病分子为何,更是难
以著手进行各种试验.本实验所采取的策略将可大幅改变疫苗设计的
流程,缩短疫苗开发所需的时间(图二十七).
由於基因体及蛋白体研究技术之快速发展,美国爱荷华州立大学
兽医学系研究人员对猪肺炎霉浆菌之基因组序列解码也已经接近完成
阶段,若能以本实验结果所提供之抗原决定位序列相关资讯为基础,
配合基因体及蛋白体之研究,将可得到更多抗原决定位的重要资讯并
找出最适合的抗原,加速开发更有效对抗此病原菌之疫苗的脚步.
63
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73
陆,图表
图一 猪肺炎霉浆菌之菌落型态.
猪肺炎霉浆菌可以在人工合成培养基上生长,菌落中心伸入
培养基,外围薄且透明,整个菌落如同半熟的荷包蛋一般.
各种病原性霉浆菌菌落大小不一,较小的菌落要在光学或相
位差显微镜下才能观察到.
( 摘录自美国爱荷华州立大学兽医学研究所F. C. Minion实验室网页
http://mycoplasmas.vm.iastate.edu/lab_site/index.html )
74
图二 霉浆菌与其他生物大小之比较.
霉浆菌是最小的细菌,约0.2 m,比最大的病毒poxvirus (天花病毒)
还小可通过0.45 m孔径的滤膜.
(摘录自Levinson and Jawetz, 1994)
75 75
(A)
5 m
(B)
2 m
(C)
图三 猪肺炎霉浆菌与气管纤毛(cilia)之吸附情形.
(A) 正常之纤毛.(B) 受猪肺炎霉浆菌感染之纤毛.(C) 猪肺炎霉浆
菌(实线箭号)吸附到猪气管表皮,与纤毛(虚线箭号)紧密结合,进而
使得纤毛剥落,引发病变.
[(A),(B)摘自Young et al, 2000;(C)摘自DeBey and Ross , 1994.]
76
(A)
(B)
图四 感染猪肺炎霉浆菌之肺脏病变.
(A) 单纯感染霉浆菌肺炎其肺脏病变甚轻微,只限定於两
侧尖叶,心叶,横膈膜的尖端呈肉样坚实,病灶切面处细
支气管腔内有清澈分泌液.
(B) 合并感染繁殖呼吸症状群病毒(PRRSV)再并发二次
性细菌感染时,肺脏呈现弥漫性之肺炎病灶,外观呈鱼肉
样且甚坚实,病灶区有大小不一之脓疡散布.
(摘录自邱,2001)
77 77
(A)
(B)
图五 抗原决定位的种类.
(A) 线性的抗原决定位(linear epitope),由连续之胺基酸序列
构成(箭号所指).
(B) 构型性的抗原决定位(conformational epitopes),由不连续
的胺基酸构成(粗体部分).
78 78























图六 丝状噬菌体的生活史.
(摘录自www.mgen.uni_heidelberg.de/SD/M13LiveCycleSM.JPG)
79














Protein Amino acids MW (kd) Function
I 348 39.5 assembly
II 410 46.1 DNA replication
III 406 42.5 minor coat protein
IV 405 43.5 assembly
V 87 9.7 binding ssDNA
VI 112 12.3 minor coat protein
VII 33 3.6 minor coat protein
VIII 50 5.2 major coat protein
IX 32 3.7 minor coat protein
X 111 12.7 DNA replication

图七 M13噬菌体的基因排列顺序及蛋白质功能.
M13噬菌体genome大小为6.4 kb,pIII蛋白大小为42.5 kd,
pVIII蛋白大小为5.2 kd.
(摘录自Webster, 1996)
80 80
图八 噬菌体呈现系统的型式.
长垂直杆型代表丝状噬菌体,较短者为含有噬质体的噬菌
体.螺旋缠绕的椭圆型代表噬菌体的单股环状DNA,白色
及黑色长方格分别代表pIII及pVIII蛋白的基因,其中斜线
部分代表插入之外来基因片段,白色圆圈代表pIII蛋白,斜
线圆形代表呈现之外源蛋白.各种呈现系统型式的区别,详
见本文内之说明.
(摘录自Smith, 1993)
81 81
(A) (B)
82
图九 呈现在噬菌体pIII外套蛋白表面之外源peptide.
外源peptide以七个圆形代表(A) unconstraint (B)
constraint.斜线圆形代表半胱氨酸(cysteine),-S-S-代表
双硫键(disulfide bond),斜线长方形代表外源基因.图
中所示仅以其中一个pIII蛋白上之外源peptide为代表.
pIII
-S-S-
pIII

Positive clone identification
A T C G
Candidates
evaluation
Bioinformatic
analysis DNA sequencing
Animal trials
(A)
pIII leader sequence Kpn I
5'-...TTA TTC GCA ATT CCT TTA GTG GTA CCT TTC TAT TCT CAC TCT
3'-...AAT AAG CGT TAA GGA AAT CAC CAT GGA AAG ATA AGA GTG AGA
...Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser His Ser
↓Start of mature heptapeptide-gIII fusion Eag I
NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK GGT GGA GGT TCG GCC GAA ACT GTT GAA
NNM NNM NNM NNM NNM NNM NNM CCA CCT CCA AGC CGG CTT TGA CAA CTT
Xxx Xxx Xxx Xxx Xxx Xxx Xxx Gly Gly Gly Ser Ala Glu Thr Val Glu
AGT TGT TTA GCA AAA TCC CAT ACA GAA AAT TCA TTT ACT AAC GTC TGG
TCA ACA AAT CGT TTT AGG GTA TGT CTT TTA AGT AAA TGA TTG CAG ACC
Ser Cys Leu Ala Lys Ser His Thr Glu Asn Ser Phe Thr Asn Val Trp
← -58 sequencing primer
AAA GAC GAC AAA ACT TTA GAT CGT TAC GCT AAC TAT GAG GGC...-3'
TTT CTG CTG TTT TGA AAT CTA GCA ATG CGA TTG ATA CTC CCG...-5'
Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr Ala Asn Tyr Glu Gly...
(B)
pIII leader sequence Kpn I
5'-...TTA TTC GCA ATT CCT TTA GTG GTA CCT TTC TAT TCT CAC TCT
3'-...AAT AAG CGT TAA GGA AAT CAC CAT GGA AAG ATA AGA GTG AGA
...Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser His Ser
↓Start of mature heptapeptide-gIII fusion Eag I
GCT TGT NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK TGC GGT GGA GGT TCG GCC GAA
CGA ACA NNM NNM NNM NNM NNM NNM NNM ACG CCA CCT CCA AGC CGG CTT
Ala Cys Xxx Xxx Xxx Xxx Xxx Xxx Xxx Cys Gly Gly Gly Ser Ala Glu
ACT GTT GAA AGT TGT TTA GCA AAA TCC CAT ACA GAA AAT TCA TTT ACT
TGA CAA CTT TCA ACA AAT CGT TTT AGG GTA TGT CTT TTA AGT AAA TGA
Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Ser His Thr Glu Asn Ser Phe Thr
AAC GTC TGG AAA GAC GAC AAA ACT TTA GAT CGT TAC GCT AAC...-3'
TTG CAG ACC TTT CTG CTG TTT TGA AAT CTA GCA ATG CGA TTG...-5'
Asn Val Trp Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr Ala Asn...
图十一 外源peptide插入pIII蛋白N端示意图.
(A) ph.D-7 library (B) ph.D-c7c library.外源peptide以Xxx表示;N代
表任意nucleotide;K代表G or T;M代表A or C.标示双底线之Cys
会形成双硫键.阴影部分为DNA定序时所用primer之位置.
84
175
83
62
47.5
32.5
25
10
图十二 兔抗猪肺炎霉浆菌血清纯化及活性测试.
(A) 以protein A亲和性管柱纯化兔抗猪肺炎霉浆菌血清之层析图谱.
(B) 以西方墨点法测试纯化后之血清抗体活性.M:蛋白质marker,1:
P10 clone,2:P42 clone,3:P60 clone,4:P72 clone,5:猪肺炎
霉浆菌total protein.1~4为在E. coli中表达之猪肺炎霉浆菌蛋白.
图左边的数字表示蛋白质分子量.
85
Elution
1 st2 nd3 rd
Plaque forming unit
1e+4
1e+5
1e+6
1e+7
1e+8
1e+9
1e+10
1e+11
图十三 生物亲和性筛选三回合(three rounds)所冲提之噬菌体数目.
黑色代表ph.D.-7 library之筛选;白色代表ph.D.-c7c library
之筛选.每次进行生物亲和性筛选之噬菌体为2 × 1011 pfu.
86
87
kDa M M13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
83
62
47.5
32.5
pIII
图十四 纯化过之兔抗猪肺炎霉浆菌抗体与筛得的噬菌体结合专一性之分析.
此图为西方墨点法之结果,M:蛋白质marker;M13:野生型M13
噬菌体;1 ~ 6:从ph.D.-7 library筛选所得的噬菌体;7 ~ 11:从
ph.D.-c7c library筛选所得的噬菌体;箭头所指为M13噬菌体之pIII
外套蛋白之位置.图左边的数字表示蛋白质分子量.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
010e410e510e610e710e810e910e10
Number of phage added (pfu)
OD 405
图十五 竞争型ELISA测试.
以筛选所得之噬菌体与纯化之兔抗猪肺炎霉浆菌抗体
竞争吸附在微量滴定盘之猪肺炎霉浆菌.横轴为加入之
噬菌体数目,纵轴为405 nm波长的吸光值.代表wild
type M13;代表φ 51(AEPVAML);▲代表φ 58
(SISNLLL).
104 1051061071081091010
88
(A)
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
(B)
A T C G A T C G
图十六 经生物亲和性筛选所得到之噬菌体DNA及其序列.
(A) M:λ/Hind III DNA ladder,lane 1~16为抽取之噬菌体DNA.
使用的琼胶浓度为0.8% agarose gel.
(B)左图为自ph.D.-7 library筛选之噬菌体DNA序列;右图为自
ph.D.- c7c library筛选之噬菌体DNA序列.大括弧所指的是
插入之外源heptapeptide的DNA序列.
89
1 mskksktfki gltagivglg vfgltvglsS LAKYRSespr kiandfaakv stlafspyaf
S LAMYQY
61 etdsdykivk rwLVDSNNNi rnkekvidsf sfftkngdql ekinfqdpey tkakitfeil
LFDRNNS
121 eiipddvnqn fkvkfqalqk lhngdiaksd iyeqtvafaK QSNLLVAEfn fslkkitekl
S ISNLLL
KNLGVKE
181 nqQIENLSTk itnfadekts sqkdPSTLRA Idfqydlnta rnpedldikl anyfpvlknl
TIANLSL PQSLRH I
241 inrlnnapen klPNNLGNIf efsfakdsst nqyvsiqnqi psLFLKADLS QSAREIlasp
PQFLTNI LTLPAAL
PQFLSNI P QSLRHI
301 devqpvinil rlmkkdnssy flnfedfvnn ltlknmqked LNAKGQNlsa yefladiksg
LNSKGPI
361 ffpgDKRSSH TKAEISNLLN KKENIydfgk yngkFNDRLN SPNleyslda asasldkkdk
DSRNSA T SISNLLL SLLN SPV
SH TPALL LN SKGPI FNQDLH S
LFDRNN S
421 sivlipyrle ikdkfFADDL YPDTKDNILV KEgilkltgf kkgskidlpn inqqifktey
FAQDL QG KNLGV KE
FSQDL HP
YTFTQDN
481 lpffekgkee qakldygnil NPYNTQLakv evealfkgnk nqeiyqaldg nyayefgafk
NPFNHQL
541 SVLNSWTgki qhpekadiqr ftrhleqvki gsNSVLNQPQ ttkeqvissl ksnnffkngh
SLLNSPV SLLNSPV
NSWLNMT
601 qvasyfqdll tkdkltilet lydlakkwgl etnraqfpkg vfqytkdifa eadklkflel
661 kkkdpynqik eihqlsfnil arndviksdg fygvlllpqs vktelegkne aqifealkky
721 sliensafkt tildknlleg tdfktfgdfl kafflkaaqf nnfapwakld dnlqysfeai
781 kkgettkegk reevdkkvke ldnkikgilp qppaakpeaA KPVAAKpett kpvaakpeaa
R1 → A EPVAML
841 kpeaAKPVAA KpeaAKPVAA KpeaAKPVAA KpeaAKPVAA KpeaAKPVAT NtgfSLTNKP
AEPVAM L AEPVAM L AEPVAM L AEPVAM L AEPVAM L SLLNSP
901 Kedyfpmafs ykleytdenk lslktpeinv flelvhqsey eeqeiikeld ktvlnlqyqf
V
961 qevkvtsdqy qklshpmmte gSSNQGKKse gTPNQGKKae gAPNQGKKae gTPNQGKKae
R2 → SPNQLKL SPNQLKL SPNQLKL SPNQLKL
1021 gapsqqSPTT ELTnylpdlg kkideiikkq gknwktevel iedniagdak llyfilrdds
SPTS GHT
1081 ksgdpkkssl kvkitvkqsn nnqepesk
图十七 猪肺炎霉浆菌P 97吸附蛋白之拟抗原决定部位(mimotopes)分析.
在heptapeptide中对应到4个以上相同之胺基酸者,以大写字母表示.φ 51
(AEPVAML)及φ 58 (SISNLLL)以方格标示.R1,R2为C端的重复序列.
90
91
Hydrophilicityydrophilicity
Amino Acid Residue
图十八 以PC/GENE软体分析猪肺炎霉浆菌P 97吸附蛋白之抗原决定部位.
此图是以Hopp and Woods演算法所得之结果,纵轴为亲水性指数;横
轴为P 97吸附蛋白的胺基酸顺序.虚线所指为最可能之抗原决定部位
所在,此方法是以每七个胺基酸为一个单位来计算其亲水性指数.
Amino Acid Residue
图十八 以PC/GENE软体分析猪肺炎霉浆菌P 97吸附蛋白之抗原决定部位.
此图是以Hopp and Woods演算法所得之结果,纵轴为亲水性指数;横
轴为P 97吸附蛋白的胺基酸顺序.虚线所指为最可能之抗原决定部位
所在,此方法是以每七个胺基酸为一个单位来计算其亲水性指数.
10
100
1000
10000
100000
5158
CS2CS4CS5M13Pfize
r
10e1010e14
N
o adjuvant
TB
S
Samples
Titer
2wk
15wk
(A)
4wk
6wk
8wk
4wk
6wk
8wk
10
100
1000
10000
5
1
5
8
C
S2
C
S4
C
S5
M1
3
P
fizer
1
0e10
1
0e14
N
o ad
juv
an
t
T
BS
Samples
Titer
2wk
15wk
(B)
图十九 不同时间诱发的抗体IgG效价.
Pfizer测试之抗原为猪肺炎霉浆菌,其余样品测试使用
之抗原为噬菌体M13.(A)腹腔注射;(B)鼻腔投予.
每一数据为三只小鼠之平均.Pfizer鼻腔投予之小鼠第
6周后陆续死亡,因此无数据显示.10e10,10e14分
别代表1010及1014 pfu之φ58.
92
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
1:1001:2001:4001:8001:1600
Sera Dilution
OD 405
(A)
93
0
0.5
1
1.5
1:1001:2001:4001:8001:1600
Sera Dilution
OD 405
2
(B)
图二十 筛选之噬菌体诱发的抗体IgG对猪肺炎霉浆菌之免疫测试.
测试之血清为第15周收集的样品(A)腹腔注射;(B)鼻腔投予.噬菌体
使用的剂量为1012 pfu (除非特别注明)符号代表如下:φCS2(), φCS4
(), φCS5(▲), φ51(), φ58 (), wild type M13(), φ58未加佐剂(△), 1014
pfu φ58(), 1010 pfu φ58(), TBS ()及Pfizer vaccine ().
CS2CS4CS55158Pfizer
Titer
101
102
103
104
105
IgG1
IgG2a
图二十一 筛选之噬菌体诱发的抗体IgG亚型效价分析.
测试样品为腹腔注射第8周之血清.
94
Samples
CS2CS4CS55158M13PfizerTBS
OD405
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
i.p.
i.n.
(A)
(B)
CS2CS4CS55158M13PfizerTBS
OD405
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
i.p.
i.n.
图二十二 筛选之噬菌体诱发的抗体IgA分析.
(A)粪抗体IgA反应;(B)肺冲洗液IgA反应.
i.p.:腹腔注射;i.n.:鼻腔投予.鼻腔投予Pfizer
疫苗之小鼠已经死亡,因此没有数据显示.
95
kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 kDa
96
图二十三 筛选之噬菌体诱发的抗体对猪肺炎霉浆菌蛋白之辨识分析.
此图为西方墨点法测试之结果,抗原为猪肺炎霉浆菌总蛋白萃
取物,抗体样品如下,1:preimmune sera,2:φCS2,3:φCS4,
4:φCS5,5:clone φ51,6:clone φ58,7:wild type M13,8:
TBS,9:Pfizer vaccine,10:convalescent pig serum.图左的数
字为protein marker的分子量;图右的数字为抗体所辨识蛋白质
的分子量.
210
127
84
49.5
35.3
28.1
145
97
76
56
46
30
23
(A)
(B)
图二十四 Friis培养液吸收光谱图.
(A) Friis培养液;(B)有猪肺炎霉浆菌生长的Friis培养液.
扫描波长范围自340 nm到1100 nm.
97 97
98
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
10 20 40 80 160 320 640 1280
Serum dilution
OD570
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
10 20 40 80 160 320 640 1280
Serum dilution
OD570
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
2 4 8 16 32 64 128 256
BALF dilution
OD570
(A)
(B)
图二十五 猪肺炎霉浆菌生长抑制测试.
以105 CCU的猪肺炎霉浆菌
(A),(C)为腹腔注射;(B),(
φCS2 (), φCS4 (), φCS5 (▲)
wild type M13 phage ()及TB
, φ51 (), φ58 (), Pfizer vaccine (),
S ().鼻腔投予Pfizer疫苗之小鼠已经
死亡,因此(B),(D)中没有数 据显示.每一点为三只小鼠之平均值.
(C)
(D)
与系列稀释之血清或肺冲洗液进行测试.
D)为鼻腔投予.样品符号如下所示:
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
2 4 8 16 32 64 128 256
BALF dilution
OD570
(A)
(B)
图二十六 噬菌斑降减试验法.
本试验以相同数量之φ 51及φ 58噬菌体与抗体58
(φ 58免疫产生之抗体)进行测试.
(A)图左边是未加入抗体58时,噬菌体φ 58散布在培养基之
情形;图右为加入抗体58与噬菌体φ 58作用后之情形.
(B)图左边是未加入抗体58时,噬菌体φ 51散布在培养基之
情形;图右为加入抗体58与噬菌体φ 51作用后之情形.
99 99
(A) (D)
kDa 1 2 3 4 5 kDa 1 2 3 4 5
100
(B) (E)
(C) (F)
图二十七 筛选之噬菌体及Pfizer疫苗诱发的抗体对不同菌株间之交叉反应.
使用之抗体(A) CS2,(B) CS4,(C) CS5,(D) φ51,(E) φ58,(F) Pfizer.
样品代号1:M. hyorhinis,2:M. pneumoniae,3:M. galisepticum,4:
M. pulmonis,5:E. coli.每个图左边的数字为分子量大小.
150
113
105
60
105
84
60
kDa 1 2 3 4 5 kDa 1 2 3 4 5
150
113
60
105
60
kDa 1 2 3 4 5 kDa 2 3 4 5 1
150
113150
113
92
60
29
Random peptide library
approach
Recombinant DNA
approach
Identification
of the etiologic agent Selection of phagotopes
using antibodies
Identification
of relevant antigens
Gene cloning
Expression of antigens
Epitope mapping Mutagenesis Epitope mapping
Detoxification
Immunogenicity test
图二十八 重组DNA与噬菌体呈现技术在疫苗研究策略上之比较.
101 101
表一,柔膜体纲(Mollicutes)与其他真细菌类(eubacteria)特性的主要差异
Property Mollicutes Other eubacteria
Cell wall Absent Present
Plasma membrane Cholesterol present in most species Cholesterol absent
Genome size 580 ~ 2,220 kb 1,050 ~ >10,000 kb
G + C content of genome 23 ~ 40 mol% 25 ~ 75 mol%
No. of rRNA operons 1 or 2a 1 ~ 10
5S rRNA length 104 ~113 ntb >114 nt
No. of tRNA genes 30 (M. capricolum), 84 (B. subtilis),
33 (M. pneumoniae) 86 (E. coli)
UGA codon usage Tryptophan codon in Mycoplasma, Stop codon
Ureaplasma, Spiroplasma, Mesoplasma
RNA polymerase Rifampin resistant Rifampin sensitive
a Three rRNA operons in Mesoplasma lactucae.
b nt, nucleotides.
(摘录自 Razin et al, 1998)
102 102
表二,柔膜体纲(Mollicutes)的主要特性与分类
(摘录自 Razin et al, 1998)
103 103
表三,培养基及培养液之配制
培养液 (基) 配 制 内 容
Agarose Top
Per liter: 10 g tryptone, 5 g yeast extract, 5 g NaCl, 1 g MgCl2
6H2O, 8 g agarose. Autoclave, Store solid at room temperature,
melt in microwave as needed.
Friis medium 详见表五.
LB medium
10 g tryptone, 5 g yeast extract, 10 g NaCl, (15 g agar for plate)
add H2O to 1L. Autoclave, store at room temperature.
LB/IPTG/Xgal
Plates
LB medium+15 g/L agar. Autoclave, cool to < 70℃, add 1ml
IPTG/Xgal and pour. Store plates at 4℃ in the dark.
Minimal medium
(for maintain pili
of E. coli ER2537)
Per liter: 500 ml 2× M9 salts, 20 ml 20% glucose, 500 ml 3%
agar, 2 ml 1M MgSO4, 0.1 ml 1M CaCl2, 1 ml thiamine (10
mg/ml). Autoclave all components separately, cool to < 70℃
(filter sterilize glucose and thiamine) before combining. Store
plates at 4℃.
Modified Friis
medium
以horse serum 取代Friis medium中的 porcine serum.
104
表四,缓冲液及实验试剂之配制
2× M9 salts Per liter: 12 g Na2HPO4, 6 gKH2PO4, 1 g NaCl, 2 g NH4Cl.
30% acrylamide 29 g acrylamide, 1 g bis-acrylamide add H2O to 100 ml (filtered)
[acrylamide为神经毒(),操作时务必戴手套!]
40% acrylamide 38 g acrylamide, 2 g bis-acrylamide add H2O to 100 ml (filtered)
6%
polyacrylamide
21.6 g urea, 6.75 ml 40 % acrylamide, 4.5 ml 10× TBE, 300 l
10% APS, 15 l TEMED, add H2O to 45 ml.
ABTS substrate
soultion
Add 150 mg 2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic
acid) to 500 ml of 0.1 M anhydrous citric acid in ddH2O; adjust
pH to 4.35 with NaOH. Aliquot and store at -20℃. Add 100 l
3% H2O2 prior to use.
Antibody eluted
buffer
0.1 M glycine-HCl, pH 2.5
AP buffer 100 mM Tris (pH 9.5), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2
BCIP
50 mg BCIP di-sodium salt in 1 ml of 100% dimethylformamide,
Store at 4℃ in the dark.
Electrode buffer
(10× stock)
30.2 g Tris, 188 g glycine, and 100 ml 10% SDS add H2O to 1 L.
ELISA blocking
buffer
0.5 g skim milk in 100 ml ELISA coating buffer
ELISA coating
buffer
2.93 g NaHCO3, and 1.59 g Na2CO3 add H2O to 1 L, pH 9.6.
Equilibration
buffer
100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl. Store at room
temperature.
EtBr 1 g EtBr in 100 ml H2O, Store at 4℃ in the dark.
105
Fecal antibody
extraction buffer
8 g NaCl, 0.2 g KCl, 2.9 g Na2HPO4 12H2O, 0.2 g KH2PO4, add
ddH2O to 1 L, pH 7.4. containing 50 mM EDTA and 25 g/ml
trypsin inhibitor.
Horseradish
peroxidase
stopping solution
Add 50 ml of dimethylformamide (DMF) to 50 ml ddH2O, then
add 20g sodium dodecyl sulfate (SDS).
Iodide buffer
10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 4 M NaI.
Store at room temperature.
IPTG-Xgal
Mix 1.25 g IPTG and 1 g Xgal in 25 ml dimethylformamide.
Store at -20℃ in the dark.
NBT 50 mg NBT in 1 ml 70% dimethylformamide. Store at 4℃.
PBS
8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, and 0.24 g KH2PO4 add
H2O to 1 L, pH 7.4
PEG/NaCl
20% (w/v) polyethylene glycol-8000, 2.5 M NaCl. Autoclave,
Store at room temperature.
Phage elute buffer 0.2 M glycine-HCl, pH 2.2, 1 mg/ml BSA
SDS loading dye
(2×)
100 mM Tris (pH 6.8), 200 mM DTT, 0.2% bromophenol blue,
4% SDS, 20% glycerol. Store at -20℃.
TAE buffer
(50× stock)
242 g Tris, 57.1 ml glacial acetic acid, and 100 ml 0.5 M EDTA
add H2O to 1 L, pH 8.0. Store at room temperature.
TBST
8 g NaCl, 0.2 g KCl, 3 g Tris, and 0.5 ml Tween-20. Add H2O to
1 L, pH 7.4.
Western blot
transfer buffer
2.9 g glycine, 5.8 g Tris, 1.37 g SDS, and 200 ml methanol. Add
H2O to 1 L, pH 8.3. Store at room temperature.
106
表五,Friis medium的制备(2×)
Hank's A solution Hank's B solution
NaCl 8 g Na2HPO4 2H2O 0.08 g
KCl 0.4 g KH2PO4 0.12 g
MgSO4 7H2O 0.1 g Add H2O to 50 ml,Store at 4℃
MgCl2 6H2O 0.1 g
CaCl2 0.14 g
Add H2O to 50 ml,Store at 4℃
Yeast extract
1. Dry Saccharomyces cerevisiae 30g, add H2O to 180ml.
2. 100℃ for 5 min.
3. Centrifuge 3,200 rpm, for 30 min.
4. Filtered through a glass filter and 0.45 m membrane filter, store at -20℃.
2% phenol red
1. Take 0.1 g phenol red, adds H2O to 50ml, and adjusts pH to 7.0.
2. Filtered through a filter paper, store at 4℃.
Heat porcine serum
1. Water bath 56℃ for 30 min. store at -20℃.
2. Before use, filtered through glass fiber filter, then store at 4℃.
2× Friis medium preparation (580 ml)
1. Hank's A 12.5 ml
Hank's B 12.5 ml
BHI 4.1 g
PPLO w/o 4.35 g
Add 287.5 ml pure H2O, place at water bath 100℃ for 5 min, then cool to 45℃.
2. Add yeast extract 30 ml
phenol red 4.5 ml
heated porcine serum 250 ml
3. Adjust pH 7.36 ~ 7.38, then sterilized by filtration through (0.8 m,0.45 m,0.22 m),
store at 4℃.
107 107
表六,以PC/GENE之QGSEARCH程式进行筛选所得heptapeptides与猪肺炎霉
浆菌蛋白质序列比对之操作步骤
LEVEL Item selection
1 (1) Program selection by menu
2 (3) Sequence analysis
3 (2) Protein sequence analysis
4 (1) Primary structure analysis
5 (1) QGSEARCH:Quick global search for a subsequence
--- Define the subsequence to be searched
--- Select "protein"
--- Key in subsequence [_ _ _ _ _ _ _]
--- Number of mismatches allowed (0 to 5) [_ _]
--- Define the range of the search
--- Search in a number of selected sequence entries
--- Key in the names of the sequences to be searched
--- Carry on the search
--- Display/output the results of the search
108
表七 经生物亲和性筛选所得到噬菌体之外源氨基酸序列
ph.D7 library ph.Dc7c library
Clone
no.
Sequence Clone
no.
Sequence Clone
no.
Sequence Clone
no.
Sequence
1 TNAPRMA 36 FAQDLQG 1 SPGDSPE 41 QTALNRF
2 TSLQHLM 37 FNQDLHS 2 PQSLVRI 42 QTALNRF
3 SSTPALL 38 FAQDLQG 3 PQSLRHI 43 QTALNRF
4 MGHKYSQ 39 SAHPLYT 4 SPGDSPE 44 LPSLSSG
5 SPTSGHT 40 SAHPLYT 5 LPSLSSG 45 PEKMLAW
6 YNAPPQL 41 FAQDLQG 6 PQSLVRI 46 QTALNRF
7 WNTKASY 42 FAQDLQG 7 PQFLTNI 47 SVRTDTH
8 SEHSVRL 43 FAQDLQG 8 NPFDHAS 48 QTALNRF
9 WNTKASY 44 FAQDLQG 9 PQFLTNI 49 QTALNRF
10 LNSKGPI 45 FAQDLQG 10 NPFNHSA 50 QTALNRF
11 LPRPFTL 46 FNQDLHS 11 LQRLQQH 51 LPSLSSG
12 AVVPKSL 47 FAQDLQG 12 PKPEQLL 52 LPSLSSG
13 SLLNSPV 48 FAQDLQG 13 KQFLNMR 53 LPSLSSG
14 EPWYYSP 49 FAQDLQG 14 SPGDSPE 54 QTALNRF
15 TFVRINP 50 FAQDLQG 15 PQFLSNI 55 SVRTDTH
16 AWYSLTW 51 AEPVAML 16 KQFLNMR 56 PVQNPRY
17 MPFGDHH 52 FNQDIMG 17 LHPWHKN 57 SVRTDTH
18 ITNGPPM 53 FNQDIMG 18 NSWLNMT 58 QTALNRF
19 SLAMYQY 54 FNQDIMG 19 PQQLTRI 59 LPSLSSG
20 DSRNSAT 55 AHPQLAT 20 PQSLSRL 60 PVQNPRY
21 LTLPAAL 56 SGFVFQQ 21 PQMLSRI 61 KNLGVKE
22 TSLQHLV 57 AHPQLAT 22 SPGDSPE 62 SPNQLKL
23 SHTPALL 58 SISNLLL 23 LHPWHKN 63 SPNQLKL
24 IPLQSLS 59 YTFTQDN 24 NPFDHAS 64 PKPEQGR
25 LHAGMPP 60 AHPQLAT 25 SVRTDTH 65 KNLGVKE
26 LAQRFST 61 FAQDLQG 26 EGPAPEE 66 LFDRNNS
27 WNTKASY 62 FAQDLQG 27 SVRTDTH 67 SPNQLKL
28 SEHSVRL 63 EVTSTAF 28 WLNMSKD 68 SPNQLKL
29 SEHSVRL 64 YTFTQDN 29 NPFDHAS 69 PKPEQGR
30 LNSKGPI 65 YTFRQDM 30 NPFDHAS 70 KNLGVKE
31 TIANLSL 66 EVTSTAF 31 PQHLHRV 71 TLPSLRH
32 SAHPLYT 67 RPLRNWP 32 PVQNPRY 72 PKPEQGR
33 FAQDLQG 68 FSQDLHP 33 LHPWHKN 73 KNLGVKE
34 FAQDLQG 69 RPLRNWP 34 PVQNPRY 74 SPNQLKL
35 FAQDLQG 70 FSQDLHP 35 TLPSLRH 75 PKPEQGR
36 PQFLTNI 76 SPNQLKL
37 NPFNHQL 77 PKPEQGR
38 LFDRNNS 78 SPNQLKL
39 TLDRLKQ 79 KNLGVKE
40 NPFNHSG 80 KNLGVKE
109
表八,噬菌体呈现phagotopes所对应到之猪肺炎霉浆菌蛋白质
Protein
PIR
Accession
Number
Protein size
(aa / kDa)
No. of
Matched
Clones
Function Reference
1. P97 T18353
1108 / 125
(SDS-PAGE:
97 kDa)
38 adhesion protein Hsu et al, 1997
2. P110 AAF87780 1410 / 110 34 membrane protein precursor -
3. P102 T03806 904 / 102 29 hypothetical protein
Hsu and Minion,
1998
4. P146 AAF91425 1296 / 146 28 adhesin like-protein -
5. YX2 AAF87781 560 / 64 18 unknown -
6. Dna K Q49539 600 / 65 15 heat shock protein Chou et al, 1997
7. ORF 3 BAA05050 559 / 68 15 unknown
Hsu and Minion,
1998
8. P65 T03821 627 / 71 13
major immunogenic surface
lipoprotein
-
9. pr 1 AAB38110 533 / 62 13
multidrug resistance protein
homolog
Blanchard et al,
1996
10. pr 2 AAB38111 537 / 62 12
multidrug resistance protein
homolog
Blanchard et al,
1996
11. PTS I AAF22216
578 / 65
(SDS-PAGE:
72 kDa)
12
phosphoenolpyruvate sugar
phospho- transferase system
(PTS) enzyme I
Chung et al, 2000
110
表九,噬菌体呈现phagotopes彼此间一致性序列之比对.
T S L Q H L M
T S L Q H L V
S P T S G H T
A V V P K S L
I P L Q S L S
T I A N L S L
S I S N L L L
S A H P L Y T (3)
S S T P A L L
S H T P A L L
CS1 S I - P T/L S/L L
K Q F L N M R (2)
P Q F L T N I (3)
P Q F L S N I
P Q S L R H I
P Q S L V R I (2)
P Q M L S R I
P Q Q L T R I
P Q H L H R V
P Q S L S R L
T L D R L K Q
L Q R L Q Q H
CS4 P Q S/F L S R I/L
F N Q D I M G (3)
F A Q D L Q G (16)
F S Q D L H P (2)
F N Q D L H S (2)
Y T F T Q D N (2)
Y T F R Q D M
CS2 F - Q D L
N P F D H A S (4)
N P F N H S A
N P F N H S G
N P F N H Q L
CS5 N P F N H
K Q F L N M R (2)
N S W L N M T
W L N M S K D
CS3 L N M
P K P E Q L L
P K P E Q G R (5)
E G P A P E E
CS6 P - P E
一致性的序列以粗斜体大写字母表示,CS代表Consensus Sequence,括号内之数
字表示此序列在筛选之噬菌体中被发现之次数.CS1 ~ CS2是筛自ph.D.-7 library;
CS3 ~ CS6是筛自ph.D.-c7c library.
111
表十,测试之疫苗诱发的抗体在不同菌株间之交叉反应分析.
φ51 φ58 CS2 CS4 CS5 Pfizer
M. hyopneumoniae + + + + + +
M. hyorhinis + + + + - +
M. pneumoniae - - + + - +
M. gallisepticum - - + + - +
M. pulmonis + + + + + +
E. coli - - - - - +
+:有交叉反应
-:无交叉反应
112
附录一,药品及试剂来源
药品,试剂名称 购 自
ABTS,ABTS buffer (10 ×) Zymed
Adjuvant (TiterMax Gold) CytRx
AP conjugated goat anti-mouse IgA/ IgG antibody Zymed
AP conjugated goat anti-rabbit IgG antibody Zymed
AP conjugated rabbit anti-mouse IgG1/ IgG2a antibodyZymed
AP conjugated rabbit anti-porcine IgG antibody Zymed
DNA sequencing kit Amersham Pharmacia Biotech
Horse serum BioWest
HRP-streptavidin Zymed
IPTG MDBio
Isotope [α-35S] dATP Amersham Pharmacia Biotech
Nitrocellulose membrane Amersham Pharmacia Biotech
Phage display kits New England Biolabs
p-nitrophenyl phosphate (PNPP),PNPP buffer (10 ×) Zymed
Porcine serum GibcoBRL
Primer MDBio
Protein A-agarose Pierce
Protein assay reagent BioRad
Protein ladder BioRad
TEMED BioRad
Trypsin inhibitor Sigma
X-gal MDBio
一般化学药品 J. T. Baker,Sigma,SERVA,
Difco
113
附录二
简 历
姓 名: 杨 文 仁
性 别: 男
籍 贯: 台湾省高雄县.
住 址: 高雄县燕巢乡凤雄村后龙巷86号
电 话: (07) 615-3226
E- mail: wj187@yahoo.com.tw
兴 趣: 电脑,思考,听音乐,逛书局,打垒球,跑步.
专 长: 分子生物学,生物制剂及疫苗研发.
座右铭: 大地藏无尽,勤劳兹有生,念哉斯意厚,努力事春耕.
学 历: 凤雄国小,道明中学,前镇高中
中国文化大学畜牧学系学士
中国文化大学生物科技研究所硕士
国立中山大学生物科学系博士
经 历: 中央研究院分子生物学研究所研究生
服预官役 (装甲兵少尉排长)
卫生署预防医学研究所生物制剂制造组研究助理
担任中山大学辐射生物学,生物化学实验,遗传学实验,生物化学,
生物技术慨论;东华大学生物资讯学,分子检验等课程助教
担任教育部88年大学基础科学设立「教学谘询」研习营教学助教
国立科学工艺博物馆「生物科技之挑战」系列------教师研习活动
实验助教
学会会员:
中华民国细胞及分子生物学学会 The Chinese Society of Cell and Molecular Biology
国际霉浆菌学会组织 International Organization for Mycoplasmology (IOM)
中华基因治疗及疫苗协会 Chinese Association of Gene Therapy and Vaccines (CAGTAV)
台湾生物资讯学会 Taiwan Bioinformatics Society
114 114
参与之研究计画:
计 画 名 称 起 迄 年 月补 助 机 构
疫苗研究发展群体计画
83/10 ~ 85/6
85/7 ~ 88/6
国家卫生院
日本脑炎疫苗安定性的研究 83/10 ~ 84/6 卫生署
日本脑炎病毒之分离纯化 84/7 ~ 85/6 卫生署
疫苗佐剂之研发 85/7 ~ 86/6 卫生署
日本脑炎病毒不活化剂之比较 85/7 ~ 86/6 卫生署
日本脑炎疫苗制程之改进 85/7 ~ 87/6 卫生署
利用噬菌体表达之单源抗体库进
行Epitope mapping 并发展对抗霉
浆菌Mycoplasma hyopneumoniae
之疫苗
86/8 ~ 88/7 国科会
高生物素含量酵母之开发
(台糖公司的产学合作计划)
86/8 ~ 90/7 国科会
酵母口服疫苗之研发
(农业生物技术国家型科技计划)
89/8 ~ 90/10 国科会
对抗猪肺炎霉浆菌之分子疫苗 90/8 ~ 91/7 国科会
荣誉与奖励:
1. Research and Development Award - Department of Health, Executive Yuan,
Taiwan, 1996.(行政院卫生署研究论文奖)
2. Student Travel Fellowship - 13th International Conference of the International
Orgnization for Mycoplasmology (IOM), Fukuoka, Japan, 2000.
3. Shen-Non Prize (神农奖) - Achievement Award, National Sun Yat-sen
University, Taiwan, 2000.(中山大学研究生论文奖)
115
附录三
PUBLICATIONS
(A) Referred Papers
1. Ruwen Jou, Souru Kan, Wen-Jen Yang, Ching Huang, Man-Ku Chang and Ming-Yi Liau (1996)
Study on the stability of Japanese encephalitis vaccine : Development of freeze-dry dosage form.
Chinese J. Microbiol. Immunol. 29: 57-64.
2. Ruwen Jou, Aih-Jing Chiou, Wen-Jen Yang, Souru Kan and Ming-Yi Liau (1997) Process
development of cell culture adapted Japanese encephalitis vaccine. Annual Report of National
Institute of Preventive Medicine. 10: 1-10.
3. Bai-Ling Lin and Wen-Jen Yang (1999) Blue light and abscisic acid independently induce
heterophyllous switch in Marsilea quadrifolia. Plant Physiol. 119: 429-434.
4. Larry K. Steinrauf, David Shiuan, Wen-Jen Yang and Michael Y. Chiang (1999) Lysozyme
association with nucleic acids. Biochem. Biophys. Res. Commun. 266: 366-370.
5. David Shiuan and Wen-Jen Yang (2001) Social and ethical issues associated with the
advancement of biotechnology. Chinese Biosceince (ROC) 44: 78-91.
6. Ya-Lei Chen, Shao-Ning Wang, Wen-Jen Yang, Yi-Jiun Chen, His-Hsun Lin and David Shiuan.
(2003) Expression and immunogenicity of Mycoplasma hyopneumoniae heat shock protein
antigen P42 by DNA vaccination. Infect. Immun. (In press)
7. Wen-Jen Yang and David Shiuan (2003) Plaque reduction test: an alternative method to assess
antibody response to pIII displayed peptide of filamentous phage M13. J. Immunol. Methods (In
press)
8. Wen-Jen Yang and David Shiuan (2003) Epitope mapping of Mycoplasma hyopneumoniae
using phage displayed peptide libraries and the immune responses of selected phagotopes. Infect.
Immun. (In revised)
9. Wen-Jen Yang, Tzu-Hsuan Yang, Wen-Shan Tsao and David Shiuan (2003) Phage display
technology and its applications in biotechnology. Chinese Biosceince (ROC) (Submitted)
116
(B) Conference paper (selective)
1. W.-J. Yang, R Jou, A.-J. Chiou, S.-R. Kang, N.-C. Yang, Y.-R. Kao, W.-L. Huang, M.-Y. Liau.
(1997) Purification process development for Japanese encephalitis vaccine. The 13th Joint Ann.
Confer. of Biomed. Sci. pp197.
2. J.-F Lai, W.-J. Yang and D. Shiuan. (2000) Epitope analysis and immunological studies of the
surface protein P42 of Mycoplasma hyopneumoniae. The 15th Joint Ann. Confer. of Biomed. Sci.
pp219.
3. W.-J. Yang and D. Shiuan. (2000) Development of phage display vaccine against Mycoplasma
hyopneumoniae. International Organization for Mycoplasmology (IOM) Fukuoka, Japan, pp207.
(selected presentation)
4. W. Yang, S. Wang, Y. Chen, I. Chen, and D. Shiuan. (2001) Development of DNA vaccine
carrying the heat shock protein gene P42 against Mycoplasma hyopneumoniae. American Society
for Microbiology (ASM) Florida, USA, pp390.
5. W.-J. Yang and D. Shiuan. (2001) Diagnostic application and vaccine development of
Mycoplasma hyopneumoniae using phage display libraries. The 9th Society of Chinese
Bioscientists in America (SCBA) International Symposium. Taipei, ROC, pp436.
Standards for the Ph.D. degree in Biochemistry and Molecular Biology
(本图摘录自Trends in Biochemical Sciences, 1989, 14:206)
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