广州找工作 豆瓣:实验18 叶绿体的分离及其完整度的测定

实验18  叶绿体的分离及其完整度的测定

叶绿体是光合作用的细胞器，在光合作用研究中，常需用提取的叶绿体开展研究工作。

一、叶绿体的分离

【原理】

    研磨叶片得到的匀浆，经过滤、离心可制备叶绿体。叶绿体的被膜比较脆弱，分离叶绿体应在等渗的缓冲溶液中，0～4℃温度下进行。叶绿体活力会随着离体时间延长而不断下降，因此，分离工作尽可能在短时间内完成。

    【仪器与用具】   

    冰箱；离心机；扭力天平；显微镜；pH计；研钵；量筒；移液管；离心管；脱脂纱布等。分离器皿都须在0℃下预冷。

    【试剂】

①分离介质

含0.33mol/L 山梨醇，50mmol/L Tris-HCl(或Tricine) pH7.6，5mmol/L MgCl₂，10mmol/L NaCl，2mmol/L EDTA，2mmol/L 异抗坏血酸钠。

配法：称60g山梨醇、6.06g Tris、1g MgCl₂·6H₂O、0.6g NaCl、0.77g EDTA-Na₂、0.4g异抗坏血酸钠，溶解后用1mol/L HCl调pH至7.6，定容至1000ml。

②悬浮和测定介质Ⅰ

0.66mol/L 山梨醇，2mmol/L MgCl₂, 2mmol/L MnCl₂，4mmol/L EDTA，10mmol/L焦磷酸钠，100mmol/L Tris-HCl pH7.6。

配法：称60g山梨醇、0.2g MgCl₂·6H₂O、0.2g MnCl₂·4H₂O、0.75g EDTANa₂、2.23g Na₄P₂O₇·10H₂O、6.06g Tris，溶解后用1mol/L HCl调pH至7.6，定容至500ml。

    ③悬浮和测定介质Ⅱ：测定介质Ⅰ稀释1倍。

    【方法】

    1．选用生长健壮，最好是连续几个晴天下生长的菠菜叶片，洗净后去除中脉，放入0～4℃冰箱或冰瓶中预冷。

    2．分离介质30～50ml，置于研钵中，并在冰箱中预冷至现薄冰。

    3．取冷却的菠菜叶片10～20g，撕碎后放入研钵，用手工快速研磨0.30～1min，注意不要用力过猛，也不必研磨过细，以叶片磨成小块时即可，研磨后将匀浆用两层新纱布过滤。

    4．将滤液装入预冷过的二个离心管，经天平平衡后，用离心机以1000r/min离心2min。

    5．倾去上层液，沉淀即为叶绿体。随后每管加2ml悬浮和测定介质Ⅱ，并用吸管冲散沉淀。叶绿体悬浮液合并后放冰瓶中备用。

    6．用滴管吸取少量叶绿体，加少量悬浮和测定介质Ⅱ稀释，置显微镜（400～600倍）下，观察叶绿体的形态。

上述是机械法从叶片中分离叶绿体，此外也可从原生质体中分离高活性的叶绿体，具体方法可参照《生物生产力和光合作用测定技术》（科学出版社，1986）一书。

二、叶绿体被膜完整度的测定

【原理】

由于铁氰化钾不能透过被膜，故完整叶绿体在等渗介质中不能进行铁氰化钾光还原的Hill反应。而失去完整被膜的叶绿体，铁氰化钾可以进入类囊体进行Hill反应。根据这一原理，比较胀破与未胀破的叶绿体Hill反应速率，就可计算叶绿体被膜的完整度。

    【仪器与用具】

    氧电极测氧全套装置（见实验20）；烧杯；微量进样器；洗耳球等。

    【试剂】

    测定介质Ⅰ和Ⅱ  见一。

    100mmol/L铁氰化钾：称3.29g铁氰化钾溶于水，定容至100ml。

    100mmol/L NH₄Cl：称0.54g NH₄Cl溶于水，定容至100ml。

    适量叶绿体（20～50μg Chl/ml反应体系）。

    【方法】

    1．取0.1ml叶绿体提取液加到0.9ml的蒸馏水中并搅拌1min，使叶绿体被膜胀破，加1ml测定介质Ⅰ悬浮备用。

    2．取0.1ml未胀破叶绿体提取液加入反应杯中，视反应杯体积加入测定介质Ⅱ，加入适量铁氰化钾和NH₄Cl，使铁氰化钾和NH₄Cl的最终浓度都为1mmol/L。搅拌，平衡1min，照光测定Hill反应放氧速率，记录5min，然后清洗反应杯。

    3．将已胀破叶绿体加入反应杯中，再加入适量测定介质Ⅱ、铁氰化钾和NH₄Cl，使反应体系物质最终浓度同未胀破叶绿体测定体系，测定过程同2。

    4．分别计算胀破和未胀破的叶绿体测定体系中单位时间的放氧量(或Hill反应速率)。

    5．计算被膜完整度。

被膜完整度（%）=

式中  A－胀破叶绿体单位时间内的放氧量（或Hill反应速率）

B－未胀破叶绿体单位时间内的放氧量（或Hill反应速率）

    【注意事项】

    1. 本实验所用试剂要存放在冰箱中，存放时间不宜过长，最好现配现用。

    2. 叶绿体的分离要在0～4℃下进行，玻璃器皿和溶液都须预冷，操作要快，整个分离过程最好在5min内完成。

    3. 离心过程中离心机的转速不宜过高，否则叶绿体中的淀粉粒会打破叶绿体被膜。

    4. 被膜完整度的测定过程中，反应杯内破碎叶绿体与完整叶绿体的叶绿素含量应相等。

【思考题】

1. 为什么叶绿体的提取要在低温的介质中进行？

2. 反应体系中为什么要加入NH₄Cl？