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高效液相色谱法多波长同时检测饮料中的5种食品添加剂
作者：骆和东,贾玉珠,朱宝平
以安赛蜜(乙酰磺胺酸钾,Acesulfame2K,简称AK)、甜味素(天门冬酰苯丙氨酸甲酯,Aspartame,简称APM)、糖精钠、苯甲酸、山梨酸等为代表的甜味剂和防腐剂在食品饮料中应用很广,且常被混合使用,同时添加。在我国食品添加剂使用卫生标准中[1],对其使用范围和最大使用限量均有规定,但国标[224]及文献[5,6]中多是针对一种或几种,且同时检测存在灵敏度不高、未考虑共存物的干扰等问题[7]。因此,建立一种灵敏有效、简便快速的方法同时测定这5种添加剂在实际工作中有很强的实用性。
本文采用高效液相色谱法(HPLC),利用二极管阵列检测器特有的程序可变波长功能,根据不同组分的出峰顺序,在各种添加剂各自的出峰时间,分别选用其最佳检测波长同时检测。该方法既克服了单一波长对不同组分进行检测时对检测灵敏度的影响,同时还可减少一些可能存在的共存物的干扰,灵敏度高,结果准确,操作简便,适合食品饮料中该5种添加剂的快速分离同时检测。
1材料与方法
1.1仪器与试剂 AgilentHP1100高效液相色谱仪,四元梯度泵,在线真空脱气机,自动进样器,柱温箱,二极管阵列检测器(DAD),HP1100工作站,超声波清洗器,真空抽滤器。甲醇:HPLC级,美国TEDIA;0.02mol/L乙酸铵溶液:称取1.54g分析纯乙铵,用亚沸重蒸水定酸容到1000ml,用醋酸调节pH至5.0,再用0.45Lm滤膜过滤;糖精钠、苯甲酸、山梨酸标准溶液:各1mg/ml,购国家标准自物质中心;AK和APM标准溶液:准确称取AK、APM各50mg,分别用纯水定容至25.0ml,此溶液每毫升相当于AK、APM各2mg/ml。
1.2测定方法
1.2.1样品处理饮料经超声除去CO2后,准确称取待测样1.0g(或1.0ml),用纯水稀释定容到10.0ml,摇匀,经0.45Lm滤膜过滤备测。
1.2.2色谱条件色谱柱:HypersilODS5Lm,250mm@4mm;流动相:甲醇+0102mol/LpH510乙酸铵溶液(29+71);流速:110ml/min;柱温:35e;进样量:2.0LL;检测器:二极管阵列检测器(DAD),190~900mm,可波长编程;程序可变波长:见表1。

2结果与讨论
2.1流动相及其比例的选择分别采用甲醇/0.02mol/L乙酸铵溶液和0.1%四氢呋喃/乙腈作流动相进行检测,后者虽然对APM有较好的峰形,但对另4个组分分离不好。我们选用前者作为流动相,并用不同的比例进行实验。结果表明,当甲醇/0.02mol/L乙酸铵溶液配比为29/71时,5种组分分离完全,峰形较好。甲醇低于该比例时,分析时间较长,峰形拖尾;高于该比例时,AK、糖精钠分离不好。因而实验选用29/71作为甲醇/0.02mol/L乙酸铵溶液的比例,可使5种组分在8min内分离完全(图1),图2为样品色谱图。

2.2流动相pH值对组分分离的影响将流动相中0.02mol/L乙酸铵溶液pH值分别调成4.2、4.9、5.5、6.0、6.7进行实验,结果表明,pH值为4.9~5.5时,5种组分可完全分离,故实验选择的pH值为5.0。实验中还发现,pH值的改变对糖精钠、AK、APM的分离影响不大,而对苯甲酸、山梨酸的分离有明显影响。如当pH值为4.9时,出峰时间t苯=4.974min,t山=7.848min;当pH值为6.0时,t苯=2.811min,t山=3.509min。利用该特点,当有其它组分干扰防腐剂测定时,可选用不同的pH值测定来排除干扰。
2.3不同组分最佳检测波长的选择与程序设置将各标准溶液进样后在全光谱范围内逐点光谱扫描,利用得到的3维图谱计算出5种添加剂的最大吸收波长分别为:AK228nm,糖精钠206nm,苯甲酸226nm,山梨酸254nm,APM206nm。利用DAD特点设定时间波长程序,使检测波长随时间的变化而变化,即在待测组分的出峰时间段,选用其最佳吸收作为检测波长,这样可避免单一波长分析带来的某些组分的灵敏度的下降。
具体程序见表1(考虑到甲醇的透过波长下限为210nm,我们选其为糖精钠及APM的检测波长)。
2.4检测灵敏度的比较在HPLC对多组分进行分析时,由于各待测组分的最大吸收波长不同,采用单一波长常选用对各组分均有吸收的平均波长。有文献[4,5]对这5种添加剂采用230nm或210nm波长检测。我们比较了用单一波长和多波长检测时同一组分的峰面积和比率(见表2),发现采用210nm作为检测波长,虽可保证糖精钠及APM的灵敏度,但AK、苯甲酸、山梨酸峰面积分别降为原来的81.0%、72.3%和22.3%,灵敏度下降非常明显;采用230nm虽可保证AK、苯甲酸的灵敏度,但APM峰面积仅为多波长检测的3.97%(见图3);采用254nm则根本无法检测出APM。可见为了同时检测这5种组分,又保证检测的灵敏度,最佳的方法是采用多波长检测。

2.5不同组分干扰的影响食品饮料中常含有各种人工合成色素,它们是否会造成干扰?我们在该色谱条件下,加入柠檬黄、苋菜红、日落黄、胭脂红、亮兰等5种人工合成色素进行检测,结果能检出柠檬黄、日落黄和胭脂红,出峰时间分别为1.685min、2.204min和3.044min,只有胭脂红有可能干扰到AK及糖精钠的测定。消除干扰的方法,利用DAD的光谱定性功能进行确认(胭脂红在508nm附近有吸收);在样品前处理时加入聚酰胺粉吸附除去色素。
2.6标准曲线和方法的最低检出浓度取不同浓度的混合标液,按上述条件操作,计算出回归方程和相关系数(表3)。按3倍仪器噪声计算出该方法的仪器检出限为:AK1.24Lg/ml,糖精钠0.84Lg/ml,苯甲酸0.40Lg/ml,山梨酸0.29Lg/ml,APM6.90Lg/ml。

2.7方法的准确性和精密度实验取饮料橙汁、碳酸饮料雪碧分别加入一定量的混合标准溶液,按上述方法进行样品加标回收试验和重复性试验,结果加标回收率91.3%~98.3%,RSD<2.5%,见表4。

3小结
采用HPLC多波长检测法同时检测食品饮料中的安赛蜜、甜味素、糖精钠、苯甲酸、山梨酸,可克服单一波长检测带来的灵敏度下降和干扰,保证方法既有较高的灵敏度、准确性,而且操作简便,8min内可同时完成对这5种添加剂的测定。