中财网神秘的湘西山洞:普通微生物学实验内容
来源：百度文库 编辑：中财网 时间：2024/05/06 11:17:54
实验一 . 显微镜的使用及细菌的简单染色
实验二 . 细菌的革兰氏染色
实验三 . 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别
实验四 . 酵母菌的数量测定
实验五 . 酵母菌的大小测定
实验六 . 微生物菌落的观察实验
实验七 . 霉菌的形态观察
实验八 . 培养基的制备与灭菌
实验九 . 放线菌的形态及菌落特征的观察
实验十 . 微生物的纯种分离培养
实验一. 普通光学显微镜的使用
一、目的要求
1.学习并掌握油镜的原理和使用方法。
2.复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。
二 . 显微镜的基本结构及油镜的工作原理
现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大 成像，故又常 被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。在显微镜的 光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普 通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研 究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之 间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因：
1.增加照明亮度
油镜的放大倍数可达 100 Χ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径 很小，但所需要的光照强度却最大。从承载标本的玻片透过来的光线，因介 质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射 ，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。 所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入 与玻璃的折射率（n=1.55 ）相仿的油镜（通常用香柏游，其折射率 n=1.52 ）。
2.增加显微镜的分辨率
显微镜的分辨率或分辨力 (resolution orresolving power) 是指显微 镜能辨别两点之间的最小距离的能力。从物理学角度看，光学显微镜的分辨 率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：（公式P16 ）式中λ = 光波波长； NA=物镜的数值孔径值。
光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（ 0.4--0.7 μ m ）， 而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示 为： NA=n × sin α
式中α为光线最大入射角的半数。它取决于物镜的直径和焦距，一 般来说在 实际应用中最大只能达到 120 O ，而 n 为介质折射率。由于香柏油的折射 率（ 1.52 ）比空气及水的折射率（分别为 1.0 和1.33 ）要高，因此以香 柏油作为镜头于玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径值（NA 一般在 1.2~1.4 ）要高于低倍镜、高倍镜等干镜（ NA都低于 1.0 ）。若以可见光 的平均波长 0.55 μ m 来计算，数值孔径通常在0.65 左右的高倍镜只能分 辨出距离不小于 0.4 μm 的物体，而油镜的分辨率却可达到 0.2 μ m 左 右。
三、器材
1.菌种：枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis ）染色玻片标本。青霉 （Penicillium sp. ）的水封片。
2.溶液或试剂：香柏油、乙醇：乙醚混合液
3.仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸等。
四 . 操作步骤
1.观察前的准备
（ 1 ） 显微镜的安置：置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约 3~4cm 。镜检时姿势要端正。
取放显微镜时应一手握住镜臂，一手托住底座，使显微镜保持直立、 平稳。切忌用单手拎提；且不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同 时睁开观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观察边绘图或记录。
（ 2 ） 光源调节：安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明 亮度，而使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源 的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或凸面反光镜并调节其角度， 使视野内的光线均匀，亮度适宜。
（ 3 ） 根据使用者的个人情况，调节双筒显微镜的目镜，双筒显微镜的目镜 间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有曲光度调节环，可以适应 眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。
（ 4 ） 聚光器数值孔径值的调节：调节聚光器虹彩光圈值与物镜的数值孔径 值相符或略低。有些显微镜的聚光器只标有最大数值孔径值，而没有 具体的光圈数刻度。使用这种显微镜时可在样品聚焦后取下一目镜， 从镜筒中一边看着视野，一边缩放光圈，调整光圈的边缘与物镜边缘 黑圈相切或略小于其边缘。因为各物镜的数值孔径值不同，所以每转 换一次物镜都应进行这种调节。
在聚光器的数值孔径值确定后，若需改变光照强 度，可通过升降聚光 器或改变光源的亮度来实现，原则上不应再通过虹彩光圈的调节。当然， 有关虹彩光圈、聚光器高度及照明光源强度的使用原则也不是固定不变的 ，只要能获得良好的观察效果，有时也可根据不同的具体情况灵活运用， 不一定拘泥不变。
2.显微观察
在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达 到的分辨率及 放大率都是不同的。一般情况下，特别是初学者，进行显微观察时应遵守从 低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现 目标及确定检查的位置。
（ 1 ） 低倍镜观察 金黄色葡萄球菌染色标本玻片置于载物台上，用标本夹 夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。下降 10 Χ物镜， 使其接近标本，用粗调节器慢慢升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦 ，再使用细调节器调节图象清晰。通过玻片夹推进器慢慢移动玻片， 认真观察标本各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到 的结果。
在任何时候使用粗调节器聚焦物像时，必需养成先从侧面注视小 心调节物镜靠近标本，然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本进行 准焦的习惯，以免因一时的误操作而损坏镜头及玻片。
（ 2 ） 高倍镜观察 低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后， 轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置。对聚光器光圈及视野亮 度进行适当调节后微调细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔 细观察并记录所观察到的结果。
在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换 器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态 ，这种现象称为物镜的同焦 (parfocal) 。利用这种同焦现象，可以 保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细 调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误 操作而损坏镜头或载玻片。
（ 3 ） 油镜观察 高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器 将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香 柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油 中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈，若所用聚 光器的数值孔径值超过 1.0 ，还应在聚光镜与载玻片之间也加滴香 柏油，保证其达到最大的效能。调节照明使视野亮度合适，用粗调节 器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦 为止。
有时按上述操作还找不到目的物，则可能是 由于油镜头下降还未 到位，或因油镜上升太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像。遇此 情况，应重新操作。另外应特别注意不要因在下降镜头时用力过猛， 或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片。
3.显微镜用毕后的处理
（ 1 ） 上升镜筒，取下载玻片。
（ 2 ） 用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶 于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留 的二甲苯。
（ 3 ） 用擦镜纸清洁其他物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。
（ 4 ） 将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下 旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。
五 . 实验报告
1.分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的金黄色葡萄球菌、枯草芽 孢杆菌、链霉菌及青霉的形态，包括在三种情况下视野中的变化。同时注 明物镜放大倍数和总放大率。
2.思考题
（ 1 ） 用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起 什么作用？
（ 2 ） 试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍 镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？
（ 3 ） 什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？
（ 4 ） 影响显微镜分辨率的因素有哪些？
（ 5 ） 根据你的实验体会，谈谈应如何根据所观察微生物的大小，选择不同 的物镜进行有效的观察。
实验二. 细菌的简单染色法
一、目的要求
1.学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色方法。
2.初步认识细菌的形态特征。
3.巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。
二、基本原理
虽然可以用相差显微镜等直接观察微生物的形态特征，但其应 用有局限性 ；用电子显微镜可以观察到微生物的各种形态结构，但因其价格昂贵、设备条 件要求高、操作也较复杂，应用上也受一定限制。所以，一般实验室仍常用普 通光学显微镜来进行微生物形态学特征的观察。然而，微生物（尤其是细菌） 细胞小而透明，当把菌悬液浮于水滴内，用光学显微镜观察时，由于菌体和背 景没有显著的明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易识别其结构，所以， 用不同光学显微镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，借助于颜色的反衬 作用，可以更清楚地观察到细菌的形状及某些细胞结构。因此，为了研究微生 物的形态特征和鉴别不同类群的微生物，微生物的染色及形态结构的观察是微 生物实验中十分重要的基本技术。
用于微生物染色的染料，是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化 合物。发色基团赋予化合物的颜色特征，助色基团则给予化合物能够成盐的性 质，仅含发色基团的苯化合物（称色原）即使带有颜色也不能作为染料，因为 它不能电离，不能与酸或碱形成盐，对微生物（或其他材料）没有结合力，很 容易被洗脱或机械方法除去。染料通常都是盐，分酸性染料和碱性染料两大类 。在微生物染色中，碱性染料较常用，如常用的美蓝（即亚甲蓝）、结晶紫、 碱性复红、番红（即沙黄）、孔雀绿等都属于碱性染料。
这部分实验着重于细菌的染色观察，同时也进行放线菌、酵母菌和丝状真 菌的形态学观察。其目的是使同学在掌握细菌染色观察技术的基础上，了解其 他微生物形态结构的观察方法；初步认识各类微生物的形态特征，巩固课堂知 识，增强感性认识。
简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便， 适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中， 细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电，荷 酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很 容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在 显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等 。
当细菌分解糖类产酸使培养基 pH 下降时，细菌所带正电荷增加，此时可 用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
三、器材
1.菌种 枯草芽孢杆菌 12~18h 营养琼脂斜面培养基，藤黄微球菌
（Micrococcus luteus ）约 24h 营养琼脂斜面培养物。
2.染色剂 吕氏碱性美蓝染液（或草酸铵结晶紫染液），齐氏石炭酸复红染 液。
3.仪器或其他用具 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏 油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水等。
四、操作步骤
1.涂片
取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环挑取 1~2 环）生理盐水（或蒸 馏水）于玻片中央、用接种环以无菌操作分别从枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌斜 面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液（或液体培养物） 涂片，可用接种环挑取2~3 环直接涂于载玻片上。
载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂均匀，不宜 过厚。
2.干燥
室温自然干燥或酒精灯干燥。
3.固定
涂面朝上，通过火焰 2-3 次。
此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之 牢固附着在载玻片上。
热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破 坏细胞形态。
4.染色
将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为 宜）。
吕氏碱性美蓝染色 1~2min ；石炭酸复红 ( 或草酸铵结晶紫 ) 染色约 1min 。
5.水洗
倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。
水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜过 急，以免涂片薄膜脱落。
6.干燥
自然干燥，或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。
7.镜检
涂片干后镜检。
涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。最后清理显微镜。
五、实验报告
1.结果
根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。
2.思考题
(1)你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？
(2)为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察 ?
(3)如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题 ? 如果加热温度过高、 时间太长，又会怎么样呢？
实验三. 革兰氏染色法
一、目的要求
1.学习并初步掌握革兰氏染色法。
2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、基本原理
革兰氏染色法是 1884 年由丹麦病理学家 Chrstain Gram 氏创立的，而 后一些学者在此基础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别 染色法。
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再 用碘液媒染 ，然后用乙醇 ( 或丙酮 ) 脱色， 最后用复染剂 ( 如番红) 复染。经此方法 染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被 脱色剂洗 脱而使细菌染上复染剂的颜色( 红色 ) ，该菌属于革兰氏阴性菌 。
革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞 壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样 ，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结 晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两 类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网 状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇( 或丙酮 ) 脱色时细胞壁脱水、 使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫一碘的复合物不易 被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性 菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类 脂质被乙醇 ( 或丙酮 ) 溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫一碘的复合物比较 容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。革兰氏染色反 应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是 十分必要的。本实验将介绍被普遍采用的Hucker 氏改良的革兰氏染色法。
三、器材
1.菌种 ：大肠杆菌约 24h 营养琼脂斜面培养物，枯草芽孢杆菌 24h 营养 琼脂斜面培养物，
2.染色剂 ：革兰氏染色液。
3.仪器或其他用具：同实验一
四、操作步骤
1.制片
取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。要用活跃生长期的幼培养物作革兰 氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热 （以玻片不烫手为宜） 。
2.初染
滴加结晶紫 ( 以刚好将菌膜覆盖为宜 ) 染色1-2min ，水洗。
3.媒染
用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约 1min ，水洗
4.脱色
用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95 ％的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。
革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色 不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时 间一般约20-30s 。
5.复染
用番红液复染约 2min ，水洗。
6.镜检
干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色 的为革兰氏阴性菌。
7.混合涂片染色
按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或大肠杆菌和 枯草 芽孢作混合涂片、染色、镜检进行比较。
五、实验报告
1.结果
列表简述 3 株细菌的染色观察结果 ( 说明各菌的形状、颜色和革兰氏染 色反应 ) 。
2.思考题
（ 1 ） 你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性 ? 其中最关键的环 节是什么 ?
（ 2 ） 现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏 染色反应。你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色 ，以证明你的染色结果正确性。
（ 3 ） 你的染色结果是否正确 ? 如果不正确，清说明原因。
（ 4 ） 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色 会出现什么问题 ?
（ 5 ） 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗 ? 乙醇脱色后复染之前，苹兰氏 阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？
（ 6 ） 你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果 ? 在 什么情况下可以采用？
实验三 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别
一、目的要求
1.观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法
2.掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。
二、基本原理
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌 大几倍甚至 十几倍。大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通 过接合产生子囊孢子。本实验通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵 母的形态和出芽生殖方式。美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还 原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细 胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此 ，具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞 则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。
三、器材
1.菌种 ： 酿酒酵母 (Saccharomycescerevisisiae) 培养约 2d 的麦芽汁 (或 YEPD ) 斜面培养物。
2.溶液或试剂 ： 0.05 ％和 0.1 ％吕氏碱性美蓝染色液，革兰氏染色用碘 液。
3.仪器或其他用具 ： 显微镜，载玻片，盖玻片等。
四、操作步骤
1.美蓝浸片的观察
(1)在载玻片中央加一滴 0.1 ％吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用 接种环挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均匀。染液不宜过多或过少，否 则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。
(2)用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使 其盖在菌液上。盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。
(3)将制片放置约 3min 后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态 和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。
(4)染色约 0.5h 后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加。
(5)用 0.05 ％吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。
2.水一碘液浸片的观察
在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加 3 小滴水，取 少许酵母菌苔放在水一碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。
五、实验报告
1.结果
绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征。
2.思考题
(1)吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何 影响？试分析其原因。
(2)在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？
实验四. 酵母菌的数量测定
一、目的要求
1． 明确血细胞计数板计数的原理。
2． 掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。
二、基本原理
单细胞微生物个体生长时间较短，很快进入分裂繁殖阶段，因此，个体生 长难以测定，除非特殊目的，否则单个微生物细胞生长测定实际意义不大。 微生物的生长与繁殖（个体数目增加）是交替进行的，它们的生长一般不是依 据细胞的大小，而是以繁殖，即群体的生长作为微生物生长的指标。
群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。测定细胞数目的方 法有显微镜直接计数法（direct microscopic count ）、平板菌落计数法（ plate count ）、光电比浊法（turbidity estimation by spectrophotometer ）、最大或然数法（ most probable number MPN ）以及 膜过滤法（ membrane filtration ）等。测定细胞物质的方法有细胞干重的 测定，细胞某种成分如氮的含量。 RNA 和DNA 的含量测定，代谢产物的测定 等。总之，测定微生物生长量的方法很多，各有优缺点，工作中应根据具体要 求加以选择。
本实验主要介绍生产、科研工作中比较常用的显微镜直接计数法、平板菌 落计数法和光电比浊计数法。
显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面 积和容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接计数的一种简便、快速 、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff- Hauser 计数器以及Hawksley 计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢 子等悬液的计数，基本原理相同。后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为 0.02mm3 ，而且盖玻片和载玻片之间的距离只有0.02mm ，因此可用油浸物镜 对细菌等较小的细胞进行观察和计数。除了用这些计菌器外，还有在显微镜下 直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查 。显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。但此法的缺点是所测得 的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点， 如结合活菌染色，微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只 计数活菌体的目的。本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。另外两种 计菌器的使用方法可参看各厂商的说明书。
用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计 数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被 一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九 个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度一般有两种规格，一种是 一个大方格分成 25 个中方格，而每个中方格又分成 16 个小方格；另一种是 一个大方格分成 16 个中方格，而每个中方格又分成 25 个小方格，但无论是 哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400 个。每一个大方格 边长为 1mm ，则每一个大方格的面积为 1mm3 ，盖上盖玻片后，盖玻片与载 玻片之间的高度为0.1mm ，所以计数室的容积为 0.1mm3 （万分之一毫升）
计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再 乘上 25 或 16 ，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成 1ml 菌液中 的总菌数。
设五个中方格中的总菌数为 A ，菌液稀释倍数为 B ，如果 25 个中方格 的计数板，则：
1ml菌液中总菌数 =A/5 × 25 × 104 × B=50000A · B （个）
同理，如果是 16 个中方格的计数板，
1ml菌液中总菌数 =A/5 × 16 × 104 × B=32000A · B （个）
三、器材
1． 菌种：酿酒酵母。
2． 仪器或其他用具：血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管。
四、操作步骤
1．菌悬液制备
以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。
2．镜检计数室
在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹 干后才能进行计数。
3．加样品
将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀 的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透 作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。
取样时先摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。
4．显微镜计数
加样后静止 5min ，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用 低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。
调节显微镜光线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光 线不要偏向一边，否则视野中不易看清楚计数室方格线，或只见竖线或只见 横线。
在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般 榈稀释度要求每小格内约有5~10 个菌体为宜。每个计数室选 5 个中格（可 选 4 个角和中央的一个中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只 数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作 为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样 品的含菌量。
5．清洗血细胞计数板
使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头上用水冲洗干净，切勿用硬物洗 刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体 或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。
五、实验报告
1．结果
将结果记录于下表中。 A 表示五个中方格中的总菌数； B 表示菌液稀释倍数。
各中格中菌数
A
B
二室平均值
菌数 /ml
1
2
3
4
5
第一室
第二室
2． 思考题
（ 1 ）根据你的体会，说明用血细胞计数的误差主要来自哪些方面？应如何 尽量减少误差、力求准确？
（ 2 ）某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计 1~2 种可行的 检测方法。
实验五. 酵母菌的大小测定
一、目的要求
1.学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。
2.增强微生物细胞大小的感性认识。
二、基本原理
微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的 依据之一。 微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具——测微尺，包 括目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺（图 Ⅳ -9 ， A ）是中央部分刻有 精确等分线的载玻片，一般是将 1mm 等分为 100 格，每格长 0.01mm （即10 μ m ）。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微 尺每格调相对长度。目镜测微尺（是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其 中央有精确的等分刻度，有等分为50 小格和 100 小格两种。测量时，需将 其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同显 微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际 长度也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺 进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小 格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计 算出细胞的实际大小。球菌用直径来表示其大小；杆菌则用宽和长的范围来表 示，如酿酒酵母直径约为4.5 μ m ，枯草芽孢杆菌大小为 0.7-0.8 × 2-3 μ m 。
三、器材
1.菌种：藤黄微球菌和大肠杆菌的染色标本片，酿酒酵母 24h 马铃薯斜面 培养物。
2.仪器或其他用具 ： 目镜测微尺，镜台测微尺，载玻片，盖玻片，显微镜 等。
四、操作步骤
1.装目镜测微尺
取出接目镜，把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒 内的隔板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内
2.校正目镜测微尺
(1)放镜台微尺：将镜台测微尺刻度面朝—上放在显微镜载物台上。
(2)校正：先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调 节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺的刻度 与镜台测微尺的刻度平行。利用移动器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域 内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台微尺和目镜微尺所占的格 数。
用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出在高倍镜和油镜下， 两重合线之间两尺分别所占的格数。
观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台微尺的刻度；换高倍镜和油镜校 正时，务必十分细心，防止接物镜压坏镜台微尺和损坏镜头。
(3)计算：由于已知镜台测微尺每格长 10 μ m ，根据下列公式即可分别计 算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。
公式 P47
3.菌体大小测定
目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上细菌染色制 片。先用低倍 镜和高倍镜找到标本后，换油镜测定藤黄微球菌的直径和大肠杆菌的宽度和 长度。测定时，通过转动目镜微尺和移动载玻片，测出细菌直径或宽和长所 占目镜测微尺的格数。最后将所测得的格数乘以目镜测微尺( 用油镜时 ) 每格所代表的长度，即为该菌的实际大小。
通常测定对数生长期菌体来代表该菌的大小；可选择有代表性的3~5 个 细胞进行测定；细菌的大小需用油镜测定，以减少误差。
4.测定完毕，取出目镜测微尺，将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台 测微尺分别用擦镜纸擦拭干净，放回盒内保存。
五、实验报告
1.结果
（ 1 ） 将目镜测微尺校正结果填入下表： P48 表
（ 2 ） 将各菌测定结果填入下表： P48 表
2.思考题
（ 1 ） 为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对 目镜测微尺进行校正？
（ 2 ） 在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一 细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？
实验六. 微生物菌落与培养特征的观察实验
一、目的要求
1.了解不同的微生物在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征。
2.进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术。
二、基本原理
微生物的培养特征是指微生物在固体培养基上、半固体和液体 培养基中生 长后所表现出的群体形态特征。不同的微生物有其固有的培养特征，这些特征 一般用固体、半固体和液体培养基来进行检测。固体培养基又分平板与斜面两 种形式。在平板上主要观察菌落表面结构、形态及边缘等状况；它们培养在斜 面培养基上，可以呈丝线状、刺毛状、念珠状、疏展状、树枝状或假根状；生 长在液体培养基内，可以呈混浊、絮状、粘液状、形成菌膜、上层清晰而底部 显沉淀状；穿刺培养在半固体培养基中，可以沿接种线向四周蔓延或仅沿线生 长；也可上层生长很好，甚至连成一片，底部很少生长或底中长得好，上层甚 至不生长。微生物培养特征还包括菌苔的颜色、表面光滑程度、基质是否产生 水溶性色素等。培养特征可以作为微生物分类鉴定的指征之一，并能为识别纯 培养是否被污染作为参考。检测微生物的培养特征时，接种和培养过程中必须 保证不被其他微生物所污染，因此，除工作环境要求尽可能地避免或减少杂菌 污染外，熟练地掌握各种无菌操作接种技术是很重要的。微生物菌落形态已分 别在实验一和实验二十四中观察过，因此本实验采用斜面、半固体和液体培养 基检测不同微生物的培养特征。图 Ⅶ -8
三、器材
1. 菌种 枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球，白地霉( Geotrichum candidum ), 蕈状芽孢杆菌（ Bacillusmycoides ），粘质沙雷氏菌 ( Serratia marcescens ) 。
2. 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基 ( 斜面、液体、半固体 ) 。
3. 仪器或其他用具 接种环，接种针，无菌吸管，酒精灯等。
四、操作步骤
1. 斜面接种
（ 1 ） 在肉膏蛋白胨斜面试管上用记号笔标明待接种的菌种名称、株号、日 期和接种者。
（ 2 ） 点燃酒精灯或煤气灯。
（ 3 ） 将菌种试管和待接种的斜面试管，用大拇指和食指、中指、无名指握 在左手中，试管底部放在手掌内并将中指夹在两试管之间，使斜面向上成水 平状态，在火焰边用右手松动试管塞以利于接种时拔出。
（ 4 ） 右手拿接种环通过火焰烧灼灭菌 ( 参照实验一) ，在火焰边用右手 的手掌边缘和小指，小指和无名指分别夹持棉塞 ( 或试管帽 ) 将其取出， 并迅速烧灼管口。 取试管棉塞或试管帽时要缓慢拔出，不宜用力过猛。
（ 5 ） 将灭菌的接种环伸入菌种试管内，先将环接触试管内壁或未长菌的 培养基，使接种环的温度下降达到冷却的目的，然后再挑取少许菌苔。将接 种环退出菌种试管，迅速伸入待接种的斜面试管，用环在斜面上自试管底部 向上端轻轻地划一直线。 所划直线尽可能的直，切莫划几条线或蛇形，不要 将培养基划破，也不要使接种环接触壁或管口。
（ 6 ） 接种环退出斜面试管，再用火焰烧灼管口，并在火焰边将试管塞上。 将接种环逐渐接近火焰再烧灼，如果接种环上沾的菌体较多时，应先将环在 火焰边烤干，然后烧灼，以免未烧死的菌种飞溅出污染环境，接种病原菌时 更要注意此点。
2. 液体培养基接种
向肉膏蛋白胨液体培养基中接种少量菌体时，其操作步骤基本与斜面接种 法相同，不同之处是挑取菌苔的接种环放入液体培养基试管后，应在液体表 面处的管内壁上轻轻磨擦，使菌体分散从环上脱开，进入液体培养基，塞好 试管塞后摇动试管，使菌体在培养液中分布均匀，或如图 Ⅶ -10 所示用试 管振荡器混匀。若向液体培养基中接种量大或要求定量接种时，可先将无菌 水或液体培养基加入菌种试管，用接种环将菌苔刮下制成菌悬液( 刮菌苔时 要逐步从上向下将菌苔洗下，用手或振蔼器振匀。 ) ，再将菌悬液用塞有过 滤棉花的无菌吸管定量吸出后加入，或直接倒入液体培养基。如果菌种为液 体培养物，则可用无菌吸管定量吸出后加入或直接倒入液体培养基。整个接 种过程都要求无菌操作。
3. 穿刺接种
用接种针下端挑取菌种 ( 针必须挺直 ) ，自半固体培养基的中心垂直刺 入半固体培养中，直至接近试管底部，但不要穿透，然后沿原穿刺线将针退 出，塞上试管塞烧灼接种针。 上述几种接种方法的无菌操作，凡未叙述的均 按实验一操作。实验者应反复练习无菌接种技术，直至较熟练地掌握。
4. 将已接种的斜面，半固体和液体培养基放置28 ～ 30 ℃ 温室培养 2-3d 后取出观察结果。
五、实验报告
1. 结果
详细描述实验中各种微生物在斜面上、半固体和液体培养基中的培养特征。
2. 思考题
(1) 一个好氧的具周生鞭毛的菌株分别在半固体和液体培养基中的培养特 征是怎样的 ?
(2) 用斜面检测微生物的培养特征接种时，为什么不要划多条线或蛇形， 而只要划—条直线 ?
(3) 接种环 ( 针 ) 接种前后灼烧的目的是什么 ? 为什么在接种前一定要 将其冷却 ? 如何判断灼烧过的接种环已冷却 ?
实验七 霉菌的形态观察
一、目的要求
1. 学习并掌握观察霉菌形态的基本方法。
2. 了解四类常见霉菌的基本形态特征。
二、基本原理
霉菌可产生复什分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及 孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约 3~10 μ m ），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。观察霉菌的形态有多种方法，常用的有下列三种：直接制片观察法：是将培养物置于乳酸石 炭酸棉蓝染色液中，制成霉菌制片镜检。用此染液制成的霉菌制片的特点是：细胞不变形；具有防腐作用，不易干燥，能保持较长时间；能防止孢子飞散；染液的蓝 色能增强反差。必要时，还可用树胶封固，制成永久标本长期保存。载玻片培养观察法：用无菌操作将培养基琼脂薄层置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌 即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置于显微镜下观察。这种方法既可以保持霉菌自然生长状态，还便 于观察不同发育期的培养物。玻璃培养观察法：霉菌的玻璃纸培养观察方法与放线菌的玻璃纸培养观察方法相似 ( 见实验十二 ) 。这种方法用于观察不同生长阶段霉菌的形态，也可获得良好的效果。
三、器材
1. 菌种 ：黑 曲霉 ( Aspergillus sp . ) ， 青霉 ， 黑根霉 ( Rhizopus sp . ) 和毛霉（ Mucor sp. ）培养 2-5d 的马铃薯琼脂平板培养物。
2. 培养基 ： 土豆琼脂或察氏琼脂。
3. 溶液或试剂 ： 乳酸石炭酸棉蓝染色液。
4. 仪器或其他用具 ： 无菌吸管，平皿，载玻片，盖玻片，解剖针，解剖 刀，镊子， 50% 乙醇， 20% 的甘油以及显微镜等。
四、操作步骤
1. 直接制片观察法
在载玻片上加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落边缘处挑取少量已产孢子的霉菌菌丝；先置于 50 ％乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的染液中，用解剖针小心地将菌丝分散开。盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜观察。
挑菌和制片时要细心，尽可能保持霉菌自然生长状态；加盖玻片时勿压入气泡，以免影响观察。
2. 载玻片培养观察法
（ 1 ） 培养小室的灭菌 ： 在平皿皿底铺一张略小于皿底的圆滤纸片，再放一 U 形玻棒，其上放一洁净载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖、包扎后于 121 ℃灭菌 30min ，烘干备用。
（ 2 ） 琼脂块的制作 ： 取已灭菌的马铃薯琼脂 ( 或察氏琼脂 ) 培养基 6~7ml 注入另一灭菌平皿中，使之凝固成薄层。用解剖刀切成 0.5~1cm 2 的琼脂块，并将其移至上述培养室中的载玻片上（每片放两块 ) 。制作过程应注意无菌操作。
（ 3 ） 接种 ： 用尖细的接种针挑取很少量的孢子接种于琼脂块的边缘上，用无菌
镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上。
接种量要少，尽可能将分散的孢子接种在琼脂块边缘上，否则培养后菌丝过于稠密影响观察。
（ 4 ） 培养 ： 先在平皿的滤纸上加 3 ～ 5ml 灭菌的 20 ％甘油（用于保持平皿内的湿度 ) ，盖上皿盖， 28 ℃培养。
（ 5 ） 镜检 ： 根据需要可以在不同的培养时间内取出载玻片置低倍镜下观察，必要时换高倍镜。
五、实验报告
1. 结果
绘图说明四种霉菌的形态特征。
2. 思考题
（ 1 ） 你主要根据哪些形态特征来区分上述四种霉菌？
（ 2 ） 根据载玻片培养观察方法的基本原理，你认为上述操作过程中的哪 些步骤可以根据具体情况作一些改进或可用其他的替代方法？
（ 3 ） 你认为在显微镜下，细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的主要区别是什 么？
实验八 培养基的制备与灭菌
第一部分：培养基的制备
培养基是入工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种类繁多，营 养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。不同 微生物对 pH 要求不一样，霉菌和酵母的培养基的 pH 一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的 pH 一般为中性或微碱性的 ( 嗜碱细菌和嗜酸细菌例外 ) 。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的 pH 调到合适的范围。此外，由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止 其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基的类别如下：
一、 按成分的不同
1. 天然培养基
主要成分是复杂的天然有机物质，如马铃薯、玉米粉、豆饼粉、豆芽汁，牛肉膏，蛋白胨、血清等。这些复杂天然有机物质的成分不完全了解，每次所用的原料，其 中各成分的数量也不恒定。这类培养基是实验室和发酵工厂常用的培养基，例如：牛肉膏蛋白胨培养基，马铃薯培养基，玉米粉、黄豆粉培养基、血琼脂培养基等。
2. 合成培养基
用化学成分完全了解的纯化合物药品配制而成的培养基，因此也称化学成分明确的培养基（ chemically defined medium ），如高氏 I 号培养基、查氏培养基、 M9 培养基等。一般用于研究微生物的形态，营养代谢、分类鉴定、菌种选育、遗传分析等。
3. 半合成培养基
在以天然有机物作为微生物营养来源的同时，适当补充一些成分已知的化学药品所配制的培养基叫半合成培养基。大多数微生物都能在此种培养基上生长，应用广泛。例如常用的马铃薯葡萄糖培养基，很多霉菌都生长良好。
二、按培养基的物理状态分
1. 固体培养基
在液体培养基中加入凝固剂即为固体培养基。实验用的凝固剂有琼脂、琼脂糖、明胶和硅胶，后者用于配制自养微生物的固体培养基。对其他多数微生物来讲，以琼 脂最为合适，一般加入 1.5%~2.5% 即可凝固成固体。此培养基可供微生物的分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏等用。
2. 半固体培养基
在液体培养基中加入少量凝固剂即可为半固体培养基。例如用琼脂作凝固剂时只需加入 0.2%~0.7% 。此种培养基常用来观察细菌运动的特征、菌种保存和噬菌体的分离纯化及制备等。
3. 液体培养基
不含任何凝固剂，配好后成液体状态的培养基。广泛用于微生物的培养，生理代谢和遗传学的研究以及工业发酵等。
三、按培养基的用途分
1. 基础培养基
含有一般细菌生长繁殖需要的基本的营养物质。最常用的基础培养基是天然培养基中的牛肉膏蛋白胨培养基。这种培养基可作为一些特殊培养基的基础成分。
2. 营养培养基（加富培养基）
在基础培养基中加入某些特殊营养物质，如血液、血清、动物（或植物）组织液，酵母浸膏或生长因子等。用以培养对营养要求苛刻的微生物，如培养百日咳杆菌需要含有血液的培养基。
3. 鉴别培养基
是一类含有某种特定化合物或试剂的培养基。某种微生物在这种培养基上培养后，它所产生的某种代谢产物与这种特定的化合物或试剂能发生某种明显的特征性反 应，根据这一特征性反应可以将某种微生物与他种微生物区别开来。主要用于不同微生物的生理生化鉴定。如用来检查细菌能否利用不同糖类产酸产气的糖发酵培养 基和能否产生硫化氢的醋酸铅培养基等。
4. 选择培养基
利用微生物对某种或某些化学物质的敏感性不同，在培养基中加入这类物质，抑制不需要的微生物生长，而利用所需分离的微生物生长，从而达到分离或鉴别某种微 生物的目的。如分离真菌的马丁氏（ Martin ）培养基和既有选择作用又有鉴别作用的远藤氏（ Endo ）培养基等。微生物遗传学研究中用来选择营养缺陷型的培养基以及分子克隆技术中常用的加抗生素 X-gal(5- 溴 -4- 氧 -3- 吲哚 - β -D- 半乳糖苷 ) 的培养基等均属于选择培养基。目前已有各种商品化的“干燥培养基”成品出售。这种培养基是将新鲜配制的液体培养基用喷雾干燥法、真空干燥法、低温干燥法或 蒸发干燥法等将培养基内所含的水分去掉；或将培养基内的各种固形成分，经适当处理、充分混匀，便成干燥粉末而成。使用时只要按比例加入一定量的水，经溶 解、分装，高压蒸气灭菌，即可使用。这种培养基的优点是配制省时，携带方便，使用简易，质量稳定。
第二部分：牛肉膏蛋白胨培养基的制备
一、目的要求
1. 明确培养基的配制原理。
2. 通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。
二、基本原理
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质， 所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和 NaCl 。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而 NaCl 提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下 96 0 C 时溶化，实际应用时，一般在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在 40 ℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将 其 pH 凋至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。
牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：
牛肉膏 3.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
水 1000ml ， pH 7.4-7.6
三、器材
1. 溶液或试剂 ? 牛肉膏，蛋白胨， NaCl ，琼脂， 1 mol ／ LNaOH ， 1mol ／ L HCl 。
2. 仪器或其他用具：试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅， pH 试纸 (pH 5.5-9.0) ，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。
四、操作步骤
1. 称量
按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、 NaCl 放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。
蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。
2. 溶化
在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解 ( 图Ⅴ -1) 。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在制备用三角瓶盛 固体培养基时，一般可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按 1.5%-2.0% 的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间。在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。 同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。
3. 调 pH
在未调 pH 前，先用精密试纸测量培养基的原始 pH ，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入 1 mol ／ L NaOH ，边加边搅拌，并随时用 pH 试纸测其 pH ，直至 pH 达 7.6 。反之，用 1 mol ／ L HCl 进行调节。对于有些要求 pH 较精确的微生物，其 pH 的调节可用酸度计进行（使用方法、可参考有关说明书）。
pH 不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。配制 pH 低的琼脂培养基时，若预先调好 pH 并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性 pH 条件下灭菌，再调整 pH 。
4. 过滤
趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利用某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验勿需过滤）。
5. 分装
按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。
（ 1 ） 液体分装分装高度以试管高度的 1/4 左右为宜。分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角烧瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭 菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。
（ 2 ） 固体分装分装试管，其装量不超过管高 1/5 ，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一般为宜。
（ 3 ） 半固体分装试管一般以试管高度 1/3 为宜，灭菌后垂直待凝。分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。
6. 加塞
培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等），以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能（棉塞制作方法附本实验后面）。
7. 包扎
加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。 三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。（有条件的实验室，可用市售的铝箔代 替牛皮纸，省去用绳扎，而且效果好。 )
8. 灭菌
将上述培养基以 0.103 MPa ， 121 0 C ， 20min 高压蒸气灭菌。
9. 搁置斜面
将灭菌的试管培养基冷至 50 ℃左右 ( 以防斜面上冷凝水太多 ) ，将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜
10. 无菌检查
将灭菌培养基放入 37 ℃的温室中培养 24-28h ，以检查灭菌是否彻底
附：棉塞的制作
棉塞的作用有二：一是防止杂菌污染，二是保证通气良好。因此棉塞质量的优劣对实验的结果有很大的影响。正确的棉塞要求形状，大小，松紧与试管口 ( 或三角烧瓶口 ) 完全适合，过紧则防碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的。加塞时，应使棉塞长度的 1/3 在试管口外， 2/3 在试管口内。如图 V-4 所示。做棉塞的棉花要选纤维较长的，一般不用脱脂棉做棉塞。因为它容易吸水变湿，造成污染，而且价格也贵。做棉塞过程如图 V-5 。图 V-5
此外，在微生物实验和科研中，往往要用到通气塞。所谓通气塞，就是几层纱布（一般 8 层）相互重叠而成，或是在两层纱布间均匀铺一层棉花而成。这种通气塞通常加在装有液体培养基的三角瓶口上。经接种后，放在摇床上进行振荡培养，以获得良好 的通气促使菌体的生长或发酵，通气塞的形状如图 V-6 。图 V-6
五、实验报告
思考题
1. 培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的
2. 在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？
第三部分： 消毒与灭菌
消毒 (disinfection) 与灭菌 (sterilization) 两者的意义有所不同。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体而言，灭菌则是指杀灭一切微生物的营养体，芽孢和孢子。在微生物实验中，需要进行纯培 养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品 等方法。
一、加热法
又分干热灭菌和湿热灭菌两类。
1. 干热灭菌
有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种，接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时的试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌 ( 见图 IV-1) 。涂布平板用的玻棒也可在醮有乙醇后进行灼烧灭菌。通常所说的于热灭菌是在电烤箱内利用高温干燥空气（ 160 ℃ ~170 ℃ ) 进行灭菌，此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。培养基、橡胶制品、塑料制品不能用干热灭菌。
2. 湿热灭菌
（ 1 ） 高压蒸气灭菌法 此法是将物品放在密闭的高压蒸气灭菌锅内 0.l MPa ， 121 ℃保持 15~30min 进行灭菌。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭菌为准。这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭菌，也可用于玻璃器 皿的灭菌。
（ 2 ） 常压蒸气灭菌法 在不具备高压蒸气灭菌的情况下，常压蒸气灭菌是一种常用的灭菌方法。对于不易用高压蒸气灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用常压蒸 气灭菌。这种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸气灭菌器进行灭菌，也可用普通蒸笼进行灭菌。由于常压，其温度不超过 100 0 C ，仅能使大多数微生物被杀死，而芽孢细菌却不能在短时间内杀死，因此可用间歇灭菌以杀死芽孢细菌，达到彻底灭菌的目的。
常压间歇灭菌是将灭菌培养基放入灭菌器内，每天加热 100 ℃， 30min ，连续 3d ，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养物取出放室温下 18 ～ 24h ，使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加热 100 ℃， 30 min ，发育的营养体又被杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。
（ 3 ） 煮沸消毒法 注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般微生物学实验室中煮沸消毒时间为 10 ～ 15 min ，可以杀死细菌所有营养细胞和部分芽孢。如延长煮沸时间，并在水中加入 1% 碳酸氢钠或 2 ％～ 5 ％石炭酸，效果更好。入用注射器和手术器械均采用高压蒸气灭菌或干热灭菌，或采用一次性无菌用品。
（ 4 ） 超高温杀菌 超高温杀菌 (ultra high temperature sterilization, 简称 UHTS) 是指在温度和时间标准分别为 135-150 0 C 和 2 - 8s 的条件下对牛乳或其他液态食品 ( 如果汁及果汁饮料、豆乳、茶、酒及矿泉水等 ) 进行处理的一种工艺，其最大优点是既能杀死产品中的微生物，又能较好地保持食品品质与营养价值。超高温杀菌工艺的应用，使乳制品及各种饮料等无需冷藏的理 想变成了现实。从而打破了地域和季节的限制。
超高温杀菌的基本原理是建立在食品品质及营养成分等，不遭受热力破坏的温度与微生物受热死亡的温度两者之间差异很大这一规律之上的。从图Ⅵ -1 可以看出，在温度上升不到 135 ℃时，杀菌效应和牛乳褐变效应速率之比未发生显著改变，但在 135 ℃以上，该比率发生很大变化，例如在 140 0 C 时，杀菌效应比褐变效应速率增长 2000 倍，在 150 0 C 时增长到 5000 倍，因此利用这样一个显著的差异进行超高温瞬时灭菌，就可实现既不破坏营养成分又能达到灭菌的目的。
超高温杀菌是自 80 年代以来已在世界各国广泛应用。我国自改革开放以来，超高温杀菌也广泛用于橘子汁，猕猴桃汁、荔枝汁、菊花茶、牛乳等生产。
二、过滤除菌
许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热消毒灭菌方法，均会被热破坏，因此采用过滤除菌的方法。应用最广泛的过滤器有： (1) 蔡氏 (Seitz) 过滤器，该滤器是由石棉制成的圆形滤板和一个特制的金属 ( 银或铝 ) 漏斗组成，分上、下两节，过滤时，用螺旋把石棉板紧紧夹在上、下两节滤器之间，然后将溶液置于滤器中抽滤。每次过滤必须用一张新滤板。根据其孔径大小滤板 分为三种型号： K 型最大，作一般澄清用； EK 滤孔较小，用来除去一般细菌； EK-S 滤孔最小，可阻止大病毒通过，使用时可根据需要选用。蔡氏过滤器的结构如图Ⅵ -2 。 (2) 微孔滤膜过滤器，这是一种新型滤器，其滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤维酯的混合物制成的薄膜。孔径分 0.025 ， 0.05 ， 0.10 ， 0.20 ， 0.22 ， 0.30 ， 0.45 ， 0.60 ， 0.65 ， 0.80 ， 1.00 ， 2.00 ， 3.00 ， 5.00 ， 7.00 ， 8.00 和 10.00 μ m 。过滤时，液体和小分子物质通过，细菌则被截留在滤膜上。实验室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般为 0.22 μ m ，但若要将病毒除掉，则需更小孔径的微孔滤膜。微孔滤膜不仅可以用于除菌，还可用来测定液体或气体中的微生物。如水的微生物检查。过滤除菌法应用十分广 泛，除实验室用于某些溶液，试剂的除菌外，在微生物工业上所用的大量无菌空气以及微生物工作使用的净化工作台，都是根据过滤除菌的原理设计的。
三、辐射灭菌
紫外线波长在 200~300nm ，具有杀菌作用，其中以 265~266nm 杀菌力最强。此波长的紫外线易被细胞中核酸吸收，造成细胞损伤而杀菌，紫外线灭菌在微生物工作及生产实践中应用较广，无菌室或无菌接种箱空气可用紫外线灯 照射灭菌。此外，采用 60 Co- γ射线灭菌。也已广泛用于不能进行加热灭菌的纸、塑料薄膜，各种积层材料制作的容器以及医用生物敷料皮等的灭菌。γ射线灭菌的最大优点是：穿透力强，可在 厚包装完好条件下灭菌。
四、化学药品灭菌
化学药品消毒灭菌法是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂，如重金屑离子等，只是阻 抑细菌代谢机能，使细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂，如磺胺类及大多数抗生素等。化学药品对微生物的作用是抑菌还是杀菌以及作用效果还与化学药品浓度的高 低，处理微生物的时间长短，微生物的种类以及微生物所处的环境等有关。
微生物实验室中常用的化学药品有 2 ％煤酚皂溶液 ( 来苏尔 ) ， 0.25 ％新洁尔灭， 0.1 ％升汞， 3%~5 ％的平醛溶液， 75 ％乙醇溶液等。常用化学杀菌剂的应用范围和浓度见表Ⅵ -1 。表Ⅵ -1
消毒与灭菌不仅是从事微生物学和整个生命科学研究必不可少的重要环节和实用技术，而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物制品等各方面均具有重要的应用价 值。根据不同的使用要求和条件选用合适的消毒灭菌的方法。本部分实验主要介绍几种常用的方法，包括干热灭菌法，高压蒸气灭菌法，紫外线照射法，微孔滤膜 法。关于常用的化学灭菌法，主要涉及药物的种类和使用浓度，对微生物生长的抑制和灭活作用。
第四部分： 高压蒸气灭菌
一、目的要求
1. 了解高压蒸气灭菌的基本原理及应用范围。
2. 学习高压蒸气灭菌的操作方法。
二、基本原理
高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽， 然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于 100 ℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低 ( 表 VI-2) ，二是湿热的穿透力比干热大 ( 表 VI-3) ，三是湿热的蒸气有潜热存在。 1g 水在 100 ℃时，由气态变为液态时可放出 2.26kJ （千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下， 含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见 ( 表 VI-4) 。表 VI-2 、 VI-3 、 VI-4
—般培养基用 0.1MPa( 相当于 15Ib ／ in 2 或 1.05kg ／ cm 2 ) ， 121.5 ℃， 15-30min 可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用 0.06MPa (8 Ib ／ in 2 或 0.59 kg ／ cm 2 )112.6 ℃灭菌 15min ，但为了保证效果，可将其他成分先行 121.3 ℃， 20min 灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以 0.1MPa ， 121 . 5 ℃灭菌 20min 即可，而盛于大瓶内的培养基最好以 0.1 MPa ， 122 ℃灭菌 30 min 。
实验中常用的非自控高压蒸气灭菌锅有卧式 ( 图Ⅵ -4 ， A) 和手提式 ( 图Ⅵ -4 ， B) 二种。其结构和工作原理相同，本实验以手提式高压蒸气灭菌锅为例，介绍其使用方法。有关自控高压蒸气灭菌锅 (autoclave) 的使用可参照厂家说明书。图Ⅵ -4 ， A 、图Ⅵ -4 ， B
三、器材
牛肉膏蛋白胨培养基，培养皿（ 6 套一包），手提式高压蒸气灭菌锅等。
四、操作步骤
1. 首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。
切勿忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。
2. 放回内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
3. 加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧—致，勿使漏气。
4. 用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。当锅内压力 升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用 0.1 MPa ， 121.5 ℃ ， 20 min 灭菌。灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。
5. 灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“ 0 ” 时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。
压力一定要降到“ 0 ”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。
6. 将取出的灭菌培养基放入 37 ℃ 温箱培养 24h ，经检查若无杂菌生长，即可待用。
五、实验报告
1. 结果
检查培养基灭菌是否彻底。
2. 思考题
(1) 高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为 什么待压力降低“ 0 ” 时才能打开排气阀，开盖取物 ?
(2) 在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素 ?
(3) 灭菌在微生物实验操作中有何重要意义？
(4) 黑曲霉的孢子与芽孢杆菌的胞子对热的抗性哪个最强 ? 为什么 ?
实验九 放线菌形态的观察
一、目的要求
1. 学习并掌握观察放线菌形态的基本方法。
2. 初步了解放线菌的形态特征。
二、基本原理
放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝 ( 简称“基丝” ) ，基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝 ( 简称“气丝” ) ，并进一步分化产生孢子丝及孢子。有的放线菌只产生基丝而无气丝。在显微镜下直接观察时，气丝在上层、基丝在下层，气丝色暗，基丝较透明。孢子丝依种类的 不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。在油镜下观察，放线菌的孢子有球形、椭圆、杆状或柱状。能否产生菌丝体及由菌丝体分化产生的各种形态特征是放线菌分 类鉴定的重要依据。为了观察放线菌的形态特征，入们设计了各种培养和观察方法，这些方法的主要目的是为了尽可能保持放线菌自然生长状态下的形态特征。本实 验介绍其中几种常用方法。
扦片法：将放线菌接种在琼脂平板上，扦上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻上。观察时，轩轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的形态。
玻璃纸法：玻璃纸是一种透明的半透膜，将灭菌的玻璃纸覆盖在琼脂平板表然后将放线菌接种于玻璃纸上，经培养，放线菌在玻璃纸上生长形成菌苔。观察时，揭下玻璃纸，固定在载玻片上直接镜检。这种方法既能保持放线菌的自然生长状态，也便于观察不同生长期的形态特征。
印片法；将要观察的放线菌的菌落或菌苔，先印在载玻片上，经染色后观察。这种方法主要用于观察孢子丝的形态、孢子的排列及其形状等。方法简便、但形态特征可能有所改变。
三、器材
1 菌种 ： 细黄链霉菌 ( Streptomyces microflavus ) 或青色链霉菌 ( S. glaucus ) ，弗氏链霉菌 ( S. fradiae ) 。
2 培养基 ： 灭菌的高氏 1 号琼脂。
3 仪器或其他用具 ： 经灭菌的：平皿、玻璃纸、盖玻片、玻璃涂棒，以及载玻片，接种环，接种铲，镊子，石炭酸复红染液，显微镜等。
四、操作步骤
1 . 扦片法
(1) 倒平板 ： 取融化并冷至大约 50 ℃ 的高氏 1 号琼脂约 20ml 倒平板，凝固待用。
(2) 接种 ： 用接种环挑取菌种斜面培养物（孢子）在琼脂平板上划线接种。划线要密些，以利扦片。
(3) 扦片：以无菌操作用镊子将灭菌的盖玻片以大约 45 °角扦入琼脂内 ( 扦在接种线上 ) ，扦片数量可根据需要而定。
(4) 培养 ： 将扦片平板倒置， 28 o C 培养，培养时间根据观察的目的而定，通常 3-5d 。
(5) 镜检 ： 用镊子小心拔出盖玻片，擦去背面培养物，然后将有菌的一面朝上放在载玻片上，直接镜检。
观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，再换高倍镜观察。如果用0.1% 美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察，效果会更好。
2 . 玻璃纸法
(1) 倒平板 ： 同扦片法。
(2) 铺玻璃纸 ： 以无菌操作用镊子将已灭菌 (155~ 160 ℃ 干热灭菌 2h) 的玻璃纸片（似盖玻片大小 ) 铺在培养基琼脂表面，用无菌玻璃涂棒 ( 或接种环 ) 将玻璃纸压平，使其紧贴在琼脂表面，玻璃纸和琼脂之间不留气泡。每个平板可铺 5 ～ 10 块玻璃纸。也可用略小于平皿的大张玻璃纸代替小纸片，但观察时需要再剪成小块。
(3) 接种 ： 用接种环挑取菌种斜面培养物 ( 孢子 ) 在玻璃纸上划线接种。
(4) 培养 ： 将平板倒置， 28 0 C 培养 3-5d 。
(5) 镜检 ： 在洁净载玻片上加一小滴水，用镊子小心取下玻璃纸片，菌面朝上放在玻片的水滴上，使玻璃纸平贴在玻片上 ( 中间勿留气泡 ) ，先用低倍镜观察，找到适当视野后换高倍镜观察。
操作过程，勿碰动玻璃纸菌面上的培养物。
3 . 印片法
(1) 接种培养 ： 用高氏 I 号琼脂平板，常规划线接种或点种， 28 0 C 培养 4 ～ 7d 。也可用上述两种方法所使用的琼脂平板上的培养物，作为制片观察的材料。
(2) 印片 ： 用接种铲或解剖刀将平板上的菌苔连同培养基切下一小块，菌面朝上放在一载玻片上。另取一洁净载玻片置火焰上微热后，盖在菌苔上，轻轻按压，使培养物 ( 气丝、孢子丝或袍子 ) 粘附 ( “印” ) 在后一块载玻片的中央，有印迹的一面朝上，通过火焰 2-3 次固定。
印片时不要用力过大压碎琼脂，也不要错动，以免改变放线菌的自然形态。
(3) 染色 ： 用石炭酸复红覆盖印迹，染色约 1min 后水洗。
(4) 镜检：干后用油镜观察。
五、实验报告
1 . 结果
绘图说明你所观察到的放线菌的主要形态特征。
2 . 思考题
(1) 试比较三种培养和观察放线菌方法的优缺点。
(2) 玻璃纸培养和观察法是否还可用于其他类群微生物的培养和观察 ? 为什么 ?
(3) 镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝 ?
实验十 . 微生物的纯种分离培养
第一部分：微生物的分离与纯化
一、目的要求
掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。
二、基本原理
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的方法有：
简易单细胞挑取法 ： 它需要特制的显微操纵器或其他显微技术，因而其使用受到限制。简易单孢子分离法是一种不需显微单孢操作器，直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方 法。它采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬浮液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴。将只含有一个萌发孢子的微滴放一小块营养琼脂片，使其 发育成微菌落。再将微菌落转移到培养基中，即可获得仅由单个孢子发育而成的纯培养。
平板分离法 ： 该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理包括两方面： 1. 选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种
抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
2. 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板 或平板划线等技术完成。值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合 显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用三种不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。
三、器材
1. 菌种：米曲霉 ( Aspergillus oryzae ) 。
2. 培养基：淀粉琼脂培养基 ( 高氏 I 号培养基 ) ，牛蹂高蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，
查氏琼脂培养基。
3. 溶液或试剂： 10 ％酚，盛 9ml 无菌水的试管，盛 90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶， 4 ％水琼脂。
4. 仪器或其他用具 无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板等。
四、操作步骤
1. 稀释涂布干板法
(1) 倒平板 将肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏 I 号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基加热溶化，待冷至 55 ～ 60 ℃ 时，高氏 I 号琼脂培养基中加入 10 ％酚数滴，马丁氏培养中加入链霉素溶液 ( 终浓度为 30 μ g ／ m1) ，混均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿：
倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔 出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手撑边缘或小指与无名指夹住管 ( 瓶 ) 塞 ( 也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中 ) 。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约 15ml ，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
(2) 制备土壤稀释液 ：称取土样 10g ，放入盛 90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约 20min ，使土样与水充分混合，将细胞分散。用一支 1ml 无菌吸管从中吸取 1 ml 土壤悬液加入盛有 9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取 lml( 无菌操作 ) 加入另一盛有 9ml 无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成 10 -1 、 10 -2 、 10 -3 、 10 -4 、 10 -5 、 10 -6 不同稀释度的土壤溶液。
涂布 ： 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上 10 -4 、 10 -5 和 10 -6 三种稀释度，然后用无菌吸管分别由 10 -4 、 10 -5 和 10 -6 三管土壤稀释液中各吸取 0.1ml 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒按所示，在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置 5 ～ 10min ，使菌液吸附进培养基。平板涂布方法：将 0.1ml 菌悬液小心地滴在平板培养基表面中央位置 (0.1 ml 的菌液要全部滴在培养基上，若吸移管尖端有剩余的，需将吸移管在培养基表面上轻轻地按一下便可 ) 。右手拿无菌涂棒平放在乎板培养基表面上，将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直线来回推动，
平板内边缘处可改变方向用涂棒再涂布几次。
(4) 培养 ： 将高氏 I 号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于 28 0 C 温室中培养 3 ～ 5d ，肉膏蛋白胨平板倒置于 37 0 C 温室中培养 2-3d 。
(5) 挑菌落 ： 将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基的斜面上，分别置 28 ℃ 和 37 ℃ 温室培养，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯 培养。
2. 平板划线分离法
(1) 倒平板 按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期。
(2) 划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述 10 -1 的土壤悬液一环在平板上划线 ( 见图 Ⅶ -5) 。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种：
① 用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线 3-4 条，再转动培养皿约 70 0 角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分作第 四次平行划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。
② 将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。
（ 3 ） 挑菌落 同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。
3. 简易单孢子分离法
（ 1 ） 厚壁磨口毛细滴管的制备 ： 截取一段玻璃管，在火焰上烧红所要拉细的区域，然后用镊子夹住其尖端，在火焰上拉成很细的毛细管。从尖端适当的部位割断，用砂轮或砂纸仔细湿磨，使管口平 整、光滑（毛细滴管要求达到点样时出液均匀、快速，每微升孢子悬液约点 50 微滴，每滴的大小略小于低倍镜的视野）。 （ 2 ） 分离小室的制备 取无菌培养皿（ D9cm) 倒入约 10ml 4 ％水琼脂作保湿剂。在皿盖上用记号笔（最好用红色）如图所示画方格。待凝后倒置于 37 ℃恒温箱烘数小时，使皿盖干燥。
（ 3 ） 萌发孢子悬液的制备
① 孢子悬液的制备 用接种环挑取米曲霉孢子数环接入盛有 10ml 查氏培养液及玻璃珠的无菌三角瓶中，振荡 5~10min ，使孢子充分散开。
② 过滤 用无菌漏斗（塞棉花）或自制的过装置将上述充分散开的孢子液过滤，收集过滤液。
③ 孢子萌发 ： 将孢子过滤液用血球计数板测定孢子的浓度 ( 此处可由教师准备 ) ，再用查氏培养液调整孢子液至 0.5~1.5x10 6 个孢子／毫升后置 28 0 C 培养 8h 。
④ 点样 ： 用无菌自制的厚壁磨口毛细管吸取萌发孢子液少许，快速轻巧地点在培养皿的内壁的方格中，每微滴面积略小于显微镜低倍镜视野，依次将每方格点上萌发孢子液，成为分离小室。最后将皿盖小心快速翻过来，盖在原来的平板上。
⑤ 镜检 ：将点样的分离小室平板放在显微镜镜台上，用低倍镜逐个检查皿盖内壁上的微滴。如果观察到某微滴内只有一个萌发孢子时用记号笔在皿盖上作记号。
⑥ 加薄片培养基：取少量查氏琼脂培养基倒入无菌培养皿（培养皿先置 45 0 C 预热）中制成薄层平板，待其凝固后哟无菌小刀片将平板琼脂切成若干小片（其面积应小于培养皿盖上所画小方格的面积），然后挑一小片放在作有记号的单孢子微滴上，
⑦ 培养：将分离小室平板置 28 ℃培养 24h ，直至单孢子形成微菌落。
⑧ 转种：用无菌微型小刀小心地挑取长有微菌落的琼脂薄片移至新鲜的查氏培养基斜面或液体培养中，置 28 ℃培养 4-7d ，即可获得由单孢子发育面成的纯培养。
五、实验结果
1. 结果
（ 1 ） 你所做的涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是，请分析其原因并重做。
（ 2 ） 在三种不同的平板上你分离得到哪些类群的微生物 ? 简述它们的菌落特征。
2. 思考题
(1) 如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养 ? 请写出实验的主要步骤。
(2) 分离单孢子前为什么先使孢子萌发 ?
(3) 如果要分离得到极端嗜盐细菌，在什么地方取样品为宜？并说明其理由。
(4) 如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产高温蛋白酶的菌株，你将如何完成，请写出简明的实验方案 ( 提示：产蛋白酶菌株在酪素平板上形成降解酪素的透明圈 ) 。
(5) 为什么高氏 I 号培养基和马丁氏培养基中要分别加入酚和链霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培养基分离一种对青霉素具有抗性的细菌，你认为应如何做 ?
第二部分：平板菌落计数
一、目的要求
学习 菌种的 平板菌落计数的基本原理和方法。
二、基本原理
平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的 稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取 样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的 2~3 或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低，为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位（ colony-forming units,cfu ）而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水（包括水源水）等的含菌指数或污染程度的检测。
三、器材
1 ． 菌种：大肠杆菌菌悬液。
2 ． 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。
3 ． 仪器或其他用具 1ml 无菌吸管，无菌平皿，盛有 4.5ml 无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。
四、操作步骤
1 ． 编号
取无菌平皿 9 套，分别用记号笔标明 10-4 、 10-5 、 10-6 （稀释度）各 3 套，另取 6 支盛有 4.5ml 无菌水的试管，依次标是 10-1 、 10-2 、 10-3 、 10-4 、 10-5 、 10-6 。
2 ． 稀释
用 1ml 无菌吸管吸取 1ml 已充分混匀的大肠杆菌菌悬液（待测样品），精确地放 0.5ml 至 10-1 的试管中，此即为 10 倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。
将 10-1 试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支 1ml 吸管插入 10-1 试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太
快，吸时吸管伸入管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取 10-1 菌液 1ml ，精确地放 0.5ml 至 10-2 试管中，此即为 100 倍稀释。 ······ 其余依次类推，整个过程如图Ⅷ -3 所示。
放菌液时吸管不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。
3 ． 取样
用三支 1ml 无菌吸管分别吸取 10-4 、 10-5 和 10-6 的稀释菌悬液各 1ml ，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放 0.2ml 。
不要用 1ml 吸管每次只靠吸管尖部吸 0.2ml 稀释菌液放入平皿中，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。
4 ． 倒平板
尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至 45 ℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基约 15 毫升 / 平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。
由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并已冷却至 45 ℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。
待培养基凝固后，将平板倒置于 37 ℃恒温培养基中培养。
5 ． 计数
培养 48h 后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：
每毫升中菌落形成单位（ cfu ） = 同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数× 5
一般选择每个平板上长有 30~300 个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适，同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复三个对照平板 不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。由 10-4 、 10-5 和 10-6 三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。
平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的，一般三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后，所出现的平均菌落数在 50 个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。
平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式在外，还可以用涂布平板的方式（见实验二十 四）进行。二者操作基本相同，所不同的是后者先将牛肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板，待凝固后编号，并于 37 ℃左右的温箱中烘烤 30 分钟，或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快渗入培养基表层内，然后倒置 37 ℃的恒温箱中培养 24~48h 。
涂布平板用的菌悬液一般以 ?0.1ml 较为适宜，如果过少，菌液不易涂布开；过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。
五、实验报告
1 ． 结果
将培养后菌落计数结果填入下表：
稀释度
10-4
10-5
10-6
1
2
3
平均
1
2
3
平均
1
2
3
平均
Cfu 数 / 平板
每毫升中的 cfu 数
2 ． 思考题
（ 1 ）为什么融化后的培养基要冷却至 45 ℃左右才能倒平板？
（ 2 ）要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？
（ 3 ）试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。
（ 4 ）当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里？
（ 5 ）用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同？为什么要培养较长时间（ 48h ）后观察结果？
主要参考书
1. 沈萍、范秀容 . 《微生物学实验》第三版 . 高等教育出版社 ,1999 年 .
2. 赵斌、何绍江 . 《微生物学实验》 . 科学出版社 ,2002 年 .
3. 钱存柔、黄仪秀 . 《微生物学实验教程》 . 北京大学出版社 ,1999 年 .
4. 黄秀梨 . 《微生物学实验指导》 . 高等教育出版社 ,1999 年 .
实验二 . 细菌的革兰氏染色
实验三 . 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别
实验四 . 酵母菌的数量测定
实验五 . 酵母菌的大小测定
实验六 . 微生物菌落的观察实验
实验七 . 霉菌的形态观察
实验八 . 培养基的制备与灭菌
实验九 . 放线菌的形态及菌落特征的观察
实验十 . 微生物的纯种分离培养
实验一. 普通光学显微镜的使用
一、目的要求
1.学习并掌握油镜的原理和使用方法。
2.复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。
二 . 显微镜的基本结构及油镜的工作原理
现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大 成像，故又常 被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。在显微镜的 光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普 通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研 究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之 间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因：
1.增加照明亮度
油镜的放大倍数可达 100 Χ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径 很小，但所需要的光照强度却最大。从承载标本的玻片透过来的光线，因介 质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射 ，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。 所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入 与玻璃的折射率（n=1.55 ）相仿的油镜（通常用香柏游，其折射率 n=1.52 ）。
2.增加显微镜的分辨率
显微镜的分辨率或分辨力 (resolution orresolving power) 是指显微 镜能辨别两点之间的最小距离的能力。从物理学角度看，光学显微镜的分辨 率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：（公式P16 ）式中λ = 光波波长； NA=物镜的数值孔径值。
光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（ 0.4--0.7 μ m ）， 而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示 为： NA=n × sin α
式中α为光线最大入射角的半数。它取决于物镜的直径和焦距，一 般来说在 实际应用中最大只能达到 120 O ，而 n 为介质折射率。由于香柏油的折射 率（ 1.52 ）比空气及水的折射率（分别为 1.0 和1.33 ）要高，因此以香 柏油作为镜头于玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径值（NA 一般在 1.2~1.4 ）要高于低倍镜、高倍镜等干镜（ NA都低于 1.0 ）。若以可见光 的平均波长 0.55 μ m 来计算，数值孔径通常在0.65 左右的高倍镜只能分 辨出距离不小于 0.4 μm 的物体，而油镜的分辨率却可达到 0.2 μ m 左 右。
三、器材
1.菌种：枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis ）染色玻片标本。青霉 （Penicillium sp. ）的水封片。
2.溶液或试剂：香柏油、乙醇：乙醚混合液
3.仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸等。
四 . 操作步骤
1.观察前的准备
（ 1 ） 显微镜的安置：置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约 3~4cm 。镜检时姿势要端正。
取放显微镜时应一手握住镜臂，一手托住底座，使显微镜保持直立、 平稳。切忌用单手拎提；且不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同 时睁开观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观察边绘图或记录。
（ 2 ） 光源调节：安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明 亮度，而使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源 的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或凸面反光镜并调节其角度， 使视野内的光线均匀，亮度适宜。
（ 3 ） 根据使用者的个人情况，调节双筒显微镜的目镜，双筒显微镜的目镜 间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有曲光度调节环，可以适应 眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。
（ 4 ） 聚光器数值孔径值的调节：调节聚光器虹彩光圈值与物镜的数值孔径 值相符或略低。有些显微镜的聚光器只标有最大数值孔径值，而没有 具体的光圈数刻度。使用这种显微镜时可在样品聚焦后取下一目镜， 从镜筒中一边看着视野，一边缩放光圈，调整光圈的边缘与物镜边缘 黑圈相切或略小于其边缘。因为各物镜的数值孔径值不同，所以每转 换一次物镜都应进行这种调节。
在聚光器的数值孔径值确定后，若需改变光照强 度，可通过升降聚光 器或改变光源的亮度来实现，原则上不应再通过虹彩光圈的调节。当然， 有关虹彩光圈、聚光器高度及照明光源强度的使用原则也不是固定不变的 ，只要能获得良好的观察效果，有时也可根据不同的具体情况灵活运用， 不一定拘泥不变。
2.显微观察
在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达 到的分辨率及 放大率都是不同的。一般情况下，特别是初学者，进行显微观察时应遵守从 低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现 目标及确定检查的位置。
（ 1 ） 低倍镜观察 金黄色葡萄球菌染色标本玻片置于载物台上，用标本夹 夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。下降 10 Χ物镜， 使其接近标本，用粗调节器慢慢升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦 ，再使用细调节器调节图象清晰。通过玻片夹推进器慢慢移动玻片， 认真观察标本各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到 的结果。
在任何时候使用粗调节器聚焦物像时，必需养成先从侧面注视小 心调节物镜靠近标本，然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本进行 准焦的习惯，以免因一时的误操作而损坏镜头及玻片。
（ 2 ） 高倍镜观察 低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后， 轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置。对聚光器光圈及视野亮 度进行适当调节后微调细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔 细观察并记录所观察到的结果。
在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换 器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态 ，这种现象称为物镜的同焦 (parfocal) 。利用这种同焦现象，可以 保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细 调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误 操作而损坏镜头或载玻片。
（ 3 ） 油镜观察 高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器 将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香 柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油 中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈，若所用聚 光器的数值孔径值超过 1.0 ，还应在聚光镜与载玻片之间也加滴香 柏油，保证其达到最大的效能。调节照明使视野亮度合适，用粗调节 器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦 为止。
有时按上述操作还找不到目的物，则可能是 由于油镜头下降还未 到位，或因油镜上升太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像。遇此 情况，应重新操作。另外应特别注意不要因在下降镜头时用力过猛， 或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片。
3.显微镜用毕后的处理
（ 1 ） 上升镜筒，取下载玻片。
（ 2 ） 用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶 于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留 的二甲苯。
（ 3 ） 用擦镜纸清洁其他物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。
（ 4 ） 将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下 旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。
五 . 实验报告
1.分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的金黄色葡萄球菌、枯草芽 孢杆菌、链霉菌及青霉的形态，包括在三种情况下视野中的变化。同时注 明物镜放大倍数和总放大率。
2.思考题
（ 1 ） 用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起 什么作用？
（ 2 ） 试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍 镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？
（ 3 ） 什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？
（ 4 ） 影响显微镜分辨率的因素有哪些？
（ 5 ） 根据你的实验体会，谈谈应如何根据所观察微生物的大小，选择不同 的物镜进行有效的观察。
实验二. 细菌的简单染色法
一、目的要求
1.学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色方法。
2.初步认识细菌的形态特征。
3.巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。
二、基本原理
虽然可以用相差显微镜等直接观察微生物的形态特征，但其应 用有局限性 ；用电子显微镜可以观察到微生物的各种形态结构，但因其价格昂贵、设备条 件要求高、操作也较复杂，应用上也受一定限制。所以，一般实验室仍常用普 通光学显微镜来进行微生物形态学特征的观察。然而，微生物（尤其是细菌） 细胞小而透明，当把菌悬液浮于水滴内，用光学显微镜观察时，由于菌体和背 景没有显著的明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易识别其结构，所以， 用不同光学显微镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，借助于颜色的反衬 作用，可以更清楚地观察到细菌的形状及某些细胞结构。因此，为了研究微生 物的形态特征和鉴别不同类群的微生物，微生物的染色及形态结构的观察是微 生物实验中十分重要的基本技术。
用于微生物染色的染料，是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化 合物。发色基团赋予化合物的颜色特征，助色基团则给予化合物能够成盐的性 质，仅含发色基团的苯化合物（称色原）即使带有颜色也不能作为染料，因为 它不能电离，不能与酸或碱形成盐，对微生物（或其他材料）没有结合力，很 容易被洗脱或机械方法除去。染料通常都是盐，分酸性染料和碱性染料两大类 。在微生物染色中，碱性染料较常用，如常用的美蓝（即亚甲蓝）、结晶紫、 碱性复红、番红（即沙黄）、孔雀绿等都属于碱性染料。
这部分实验着重于细菌的染色观察，同时也进行放线菌、酵母菌和丝状真 菌的形态学观察。其目的是使同学在掌握细菌染色观察技术的基础上，了解其 他微生物形态结构的观察方法；初步认识各类微生物的形态特征，巩固课堂知 识，增强感性认识。
简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便， 适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中， 细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电，荷 酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很 容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在 显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等 。
当细菌分解糖类产酸使培养基 pH 下降时，细菌所带正电荷增加，此时可 用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
三、器材
1.菌种 枯草芽孢杆菌 12~18h 营养琼脂斜面培养基，藤黄微球菌
（Micrococcus luteus ）约 24h 营养琼脂斜面培养物。
2.染色剂 吕氏碱性美蓝染液（或草酸铵结晶紫染液），齐氏石炭酸复红染 液。
3.仪器或其他用具 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏 油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水等。
四、操作步骤
1.涂片
取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环挑取 1~2 环）生理盐水（或蒸 馏水）于玻片中央、用接种环以无菌操作分别从枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌斜 面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液（或液体培养物） 涂片，可用接种环挑取2~3 环直接涂于载玻片上。
载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂均匀，不宜 过厚。
2.干燥
室温自然干燥或酒精灯干燥。
3.固定
涂面朝上，通过火焰 2-3 次。
此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之 牢固附着在载玻片上。
热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破 坏细胞形态。
4.染色
将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为 宜）。
吕氏碱性美蓝染色 1~2min ；石炭酸复红 ( 或草酸铵结晶紫 ) 染色约 1min 。
5.水洗
倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。
水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜过 急，以免涂片薄膜脱落。
6.干燥
自然干燥，或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。
7.镜检
涂片干后镜检。
涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。最后清理显微镜。
五、实验报告
1.结果
根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。
2.思考题
(1)你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？
(2)为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察 ?
(3)如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题 ? 如果加热温度过高、 时间太长，又会怎么样呢？
实验三. 革兰氏染色法
一、目的要求
1.学习并初步掌握革兰氏染色法。
2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、基本原理
革兰氏染色法是 1884 年由丹麦病理学家 Chrstain Gram 氏创立的，而 后一些学者在此基础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别 染色法。
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再 用碘液媒染 ，然后用乙醇 ( 或丙酮 ) 脱色， 最后用复染剂 ( 如番红) 复染。经此方法 染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被 脱色剂洗 脱而使细菌染上复染剂的颜色( 红色 ) ，该菌属于革兰氏阴性菌 。
革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞 壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样 ，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结 晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两 类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网 状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇( 或丙酮 ) 脱色时细胞壁脱水、 使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫一碘的复合物不易 被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性 菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类 脂质被乙醇 ( 或丙酮 ) 溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫一碘的复合物比较 容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。革兰氏染色反 应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是 十分必要的。本实验将介绍被普遍采用的Hucker 氏改良的革兰氏染色法。
三、器材
1.菌种 ：大肠杆菌约 24h 营养琼脂斜面培养物，枯草芽孢杆菌 24h 营养 琼脂斜面培养物，
2.染色剂 ：革兰氏染色液。
3.仪器或其他用具：同实验一
四、操作步骤
1.制片
取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。要用活跃生长期的幼培养物作革兰 氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热 （以玻片不烫手为宜） 。
2.初染
滴加结晶紫 ( 以刚好将菌膜覆盖为宜 ) 染色1-2min ，水洗。
3.媒染
用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约 1min ，水洗
4.脱色
用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95 ％的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。
革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色 不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时 间一般约20-30s 。
5.复染
用番红液复染约 2min ，水洗。
6.镜检
干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色 的为革兰氏阴性菌。
7.混合涂片染色
按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或大肠杆菌和 枯草 芽孢作混合涂片、染色、镜检进行比较。
五、实验报告
1.结果
列表简述 3 株细菌的染色观察结果 ( 说明各菌的形状、颜色和革兰氏染 色反应 ) 。
2.思考题
（ 1 ） 你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性 ? 其中最关键的环 节是什么 ?
（ 2 ） 现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏 染色反应。你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色 ，以证明你的染色结果正确性。
（ 3 ） 你的染色结果是否正确 ? 如果不正确，清说明原因。
（ 4 ） 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色 会出现什么问题 ?
（ 5 ） 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗 ? 乙醇脱色后复染之前，苹兰氏 阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？
（ 6 ） 你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果 ? 在 什么情况下可以采用？
实验三 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别
一、目的要求
1.观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法
2.掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。
二、基本原理
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌 大几倍甚至 十几倍。大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通 过接合产生子囊孢子。本实验通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵 母的形态和出芽生殖方式。美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还 原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细 胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此 ，具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞 则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。
三、器材
1.菌种 ： 酿酒酵母 (Saccharomycescerevisisiae) 培养约 2d 的麦芽汁 (或 YEPD ) 斜面培养物。
2.溶液或试剂 ： 0.05 ％和 0.1 ％吕氏碱性美蓝染色液，革兰氏染色用碘 液。
3.仪器或其他用具 ： 显微镜，载玻片，盖玻片等。
四、操作步骤
1.美蓝浸片的观察
(1)在载玻片中央加一滴 0.1 ％吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用 接种环挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均匀。染液不宜过多或过少，否 则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。
(2)用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使 其盖在菌液上。盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。
(3)将制片放置约 3min 后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态 和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。
(4)染色约 0.5h 后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加。
(5)用 0.05 ％吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。
2.水一碘液浸片的观察
在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加 3 小滴水，取 少许酵母菌苔放在水一碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。
五、实验报告
1.结果
绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征。
2.思考题
(1)吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何 影响？试分析其原因。
(2)在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？
实验四. 酵母菌的数量测定
一、目的要求
1． 明确血细胞计数板计数的原理。
2． 掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。
二、基本原理
单细胞微生物个体生长时间较短，很快进入分裂繁殖阶段，因此，个体生 长难以测定，除非特殊目的，否则单个微生物细胞生长测定实际意义不大。 微生物的生长与繁殖（个体数目增加）是交替进行的，它们的生长一般不是依 据细胞的大小，而是以繁殖，即群体的生长作为微生物生长的指标。
群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。测定细胞数目的方 法有显微镜直接计数法（direct microscopic count ）、平板菌落计数法（ plate count ）、光电比浊法（turbidity estimation by spectrophotometer ）、最大或然数法（ most probable number MPN ）以及 膜过滤法（ membrane filtration ）等。测定细胞物质的方法有细胞干重的 测定，细胞某种成分如氮的含量。 RNA 和DNA 的含量测定，代谢产物的测定 等。总之，测定微生物生长量的方法很多，各有优缺点，工作中应根据具体要 求加以选择。
本实验主要介绍生产、科研工作中比较常用的显微镜直接计数法、平板菌 落计数法和光电比浊计数法。
显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面 积和容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接计数的一种简便、快速 、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff- Hauser 计数器以及Hawksley 计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢 子等悬液的计数，基本原理相同。后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为 0.02mm3 ，而且盖玻片和载玻片之间的距离只有0.02mm ，因此可用油浸物镜 对细菌等较小的细胞进行观察和计数。除了用这些计菌器外，还有在显微镜下 直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查 。显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。但此法的缺点是所测得 的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点， 如结合活菌染色，微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只 计数活菌体的目的。本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。另外两种 计菌器的使用方法可参看各厂商的说明书。
用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计 数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被 一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九 个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度一般有两种规格，一种是 一个大方格分成 25 个中方格，而每个中方格又分成 16 个小方格；另一种是 一个大方格分成 16 个中方格，而每个中方格又分成 25 个小方格，但无论是 哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400 个。每一个大方格 边长为 1mm ，则每一个大方格的面积为 1mm3 ，盖上盖玻片后，盖玻片与载 玻片之间的高度为0.1mm ，所以计数室的容积为 0.1mm3 （万分之一毫升）
计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再 乘上 25 或 16 ，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成 1ml 菌液中 的总菌数。
设五个中方格中的总菌数为 A ，菌液稀释倍数为 B ，如果 25 个中方格 的计数板，则：
1ml菌液中总菌数 =A/5 × 25 × 104 × B=50000A · B （个）
同理，如果是 16 个中方格的计数板，
1ml菌液中总菌数 =A/5 × 16 × 104 × B=32000A · B （个）
三、器材
1． 菌种：酿酒酵母。
2． 仪器或其他用具：血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管。
四、操作步骤
1．菌悬液制备
以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。
2．镜检计数室
在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹 干后才能进行计数。
3．加样品
将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀 的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透 作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。
取样时先摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。
4．显微镜计数
加样后静止 5min ，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用 低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。
调节显微镜光线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光 线不要偏向一边，否则视野中不易看清楚计数室方格线，或只见竖线或只见 横线。
在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般 榈稀释度要求每小格内约有5~10 个菌体为宜。每个计数室选 5 个中格（可 选 4 个角和中央的一个中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只 数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作 为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样 品的含菌量。
5．清洗血细胞计数板
使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头上用水冲洗干净，切勿用硬物洗 刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体 或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。
五、实验报告
1．结果
将结果记录于下表中。 A 表示五个中方格中的总菌数； B 表示菌液稀释倍数。
各中格中菌数
A
B
二室平均值
菌数 /ml
1
2
3
4
5
第一室
第二室
2． 思考题
（ 1 ）根据你的体会，说明用血细胞计数的误差主要来自哪些方面？应如何 尽量减少误差、力求准确？
（ 2 ）某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计 1~2 种可行的 检测方法。
实验五. 酵母菌的大小测定
一、目的要求
1.学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。
2.增强微生物细胞大小的感性认识。
二、基本原理
微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的 依据之一。 微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具——测微尺，包 括目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺（图 Ⅳ -9 ， A ）是中央部分刻有 精确等分线的载玻片，一般是将 1mm 等分为 100 格，每格长 0.01mm （即10 μ m ）。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微 尺每格调相对长度。目镜测微尺（是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其 中央有精确的等分刻度，有等分为50 小格和 100 小格两种。测量时，需将 其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同显 微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际 长度也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺 进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小 格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计 算出细胞的实际大小。球菌用直径来表示其大小；杆菌则用宽和长的范围来表 示，如酿酒酵母直径约为4.5 μ m ，枯草芽孢杆菌大小为 0.7-0.8 × 2-3 μ m 。
三、器材
1.菌种：藤黄微球菌和大肠杆菌的染色标本片，酿酒酵母 24h 马铃薯斜面 培养物。
2.仪器或其他用具 ： 目镜测微尺，镜台测微尺，载玻片，盖玻片，显微镜 等。
四、操作步骤
1.装目镜测微尺
取出接目镜，把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒 内的隔板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内
2.校正目镜测微尺
(1)放镜台微尺：将镜台测微尺刻度面朝—上放在显微镜载物台上。
(2)校正：先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调 节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺的刻度 与镜台测微尺的刻度平行。利用移动器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域 内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台微尺和目镜微尺所占的格 数。
用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出在高倍镜和油镜下， 两重合线之间两尺分别所占的格数。
观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台微尺的刻度；换高倍镜和油镜校 正时，务必十分细心，防止接物镜压坏镜台微尺和损坏镜头。
(3)计算：由于已知镜台测微尺每格长 10 μ m ，根据下列公式即可分别计 算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。
公式 P47
3.菌体大小测定
目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上细菌染色制 片。先用低倍 镜和高倍镜找到标本后，换油镜测定藤黄微球菌的直径和大肠杆菌的宽度和 长度。测定时，通过转动目镜微尺和移动载玻片，测出细菌直径或宽和长所 占目镜测微尺的格数。最后将所测得的格数乘以目镜测微尺( 用油镜时 ) 每格所代表的长度，即为该菌的实际大小。
通常测定对数生长期菌体来代表该菌的大小；可选择有代表性的3~5 个 细胞进行测定；细菌的大小需用油镜测定，以减少误差。
4.测定完毕，取出目镜测微尺，将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台 测微尺分别用擦镜纸擦拭干净，放回盒内保存。
五、实验报告
1.结果
（ 1 ） 将目镜测微尺校正结果填入下表： P48 表
（ 2 ） 将各菌测定结果填入下表： P48 表
2.思考题
（ 1 ） 为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对 目镜测微尺进行校正？
（ 2 ） 在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一 细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？
实验六. 微生物菌落与培养特征的观察实验
一、目的要求
1.了解不同的微生物在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征。
2.进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术。
二、基本原理
微生物的培养特征是指微生物在固体培养基上、半固体和液体 培养基中生 长后所表现出的群体形态特征。不同的微生物有其固有的培养特征，这些特征 一般用固体、半固体和液体培养基来进行检测。固体培养基又分平板与斜面两 种形式。在平板上主要观察菌落表面结构、形态及边缘等状况；它们培养在斜 面培养基上，可以呈丝线状、刺毛状、念珠状、疏展状、树枝状或假根状；生 长在液体培养基内，可以呈混浊、絮状、粘液状、形成菌膜、上层清晰而底部 显沉淀状；穿刺培养在半固体培养基中，可以沿接种线向四周蔓延或仅沿线生 长；也可上层生长很好，甚至连成一片，底部很少生长或底中长得好，上层甚 至不生长。微生物培养特征还包括菌苔的颜色、表面光滑程度、基质是否产生 水溶性色素等。培养特征可以作为微生物分类鉴定的指征之一，并能为识别纯 培养是否被污染作为参考。检测微生物的培养特征时，接种和培养过程中必须 保证不被其他微生物所污染，因此，除工作环境要求尽可能地避免或减少杂菌 污染外，熟练地掌握各种无菌操作接种技术是很重要的。微生物菌落形态已分 别在实验一和实验二十四中观察过，因此本实验采用斜面、半固体和液体培养 基检测不同微生物的培养特征。图 Ⅶ -8
三、器材
1. 菌种 枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球，白地霉( Geotrichum candidum ), 蕈状芽孢杆菌（ Bacillusmycoides ），粘质沙雷氏菌 ( Serratia marcescens ) 。
2. 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基 ( 斜面、液体、半固体 ) 。
3. 仪器或其他用具 接种环，接种针，无菌吸管，酒精灯等。
四、操作步骤
1. 斜面接种
（ 1 ） 在肉膏蛋白胨斜面试管上用记号笔标明待接种的菌种名称、株号、日 期和接种者。
（ 2 ） 点燃酒精灯或煤气灯。
（ 3 ） 将菌种试管和待接种的斜面试管，用大拇指和食指、中指、无名指握 在左手中，试管底部放在手掌内并将中指夹在两试管之间，使斜面向上成水 平状态，在火焰边用右手松动试管塞以利于接种时拔出。
（ 4 ） 右手拿接种环通过火焰烧灼灭菌 ( 参照实验一) ，在火焰边用右手 的手掌边缘和小指，小指和无名指分别夹持棉塞 ( 或试管帽 ) 将其取出， 并迅速烧灼管口。 取试管棉塞或试管帽时要缓慢拔出，不宜用力过猛。
（ 5 ） 将灭菌的接种环伸入菌种试管内，先将环接触试管内壁或未长菌的 培养基，使接种环的温度下降达到冷却的目的，然后再挑取少许菌苔。将接 种环退出菌种试管，迅速伸入待接种的斜面试管，用环在斜面上自试管底部 向上端轻轻地划一直线。 所划直线尽可能的直，切莫划几条线或蛇形，不要 将培养基划破，也不要使接种环接触壁或管口。
（ 6 ） 接种环退出斜面试管，再用火焰烧灼管口，并在火焰边将试管塞上。 将接种环逐渐接近火焰再烧灼，如果接种环上沾的菌体较多时，应先将环在 火焰边烤干，然后烧灼，以免未烧死的菌种飞溅出污染环境，接种病原菌时 更要注意此点。
2. 液体培养基接种
向肉膏蛋白胨液体培养基中接种少量菌体时，其操作步骤基本与斜面接种 法相同，不同之处是挑取菌苔的接种环放入液体培养基试管后，应在液体表 面处的管内壁上轻轻磨擦，使菌体分散从环上脱开，进入液体培养基，塞好 试管塞后摇动试管，使菌体在培养液中分布均匀，或如图 Ⅶ -10 所示用试 管振荡器混匀。若向液体培养基中接种量大或要求定量接种时，可先将无菌 水或液体培养基加入菌种试管，用接种环将菌苔刮下制成菌悬液( 刮菌苔时 要逐步从上向下将菌苔洗下，用手或振蔼器振匀。 ) ，再将菌悬液用塞有过 滤棉花的无菌吸管定量吸出后加入，或直接倒入液体培养基。如果菌种为液 体培养物，则可用无菌吸管定量吸出后加入或直接倒入液体培养基。整个接 种过程都要求无菌操作。
3. 穿刺接种
用接种针下端挑取菌种 ( 针必须挺直 ) ，自半固体培养基的中心垂直刺 入半固体培养中，直至接近试管底部，但不要穿透，然后沿原穿刺线将针退 出，塞上试管塞烧灼接种针。 上述几种接种方法的无菌操作，凡未叙述的均 按实验一操作。实验者应反复练习无菌接种技术，直至较熟练地掌握。
4. 将已接种的斜面，半固体和液体培养基放置28 ～ 30 ℃ 温室培养 2-3d 后取出观察结果。
五、实验报告
1. 结果
详细描述实验中各种微生物在斜面上、半固体和液体培养基中的培养特征。
2. 思考题
(1) 一个好氧的具周生鞭毛的菌株分别在半固体和液体培养基中的培养特 征是怎样的 ?
(2) 用斜面检测微生物的培养特征接种时，为什么不要划多条线或蛇形， 而只要划—条直线 ?
(3) 接种环 ( 针 ) 接种前后灼烧的目的是什么 ? 为什么在接种前一定要 将其冷却 ? 如何判断灼烧过的接种环已冷却 ?
实验七 霉菌的形态观察
一、目的要求
1. 学习并掌握观察霉菌形态的基本方法。
2. 了解四类常见霉菌的基本形态特征。
二、基本原理
霉菌可产生复什分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及 孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约 3~10 μ m ），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。观察霉菌的形态有多种方法，常用的有下列三种：直接制片观察法：是将培养物置于乳酸石 炭酸棉蓝染色液中，制成霉菌制片镜检。用此染液制成的霉菌制片的特点是：细胞不变形；具有防腐作用，不易干燥，能保持较长时间；能防止孢子飞散；染液的蓝 色能增强反差。必要时，还可用树胶封固，制成永久标本长期保存。载玻片培养观察法：用无菌操作将培养基琼脂薄层置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌 即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置于显微镜下观察。这种方法既可以保持霉菌自然生长状态，还便 于观察不同发育期的培养物。玻璃培养观察法：霉菌的玻璃纸培养观察方法与放线菌的玻璃纸培养观察方法相似 ( 见实验十二 ) 。这种方法用于观察不同生长阶段霉菌的形态，也可获得良好的效果。
三、器材
1. 菌种 ：黑 曲霉 ( Aspergillus sp . ) ， 青霉 ， 黑根霉 ( Rhizopus sp . ) 和毛霉（ Mucor sp. ）培养 2-5d 的马铃薯琼脂平板培养物。
2. 培养基 ： 土豆琼脂或察氏琼脂。
3. 溶液或试剂 ： 乳酸石炭酸棉蓝染色液。
4. 仪器或其他用具 ： 无菌吸管，平皿，载玻片，盖玻片，解剖针，解剖 刀，镊子， 50% 乙醇， 20% 的甘油以及显微镜等。
四、操作步骤
1. 直接制片观察法
在载玻片上加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落边缘处挑取少量已产孢子的霉菌菌丝；先置于 50 ％乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的染液中，用解剖针小心地将菌丝分散开。盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜观察。
挑菌和制片时要细心，尽可能保持霉菌自然生长状态；加盖玻片时勿压入气泡，以免影响观察。
2. 载玻片培养观察法
（ 1 ） 培养小室的灭菌 ： 在平皿皿底铺一张略小于皿底的圆滤纸片，再放一 U 形玻棒，其上放一洁净载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖、包扎后于 121 ℃灭菌 30min ，烘干备用。
（ 2 ） 琼脂块的制作 ： 取已灭菌的马铃薯琼脂 ( 或察氏琼脂 ) 培养基 6~7ml 注入另一灭菌平皿中，使之凝固成薄层。用解剖刀切成 0.5~1cm 2 的琼脂块，并将其移至上述培养室中的载玻片上（每片放两块 ) 。制作过程应注意无菌操作。
（ 3 ） 接种 ： 用尖细的接种针挑取很少量的孢子接种于琼脂块的边缘上，用无菌
镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上。
接种量要少，尽可能将分散的孢子接种在琼脂块边缘上，否则培养后菌丝过于稠密影响观察。
（ 4 ） 培养 ： 先在平皿的滤纸上加 3 ～ 5ml 灭菌的 20 ％甘油（用于保持平皿内的湿度 ) ，盖上皿盖， 28 ℃培养。
（ 5 ） 镜检 ： 根据需要可以在不同的培养时间内取出载玻片置低倍镜下观察，必要时换高倍镜。
五、实验报告
1. 结果
绘图说明四种霉菌的形态特征。
2. 思考题
（ 1 ） 你主要根据哪些形态特征来区分上述四种霉菌？
（ 2 ） 根据载玻片培养观察方法的基本原理，你认为上述操作过程中的哪 些步骤可以根据具体情况作一些改进或可用其他的替代方法？
（ 3 ） 你认为在显微镜下，细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的主要区别是什 么？
实验八 培养基的制备与灭菌
第一部分：培养基的制备
培养基是入工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种类繁多，营 养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。不同 微生物对 pH 要求不一样，霉菌和酵母的培养基的 pH 一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的 pH 一般为中性或微碱性的 ( 嗜碱细菌和嗜酸细菌例外 ) 。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的 pH 调到合适的范围。此外，由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止 其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基的类别如下：
一、 按成分的不同
1. 天然培养基
主要成分是复杂的天然有机物质，如马铃薯、玉米粉、豆饼粉、豆芽汁，牛肉膏，蛋白胨、血清等。这些复杂天然有机物质的成分不完全了解，每次所用的原料，其 中各成分的数量也不恒定。这类培养基是实验室和发酵工厂常用的培养基，例如：牛肉膏蛋白胨培养基，马铃薯培养基，玉米粉、黄豆粉培养基、血琼脂培养基等。
2. 合成培养基
用化学成分完全了解的纯化合物药品配制而成的培养基，因此也称化学成分明确的培养基（ chemically defined medium ），如高氏 I 号培养基、查氏培养基、 M9 培养基等。一般用于研究微生物的形态，营养代谢、分类鉴定、菌种选育、遗传分析等。
3. 半合成培养基
在以天然有机物作为微生物营养来源的同时，适当补充一些成分已知的化学药品所配制的培养基叫半合成培养基。大多数微生物都能在此种培养基上生长，应用广泛。例如常用的马铃薯葡萄糖培养基，很多霉菌都生长良好。
二、按培养基的物理状态分
1. 固体培养基
在液体培养基中加入凝固剂即为固体培养基。实验用的凝固剂有琼脂、琼脂糖、明胶和硅胶，后者用于配制自养微生物的固体培养基。对其他多数微生物来讲，以琼 脂最为合适，一般加入 1.5%~2.5% 即可凝固成固体。此培养基可供微生物的分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏等用。
2. 半固体培养基
在液体培养基中加入少量凝固剂即可为半固体培养基。例如用琼脂作凝固剂时只需加入 0.2%~0.7% 。此种培养基常用来观察细菌运动的特征、菌种保存和噬菌体的分离纯化及制备等。
3. 液体培养基
不含任何凝固剂，配好后成液体状态的培养基。广泛用于微生物的培养，生理代谢和遗传学的研究以及工业发酵等。
三、按培养基的用途分
1. 基础培养基
含有一般细菌生长繁殖需要的基本的营养物质。最常用的基础培养基是天然培养基中的牛肉膏蛋白胨培养基。这种培养基可作为一些特殊培养基的基础成分。
2. 营养培养基（加富培养基）
在基础培养基中加入某些特殊营养物质，如血液、血清、动物（或植物）组织液，酵母浸膏或生长因子等。用以培养对营养要求苛刻的微生物，如培养百日咳杆菌需要含有血液的培养基。
3. 鉴别培养基
是一类含有某种特定化合物或试剂的培养基。某种微生物在这种培养基上培养后，它所产生的某种代谢产物与这种特定的化合物或试剂能发生某种明显的特征性反 应，根据这一特征性反应可以将某种微生物与他种微生物区别开来。主要用于不同微生物的生理生化鉴定。如用来检查细菌能否利用不同糖类产酸产气的糖发酵培养 基和能否产生硫化氢的醋酸铅培养基等。
4. 选择培养基
利用微生物对某种或某些化学物质的敏感性不同，在培养基中加入这类物质，抑制不需要的微生物生长，而利用所需分离的微生物生长，从而达到分离或鉴别某种微 生物的目的。如分离真菌的马丁氏（ Martin ）培养基和既有选择作用又有鉴别作用的远藤氏（ Endo ）培养基等。微生物遗传学研究中用来选择营养缺陷型的培养基以及分子克隆技术中常用的加抗生素 X-gal(5- 溴 -4- 氧 -3- 吲哚 - β -D- 半乳糖苷 ) 的培养基等均属于选择培养基。目前已有各种商品化的“干燥培养基”成品出售。这种培养基是将新鲜配制的液体培养基用喷雾干燥法、真空干燥法、低温干燥法或 蒸发干燥法等将培养基内所含的水分去掉；或将培养基内的各种固形成分，经适当处理、充分混匀，便成干燥粉末而成。使用时只要按比例加入一定量的水，经溶 解、分装，高压蒸气灭菌，即可使用。这种培养基的优点是配制省时，携带方便，使用简易，质量稳定。
第二部分：牛肉膏蛋白胨培养基的制备
一、目的要求
1. 明确培养基的配制原理。
2. 通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。
二、基本原理
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质， 所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和 NaCl 。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而 NaCl 提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下 96 0 C 时溶化，实际应用时，一般在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在 40 ℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将 其 pH 凋至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。
牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：
牛肉膏 3.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
水 1000ml ， pH 7.4-7.6
三、器材
1. 溶液或试剂 ? 牛肉膏，蛋白胨， NaCl ，琼脂， 1 mol ／ LNaOH ， 1mol ／ L HCl 。
2. 仪器或其他用具：试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅， pH 试纸 (pH 5.5-9.0) ，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。
四、操作步骤
1. 称量
按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、 NaCl 放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。
蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。
2. 溶化
在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解 ( 图Ⅴ -1) 。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在制备用三角瓶盛 固体培养基时，一般可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按 1.5%-2.0% 的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间。在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。 同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。
3. 调 pH
在未调 pH 前，先用精密试纸测量培养基的原始 pH ，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入 1 mol ／ L NaOH ，边加边搅拌，并随时用 pH 试纸测其 pH ，直至 pH 达 7.6 。反之，用 1 mol ／ L HCl 进行调节。对于有些要求 pH 较精确的微生物，其 pH 的调节可用酸度计进行（使用方法、可参考有关说明书）。
pH 不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。配制 pH 低的琼脂培养基时，若预先调好 pH 并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性 pH 条件下灭菌，再调整 pH 。
4. 过滤
趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利用某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验勿需过滤）。
5. 分装
按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。
（ 1 ） 液体分装分装高度以试管高度的 1/4 左右为宜。分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角烧瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭 菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。
（ 2 ） 固体分装分装试管，其装量不超过管高 1/5 ，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一般为宜。
（ 3 ） 半固体分装试管一般以试管高度 1/3 为宜，灭菌后垂直待凝。分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。
6. 加塞
培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等），以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能（棉塞制作方法附本实验后面）。
7. 包扎
加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。 三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。（有条件的实验室，可用市售的铝箔代 替牛皮纸，省去用绳扎，而且效果好。 )
8. 灭菌
将上述培养基以 0.103 MPa ， 121 0 C ， 20min 高压蒸气灭菌。
9. 搁置斜面
将灭菌的试管培养基冷至 50 ℃左右 ( 以防斜面上冷凝水太多 ) ，将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜
10. 无菌检查
将灭菌培养基放入 37 ℃的温室中培养 24-28h ，以检查灭菌是否彻底
附：棉塞的制作
棉塞的作用有二：一是防止杂菌污染，二是保证通气良好。因此棉塞质量的优劣对实验的结果有很大的影响。正确的棉塞要求形状，大小，松紧与试管口 ( 或三角烧瓶口 ) 完全适合，过紧则防碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的。加塞时，应使棉塞长度的 1/3 在试管口外， 2/3 在试管口内。如图 V-4 所示。做棉塞的棉花要选纤维较长的，一般不用脱脂棉做棉塞。因为它容易吸水变湿，造成污染，而且价格也贵。做棉塞过程如图 V-5 。图 V-5
此外，在微生物实验和科研中，往往要用到通气塞。所谓通气塞，就是几层纱布（一般 8 层）相互重叠而成，或是在两层纱布间均匀铺一层棉花而成。这种通气塞通常加在装有液体培养基的三角瓶口上。经接种后，放在摇床上进行振荡培养，以获得良好 的通气促使菌体的生长或发酵，通气塞的形状如图 V-6 。图 V-6
五、实验报告
思考题
1. 培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的
2. 在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？
第三部分： 消毒与灭菌
消毒 (disinfection) 与灭菌 (sterilization) 两者的意义有所不同。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体而言，灭菌则是指杀灭一切微生物的营养体，芽孢和孢子。在微生物实验中，需要进行纯培 养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品 等方法。
一、加热法
又分干热灭菌和湿热灭菌两类。
1. 干热灭菌
有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种，接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时的试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌 ( 见图 IV-1) 。涂布平板用的玻棒也可在醮有乙醇后进行灼烧灭菌。通常所说的于热灭菌是在电烤箱内利用高温干燥空气（ 160 ℃ ~170 ℃ ) 进行灭菌，此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。培养基、橡胶制品、塑料制品不能用干热灭菌。
2. 湿热灭菌
（ 1 ） 高压蒸气灭菌法 此法是将物品放在密闭的高压蒸气灭菌锅内 0.l MPa ， 121 ℃保持 15~30min 进行灭菌。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭菌为准。这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭菌，也可用于玻璃器 皿的灭菌。
（ 2 ） 常压蒸气灭菌法 在不具备高压蒸气灭菌的情况下，常压蒸气灭菌是一种常用的灭菌方法。对于不易用高压蒸气灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用常压蒸 气灭菌。这种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸气灭菌器进行灭菌，也可用普通蒸笼进行灭菌。由于常压，其温度不超过 100 0 C ，仅能使大多数微生物被杀死，而芽孢细菌却不能在短时间内杀死，因此可用间歇灭菌以杀死芽孢细菌，达到彻底灭菌的目的。
常压间歇灭菌是将灭菌培养基放入灭菌器内，每天加热 100 ℃， 30min ，连续 3d ，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养物取出放室温下 18 ～ 24h ，使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加热 100 ℃， 30 min ，发育的营养体又被杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。
（ 3 ） 煮沸消毒法 注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般微生物学实验室中煮沸消毒时间为 10 ～ 15 min ，可以杀死细菌所有营养细胞和部分芽孢。如延长煮沸时间，并在水中加入 1% 碳酸氢钠或 2 ％～ 5 ％石炭酸，效果更好。入用注射器和手术器械均采用高压蒸气灭菌或干热灭菌，或采用一次性无菌用品。
（ 4 ） 超高温杀菌 超高温杀菌 (ultra high temperature sterilization, 简称 UHTS) 是指在温度和时间标准分别为 135-150 0 C 和 2 - 8s 的条件下对牛乳或其他液态食品 ( 如果汁及果汁饮料、豆乳、茶、酒及矿泉水等 ) 进行处理的一种工艺，其最大优点是既能杀死产品中的微生物，又能较好地保持食品品质与营养价值。超高温杀菌工艺的应用，使乳制品及各种饮料等无需冷藏的理 想变成了现实。从而打破了地域和季节的限制。
超高温杀菌的基本原理是建立在食品品质及营养成分等，不遭受热力破坏的温度与微生物受热死亡的温度两者之间差异很大这一规律之上的。从图Ⅵ -1 可以看出，在温度上升不到 135 ℃时，杀菌效应和牛乳褐变效应速率之比未发生显著改变，但在 135 ℃以上，该比率发生很大变化，例如在 140 0 C 时，杀菌效应比褐变效应速率增长 2000 倍，在 150 0 C 时增长到 5000 倍，因此利用这样一个显著的差异进行超高温瞬时灭菌，就可实现既不破坏营养成分又能达到灭菌的目的。
超高温杀菌是自 80 年代以来已在世界各国广泛应用。我国自改革开放以来，超高温杀菌也广泛用于橘子汁，猕猴桃汁、荔枝汁、菊花茶、牛乳等生产。
二、过滤除菌
许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热消毒灭菌方法，均会被热破坏，因此采用过滤除菌的方法。应用最广泛的过滤器有： (1) 蔡氏 (Seitz) 过滤器，该滤器是由石棉制成的圆形滤板和一个特制的金属 ( 银或铝 ) 漏斗组成，分上、下两节，过滤时，用螺旋把石棉板紧紧夹在上、下两节滤器之间，然后将溶液置于滤器中抽滤。每次过滤必须用一张新滤板。根据其孔径大小滤板 分为三种型号： K 型最大，作一般澄清用； EK 滤孔较小，用来除去一般细菌； EK-S 滤孔最小，可阻止大病毒通过，使用时可根据需要选用。蔡氏过滤器的结构如图Ⅵ -2 。 (2) 微孔滤膜过滤器，这是一种新型滤器，其滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤维酯的混合物制成的薄膜。孔径分 0.025 ， 0.05 ， 0.10 ， 0.20 ， 0.22 ， 0.30 ， 0.45 ， 0.60 ， 0.65 ， 0.80 ， 1.00 ， 2.00 ， 3.00 ， 5.00 ， 7.00 ， 8.00 和 10.00 μ m 。过滤时，液体和小分子物质通过，细菌则被截留在滤膜上。实验室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般为 0.22 μ m ，但若要将病毒除掉，则需更小孔径的微孔滤膜。微孔滤膜不仅可以用于除菌，还可用来测定液体或气体中的微生物。如水的微生物检查。过滤除菌法应用十分广 泛，除实验室用于某些溶液，试剂的除菌外，在微生物工业上所用的大量无菌空气以及微生物工作使用的净化工作台，都是根据过滤除菌的原理设计的。
三、辐射灭菌
紫外线波长在 200~300nm ，具有杀菌作用，其中以 265~266nm 杀菌力最强。此波长的紫外线易被细胞中核酸吸收，造成细胞损伤而杀菌，紫外线灭菌在微生物工作及生产实践中应用较广，无菌室或无菌接种箱空气可用紫外线灯 照射灭菌。此外，采用 60 Co- γ射线灭菌。也已广泛用于不能进行加热灭菌的纸、塑料薄膜，各种积层材料制作的容器以及医用生物敷料皮等的灭菌。γ射线灭菌的最大优点是：穿透力强，可在 厚包装完好条件下灭菌。
四、化学药品灭菌
化学药品消毒灭菌法是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂，如重金屑离子等，只是阻 抑细菌代谢机能，使细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂，如磺胺类及大多数抗生素等。化学药品对微生物的作用是抑菌还是杀菌以及作用效果还与化学药品浓度的高 低，处理微生物的时间长短，微生物的种类以及微生物所处的环境等有关。
微生物实验室中常用的化学药品有 2 ％煤酚皂溶液 ( 来苏尔 ) ， 0.25 ％新洁尔灭， 0.1 ％升汞， 3%~5 ％的平醛溶液， 75 ％乙醇溶液等。常用化学杀菌剂的应用范围和浓度见表Ⅵ -1 。表Ⅵ -1
消毒与灭菌不仅是从事微生物学和整个生命科学研究必不可少的重要环节和实用技术，而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物制品等各方面均具有重要的应用价 值。根据不同的使用要求和条件选用合适的消毒灭菌的方法。本部分实验主要介绍几种常用的方法，包括干热灭菌法，高压蒸气灭菌法，紫外线照射法，微孔滤膜 法。关于常用的化学灭菌法，主要涉及药物的种类和使用浓度，对微生物生长的抑制和灭活作用。
第四部分： 高压蒸气灭菌
一、目的要求
1. 了解高压蒸气灭菌的基本原理及应用范围。
2. 学习高压蒸气灭菌的操作方法。
二、基本原理
高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽， 然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于 100 ℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低 ( 表 VI-2) ，二是湿热的穿透力比干热大 ( 表 VI-3) ，三是湿热的蒸气有潜热存在。 1g 水在 100 ℃时，由气态变为液态时可放出 2.26kJ （千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下， 含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见 ( 表 VI-4) 。表 VI-2 、 VI-3 、 VI-4
—般培养基用 0.1MPa( 相当于 15Ib ／ in 2 或 1.05kg ／ cm 2 ) ， 121.5 ℃， 15-30min 可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用 0.06MPa (8 Ib ／ in 2 或 0.59 kg ／ cm 2 )112.6 ℃灭菌 15min ，但为了保证效果，可将其他成分先行 121.3 ℃， 20min 灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以 0.1MPa ， 121 . 5 ℃灭菌 20min 即可，而盛于大瓶内的培养基最好以 0.1 MPa ， 122 ℃灭菌 30 min 。
实验中常用的非自控高压蒸气灭菌锅有卧式 ( 图Ⅵ -4 ， A) 和手提式 ( 图Ⅵ -4 ， B) 二种。其结构和工作原理相同，本实验以手提式高压蒸气灭菌锅为例，介绍其使用方法。有关自控高压蒸气灭菌锅 (autoclave) 的使用可参照厂家说明书。图Ⅵ -4 ， A 、图Ⅵ -4 ， B
三、器材
牛肉膏蛋白胨培养基，培养皿（ 6 套一包），手提式高压蒸气灭菌锅等。
四、操作步骤
1. 首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。
切勿忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。
2. 放回内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
3. 加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧—致，勿使漏气。
4. 用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。当锅内压力 升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用 0.1 MPa ， 121.5 ℃ ， 20 min 灭菌。灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。
5. 灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“ 0 ” 时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。
压力一定要降到“ 0 ”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。
6. 将取出的灭菌培养基放入 37 ℃ 温箱培养 24h ，经检查若无杂菌生长，即可待用。
五、实验报告
1. 结果
检查培养基灭菌是否彻底。
2. 思考题
(1) 高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为 什么待压力降低“ 0 ” 时才能打开排气阀，开盖取物 ?
(2) 在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素 ?
(3) 灭菌在微生物实验操作中有何重要意义？
(4) 黑曲霉的孢子与芽孢杆菌的胞子对热的抗性哪个最强 ? 为什么 ?
实验九 放线菌形态的观察
一、目的要求
1. 学习并掌握观察放线菌形态的基本方法。
2. 初步了解放线菌的形态特征。
二、基本原理
放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝 ( 简称“基丝” ) ，基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝 ( 简称“气丝” ) ，并进一步分化产生孢子丝及孢子。有的放线菌只产生基丝而无气丝。在显微镜下直接观察时，气丝在上层、基丝在下层，气丝色暗，基丝较透明。孢子丝依种类的 不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。在油镜下观察，放线菌的孢子有球形、椭圆、杆状或柱状。能否产生菌丝体及由菌丝体分化产生的各种形态特征是放线菌分 类鉴定的重要依据。为了观察放线菌的形态特征，入们设计了各种培养和观察方法，这些方法的主要目的是为了尽可能保持放线菌自然生长状态下的形态特征。本实 验介绍其中几种常用方法。
扦片法：将放线菌接种在琼脂平板上，扦上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻上。观察时，轩轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的形态。
玻璃纸法：玻璃纸是一种透明的半透膜，将灭菌的玻璃纸覆盖在琼脂平板表然后将放线菌接种于玻璃纸上，经培养，放线菌在玻璃纸上生长形成菌苔。观察时，揭下玻璃纸，固定在载玻片上直接镜检。这种方法既能保持放线菌的自然生长状态，也便于观察不同生长期的形态特征。
印片法；将要观察的放线菌的菌落或菌苔，先印在载玻片上，经染色后观察。这种方法主要用于观察孢子丝的形态、孢子的排列及其形状等。方法简便、但形态特征可能有所改变。
三、器材
1 菌种 ： 细黄链霉菌 ( Streptomyces microflavus ) 或青色链霉菌 ( S. glaucus ) ，弗氏链霉菌 ( S. fradiae ) 。
2 培养基 ： 灭菌的高氏 1 号琼脂。
3 仪器或其他用具 ： 经灭菌的：平皿、玻璃纸、盖玻片、玻璃涂棒，以及载玻片，接种环，接种铲，镊子，石炭酸复红染液，显微镜等。
四、操作步骤
1 . 扦片法
(1) 倒平板 ： 取融化并冷至大约 50 ℃ 的高氏 1 号琼脂约 20ml 倒平板，凝固待用。
(2) 接种 ： 用接种环挑取菌种斜面培养物（孢子）在琼脂平板上划线接种。划线要密些，以利扦片。
(3) 扦片：以无菌操作用镊子将灭菌的盖玻片以大约 45 °角扦入琼脂内 ( 扦在接种线上 ) ，扦片数量可根据需要而定。
(4) 培养 ： 将扦片平板倒置， 28 o C 培养，培养时间根据观察的目的而定，通常 3-5d 。
(5) 镜检 ： 用镊子小心拔出盖玻片，擦去背面培养物，然后将有菌的一面朝上放在载玻片上，直接镜检。
观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，再换高倍镜观察。如果用0.1% 美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察，效果会更好。
2 . 玻璃纸法
(1) 倒平板 ： 同扦片法。
(2) 铺玻璃纸 ： 以无菌操作用镊子将已灭菌 (155~ 160 ℃ 干热灭菌 2h) 的玻璃纸片（似盖玻片大小 ) 铺在培养基琼脂表面，用无菌玻璃涂棒 ( 或接种环 ) 将玻璃纸压平，使其紧贴在琼脂表面，玻璃纸和琼脂之间不留气泡。每个平板可铺 5 ～ 10 块玻璃纸。也可用略小于平皿的大张玻璃纸代替小纸片，但观察时需要再剪成小块。
(3) 接种 ： 用接种环挑取菌种斜面培养物 ( 孢子 ) 在玻璃纸上划线接种。
(4) 培养 ： 将平板倒置， 28 0 C 培养 3-5d 。
(5) 镜检 ： 在洁净载玻片上加一小滴水，用镊子小心取下玻璃纸片，菌面朝上放在玻片的水滴上，使玻璃纸平贴在玻片上 ( 中间勿留气泡 ) ，先用低倍镜观察，找到适当视野后换高倍镜观察。
操作过程，勿碰动玻璃纸菌面上的培养物。
3 . 印片法
(1) 接种培养 ： 用高氏 I 号琼脂平板，常规划线接种或点种， 28 0 C 培养 4 ～ 7d 。也可用上述两种方法所使用的琼脂平板上的培养物，作为制片观察的材料。
(2) 印片 ： 用接种铲或解剖刀将平板上的菌苔连同培养基切下一小块，菌面朝上放在一载玻片上。另取一洁净载玻片置火焰上微热后，盖在菌苔上，轻轻按压，使培养物 ( 气丝、孢子丝或袍子 ) 粘附 ( “印” ) 在后一块载玻片的中央，有印迹的一面朝上，通过火焰 2-3 次固定。
印片时不要用力过大压碎琼脂，也不要错动，以免改变放线菌的自然形态。
(3) 染色 ： 用石炭酸复红覆盖印迹，染色约 1min 后水洗。
(4) 镜检：干后用油镜观察。
五、实验报告
1 . 结果
绘图说明你所观察到的放线菌的主要形态特征。
2 . 思考题
(1) 试比较三种培养和观察放线菌方法的优缺点。
(2) 玻璃纸培养和观察法是否还可用于其他类群微生物的培养和观察 ? 为什么 ?
(3) 镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝 ?
实验十 . 微生物的纯种分离培养
第一部分：微生物的分离与纯化
一、目的要求
掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。
二、基本原理
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的方法有：
简易单细胞挑取法 ： 它需要特制的显微操纵器或其他显微技术，因而其使用受到限制。简易单孢子分离法是一种不需显微单孢操作器，直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方 法。它采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬浮液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴。将只含有一个萌发孢子的微滴放一小块营养琼脂片，使其 发育成微菌落。再将微菌落转移到培养基中，即可获得仅由单个孢子发育而成的纯培养。
平板分离法 ： 该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理包括两方面： 1. 选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种
抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
2. 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板 或平板划线等技术完成。值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合 显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用三种不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。
三、器材
1. 菌种：米曲霉 ( Aspergillus oryzae ) 。
2. 培养基：淀粉琼脂培养基 ( 高氏 I 号培养基 ) ，牛蹂高蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，
查氏琼脂培养基。
3. 溶液或试剂： 10 ％酚，盛 9ml 无菌水的试管，盛 90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶， 4 ％水琼脂。
4. 仪器或其他用具 无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板等。
四、操作步骤
1. 稀释涂布干板法
(1) 倒平板 将肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏 I 号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基加热溶化，待冷至 55 ～ 60 ℃ 时，高氏 I 号琼脂培养基中加入 10 ％酚数滴，马丁氏培养中加入链霉素溶液 ( 终浓度为 30 μ g ／ m1) ，混均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿：
倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔 出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手撑边缘或小指与无名指夹住管 ( 瓶 ) 塞 ( 也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中 ) 。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约 15ml ，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
(2) 制备土壤稀释液 ：称取土样 10g ，放入盛 90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约 20min ，使土样与水充分混合，将细胞分散。用一支 1ml 无菌吸管从中吸取 1 ml 土壤悬液加入盛有 9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取 lml( 无菌操作 ) 加入另一盛有 9ml 无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成 10 -1 、 10 -2 、 10 -3 、 10 -4 、 10 -5 、 10 -6 不同稀释度的土壤溶液。
涂布 ： 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上 10 -4 、 10 -5 和 10 -6 三种稀释度，然后用无菌吸管分别由 10 -4 、 10 -5 和 10 -6 三管土壤稀释液中各吸取 0.1ml 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒按所示，在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置 5 ～ 10min ，使菌液吸附进培养基。平板涂布方法：将 0.1ml 菌悬液小心地滴在平板培养基表面中央位置 (0.1 ml 的菌液要全部滴在培养基上，若吸移管尖端有剩余的，需将吸移管在培养基表面上轻轻地按一下便可 ) 。右手拿无菌涂棒平放在乎板培养基表面上，将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直线来回推动，
平板内边缘处可改变方向用涂棒再涂布几次。
(4) 培养 ： 将高氏 I 号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于 28 0 C 温室中培养 3 ～ 5d ，肉膏蛋白胨平板倒置于 37 0 C 温室中培养 2-3d 。
(5) 挑菌落 ： 将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基的斜面上，分别置 28 ℃ 和 37 ℃ 温室培养，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯 培养。
2. 平板划线分离法
(1) 倒平板 按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期。
(2) 划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述 10 -1 的土壤悬液一环在平板上划线 ( 见图 Ⅶ -5) 。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种：
① 用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线 3-4 条，再转动培养皿约 70 0 角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分作第 四次平行划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。
② 将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。
（ 3 ） 挑菌落 同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。
3. 简易单孢子分离法
（ 1 ） 厚壁磨口毛细滴管的制备 ： 截取一段玻璃管，在火焰上烧红所要拉细的区域，然后用镊子夹住其尖端，在火焰上拉成很细的毛细管。从尖端适当的部位割断，用砂轮或砂纸仔细湿磨，使管口平 整、光滑（毛细滴管要求达到点样时出液均匀、快速，每微升孢子悬液约点 50 微滴，每滴的大小略小于低倍镜的视野）。 （ 2 ） 分离小室的制备 取无菌培养皿（ D9cm) 倒入约 10ml 4 ％水琼脂作保湿剂。在皿盖上用记号笔（最好用红色）如图所示画方格。待凝后倒置于 37 ℃恒温箱烘数小时，使皿盖干燥。
（ 3 ） 萌发孢子悬液的制备
① 孢子悬液的制备 用接种环挑取米曲霉孢子数环接入盛有 10ml 查氏培养液及玻璃珠的无菌三角瓶中，振荡 5~10min ，使孢子充分散开。
② 过滤 用无菌漏斗（塞棉花）或自制的过装置将上述充分散开的孢子液过滤，收集过滤液。
③ 孢子萌发 ： 将孢子过滤液用血球计数板测定孢子的浓度 ( 此处可由教师准备 ) ，再用查氏培养液调整孢子液至 0.5~1.5x10 6 个孢子／毫升后置 28 0 C 培养 8h 。
④ 点样 ： 用无菌自制的厚壁磨口毛细管吸取萌发孢子液少许，快速轻巧地点在培养皿的内壁的方格中，每微滴面积略小于显微镜低倍镜视野，依次将每方格点上萌发孢子液，成为分离小室。最后将皿盖小心快速翻过来，盖在原来的平板上。
⑤ 镜检 ：将点样的分离小室平板放在显微镜镜台上，用低倍镜逐个检查皿盖内壁上的微滴。如果观察到某微滴内只有一个萌发孢子时用记号笔在皿盖上作记号。
⑥ 加薄片培养基：取少量查氏琼脂培养基倒入无菌培养皿（培养皿先置 45 0 C 预热）中制成薄层平板，待其凝固后哟无菌小刀片将平板琼脂切成若干小片（其面积应小于培养皿盖上所画小方格的面积），然后挑一小片放在作有记号的单孢子微滴上，
⑦ 培养：将分离小室平板置 28 ℃培养 24h ，直至单孢子形成微菌落。
⑧ 转种：用无菌微型小刀小心地挑取长有微菌落的琼脂薄片移至新鲜的查氏培养基斜面或液体培养中，置 28 ℃培养 4-7d ，即可获得由单孢子发育面成的纯培养。
五、实验结果
1. 结果
（ 1 ） 你所做的涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是，请分析其原因并重做。
（ 2 ） 在三种不同的平板上你分离得到哪些类群的微生物 ? 简述它们的菌落特征。
2. 思考题
(1) 如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养 ? 请写出实验的主要步骤。
(2) 分离单孢子前为什么先使孢子萌发 ?
(3) 如果要分离得到极端嗜盐细菌，在什么地方取样品为宜？并说明其理由。
(4) 如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产高温蛋白酶的菌株，你将如何完成，请写出简明的实验方案 ( 提示：产蛋白酶菌株在酪素平板上形成降解酪素的透明圈 ) 。
(5) 为什么高氏 I 号培养基和马丁氏培养基中要分别加入酚和链霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培养基分离一种对青霉素具有抗性的细菌，你认为应如何做 ?
第二部分：平板菌落计数
一、目的要求
学习 菌种的 平板菌落计数的基本原理和方法。
二、基本原理
平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的 稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取 样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的 2~3 或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低，为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位（ colony-forming units,cfu ）而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水（包括水源水）等的含菌指数或污染程度的检测。
三、器材
1 ． 菌种：大肠杆菌菌悬液。
2 ． 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。
3 ． 仪器或其他用具 1ml 无菌吸管，无菌平皿，盛有 4.5ml 无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。
四、操作步骤
1 ． 编号
取无菌平皿 9 套，分别用记号笔标明 10-4 、 10-5 、 10-6 （稀释度）各 3 套，另取 6 支盛有 4.5ml 无菌水的试管，依次标是 10-1 、 10-2 、 10-3 、 10-4 、 10-5 、 10-6 。
2 ． 稀释
用 1ml 无菌吸管吸取 1ml 已充分混匀的大肠杆菌菌悬液（待测样品），精确地放 0.5ml 至 10-1 的试管中，此即为 10 倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。
将 10-1 试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支 1ml 吸管插入 10-1 试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太
快，吸时吸管伸入管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取 10-1 菌液 1ml ，精确地放 0.5ml 至 10-2 试管中，此即为 100 倍稀释。 ······ 其余依次类推，整个过程如图Ⅷ -3 所示。
放菌液时吸管不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。
3 ． 取样
用三支 1ml 无菌吸管分别吸取 10-4 、 10-5 和 10-6 的稀释菌悬液各 1ml ，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放 0.2ml 。
不要用 1ml 吸管每次只靠吸管尖部吸 0.2ml 稀释菌液放入平皿中，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。
4 ． 倒平板
尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至 45 ℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基约 15 毫升 / 平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。
由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并已冷却至 45 ℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。
待培养基凝固后，将平板倒置于 37 ℃恒温培养基中培养。
5 ． 计数
培养 48h 后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：
每毫升中菌落形成单位（ cfu ） = 同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数× 5
一般选择每个平板上长有 30~300 个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适，同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复三个对照平板 不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。由 10-4 、 10-5 和 10-6 三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。
平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的，一般三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后，所出现的平均菌落数在 50 个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。
平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式在外，还可以用涂布平板的方式（见实验二十 四）进行。二者操作基本相同，所不同的是后者先将牛肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板，待凝固后编号，并于 37 ℃左右的温箱中烘烤 30 分钟，或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快渗入培养基表层内，然后倒置 37 ℃的恒温箱中培养 24~48h 。
涂布平板用的菌悬液一般以 ?0.1ml 较为适宜，如果过少，菌液不易涂布开；过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。
五、实验报告
1 ． 结果
将培养后菌落计数结果填入下表：
稀释度
10-4
10-5
10-6
1
2
3
平均
1
2
3
平均
1
2
3
平均
Cfu 数 / 平板
每毫升中的 cfu 数
2 ． 思考题
（ 1 ）为什么融化后的培养基要冷却至 45 ℃左右才能倒平板？
（ 2 ）要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？
（ 3 ）试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。
（ 4 ）当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里？
（ 5 ）用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同？为什么要培养较长时间（ 48h ）后观察结果？
主要参考书
1. 沈萍、范秀容 . 《微生物学实验》第三版 . 高等教育出版社 ,1999 年 .
2. 赵斌、何绍江 . 《微生物学实验》 . 科学出版社 ,2002 年 .
3. 钱存柔、黄仪秀 . 《微生物学实验教程》 . 北京大学出版社 ,1999 年 .
4. 黄秀梨 . 《微生物学实验指导》 . 高等教育出版社 ,1999 年 .