tvb方世玉:WATERS高效液相的标准操作规程（SOP）试用稿

WATERS高效液相的标准操作规程（SOP）试用稿     

制定人：   适用于本教研室所有使用此仪器者

1 流动相的处理

1.1 过滤溶剂

溶剂在使用前一定要用0.5μm的过滤器过滤，如果使用固体化学试剂（缓冲盐）配制流动相，过滤特别重要，不能让固体微粒污染泵，阻塞进样器和柱头过滤片。本实验室有水溶性和脂溶性两种过滤膜供选择（反光面朝上），过滤水溶性流动相时（如甲醇/水），先用1-2ml甲醇润湿过滤膜，有助于快速抽滤。

1.2 保持储液瓶的清洁

用普通溶剂瓶作流动相储液器应不定期废弃瓶子，最后一次应用HPLC级的水或溶剂清洗，不能在清洗过程中留下污迹。

1.3 保证溶剂的质量

一定要用HPLC级的溶剂，水也应达到HPLC级，同样也要使用高纯度的缓冲盐。

1.4 故障及解决方法

1.4.1  流动相脱气不充分

流动相受热，或者流动相不同组分混合时会有气体产生，气泡进入泵内引起压力波动，增加噪音，色谱图上出现毛刺。可试用下列方法解决问题：流动相再脱气；采用更有效的脱气方法或两种方法配合使用；改系统内混合为系统外预混合。

1.4.2  流动相供给不畅

流动相用完，管道中吸入气体引起泵压力不稳。应经常观察储液器中流动相的量，加足流动相保证所有的样品分析完毕。输液管道上装沉子沉至瓶底，储液器盖上留一小孔正好夹住进液管，使其不能上下移动。

过滤器阻塞引起管道和泵腔空化，压力不稳。过滤器被微粒所阻塞或长霉，去掉过滤器后如果系统运转正常，说明已找出问题，换上新的过滤器则可。有时候换上新的过滤器仍然不畅，那就需要查查流动相的制备过程，或者换大孔径的过滤器。不管如何，流动相都需要重新过滤。

流速过高、阻力大，造成空化现象，这是由于过滤器孔径、管道内径、流速和溶剂黏度等引起的。如果流速大于10ml/min，常会出现这种现象。使用下列方法解决：（1）使用低流速；（2）换大孔径的过滤器；（3）增加进液管道内径；（4）抬高或加压储液器；（5）不用过滤器，但流动相一定要先过滤；（6）储液器盖子太紧，在储液器内形成真空，打出的流动相不连续。应松开盖子或留有1mm的缝隙；（7）进液管道阻塞或弯曲使泵抽不到液，注意调整进液管道或更换新的。其它问题包括渗漏或接头松动、泵部件损坏等，都能引起供液不正常。

1.4.3  流动相和储液器被污染

由于污染，噪音越来越大，检测器基线上升。污染物可能被泵以稳定的浓度打入系统，而再以稳定的浓度流出来，所以在色谱图中不出多余的峰。用梯度洗脱时弱流动相可以使污染物聚在柱顶，流动相强度增加后污染物可能被洗脱出来一个大的伪峰。有时基线噪音突然增大或突然提高，都是因为反复加进新的流动相或系统用得太久（通宵）所造成的。新加进的流动相有污染物或者流动相长霉，繁殖了细菌。

脏的储液器会污染清洁的流动相。每种流动相备有专用的储液器，或者定期报废储液器。

流动相污染来自这几个方面：试剂质量不高，玻璃器皿不合格；微生物的影响；配制流动相时操作不当等。因此要求高纯度化学试剂和HPLC级溶剂。玻璃器皿按规定清洗干净。为防止微生物生长，每天要用甲醇清洗系统。怀疑系统内生长了微生物，可用稀硝酸冲洗既可（注意不要损坏柱和管道系统）

真空脱气时防止泵油带入流动相。用清洁的惰性塞子、搅棒、过滤器和玻璃器皿配制流动相。已经污染的流动相一定要废弃掉。

2仪器组成及电源

本系统可进行多达四元溶剂的梯度洗脱操作

2.1 仪器组成 本系统由Waters 600E 多溶剂输送系统，四通道在线过滤，7725i进样器，996型二极管阵列检测器，联想品牌机等单元组合而成。

2.2 电源 仪器使用时按泵、检测器、打印机和计算机的顺序，依次接通电源。

3  600E高压输液泵的操作

3.1 液相色谱系统泵的流速在0.1-10.0ml/min之间，要保持泵的良好操作性能，必须维护系统的清洁，保证溶剂和试剂的质量，流动相的过滤和流动相的脱气。下面列出预防泵故障的注意事项：（1）用高质量的试剂和HPLC级溶剂；（2）过滤流动相和溶剂；（3）脱气；（4）工作时使用泵头的排水孔不停的用10%甲醇/水的混合溶剂冲洗柱塞杆；（5）不让水和腐蚀性溶剂滞留在泵中；（6）定期更换垫圈；（7）加润滑油。处于良好操作状态的泵，应该使色谱图上的基线平稳，保留时间的重复性良好。等度洗脱时压力波动小于±2%。梯度洗脱时压力变化应是缓慢和平稳的。

3.2  常规准备工作 包括：开通电源，溶剂脱气，泵头及溶剂管路除气泡及泵的启动。

3.2.1 接通系统电源，控制器开通后进行自检，数秒后通过，接受操作指令。

3.2.2 溶剂瓶脱气 打开四通道在线过滤器，脱气15min。

3.2.3 系统中气泡的排除 泵启动时，调节所需要的通道流速为1ml/min，该通道如A调节为100%。将抽液阀旋至draw位，用针筒抽A液10ml，将抽液阀旋至inject位，并推出针筒中的液体，将抽液阀旋至run位。此时参比阀排出的液体应连续，如不连续则重复以上抽液排液操作。重复以上操作分别抽取B，C，D液10ml。将流速减小至0.2ml/min，将参比阀关闭。柱前气泡如不能排除，则管路在不与色谱柱连接的情况下，提高流速至9ml/min，数分钟后将流速减至1ml/min。

3.3 等度（Isocratic）操作 按direct键，进入isocratic菜单。依次设定流路配比，氦气流速，柱温。设定方法如下：按光标移动键，至闪烁光标出现在所需设定位置上。用数字键设定数值，按enter键确认，注意每个流动相其组成之和应为100%，设定流速为0.1ml/min，逐渐增加流速至实验所需的流量，待系统平衡后开始实验。

3.4 梯度（Gradient）洗脱操作 梯度洗脱需要编制梯度表和程序事件（Program event）表，在OPERATE GRADIENT屏幕时运行。按program method键，进入梯度编辑窗口。移动光标键至table #处，输入数字键(1-15)，按enter键，将光标移至梯度表第一行，依次输入流速和流量配比，分别按enter键确认。光标移至第二行，依次输入梯度时间，流速，配比及曲线号(1-11)，重复以上操作，至梯度表全部编完，按显示屏对应功能键save，并记住table #。按Program event键，进入程序事件表的编制，移动光标键至table #处，输入数字键(1-15)，按enter键，将光标移至事件表第一行，依次输入事件号(1-10)和开关，按enter键确认，光标移至第二行，依次输入事件时间，事件号，和开关，按enter键确认，重复以上过程至事件表完成，按save键储存。

3.5 梯度程序的运行 按operate methods键，进入梯度方法运行窗口，将光标移至table处，输入欲运行的表号(1-15)，按显示屏对应功能键start run，运行。在设置时，如有疑问，可用HELP提示每个设置的含义。

3.6 实验结束 对泵进行冲洗后，关闭流量，注意流速必须要逐步变化。冲洗顺序:如果使用有缓冲液的流动相，则停泵前一定要用HPLC级纯水清洗HPLC系统。同时用清水清洗柱塞杆。若停泵存放时间超过一天，则停泵前还需用水/甲醇清洗系统。

3.7 关闭电源开关。

4 进样

4.1 采用7725i手动进样器，进样环（loop）体积为20μl，上样量在10~20μl时，进样体积必须大于loop体积的3-5倍，才能得到好的重现性，上样量小于10μl时，可以用10μl的微量进样器直接进样。进样后，快速旋转进样器的把柄，直接把样品进到色谱柱的柱头。

4.2 在做标准曲线时，进样浓度应由低到高。

5 信号检测及数据处理

5.1 本系统用996型二极管阵列检测器，波长范围在190-800nm，接受全波长光谱。在分析过程中测定吸收信号由计算机进行处理，显示色谱图或光谱图，列出数据处理结果。测量结束时按规定退出程序后关机。

5.2 点灯，指示灯亮。诊断，检查校准。状态灯点亮，处于准备状态。稳定1小时后可以用于采集数据。

5.3 常规准备工作  按色谱仪、检测器、打印机及计算机顺序接通电源。

5.4 进入Millennium32菜单，按Login，输入User Name and Pass Word后，按OK。

5.5 按Configure System进入子菜单，在建New chromatography System， 先删旧的，单击Project ，建New chromatography System，选择所需要的W600，及检测器（PDA or ELSD）,输入System Name，按Finish。

5.5 使用Run Sample窗口可采集处理和报告数据

5.5.1 从Millennium32 登录窗口，双击Run Sample。

5.5.2 从Run Sample 对话框，选择色谱系统并单击确定，将建立BusLAC/E连接。

5.5.3 从菜单条中选择Edit>New Method Set单击Yes。

5.5.4 单击New Create以创建新仪器方法。屏幕上显示Edit Instrument Method。单击各仪器。

以编辑仪器参数，然后选择File>Save As以命名、标记（约束应用环境）并保存方法。然后选择File>Exit。

5.5.5 出现Select Instrument Method对话框。选择刚刚创建的方法，然后单击Next。向导将提示用户输入适用于方法的信息。

5.5.6 Method Set Editor对话框将出现。核实信息，然后选择File> Exit。

5.5.7 在Run Sample对话框中，单击Sample选项卡，在样品表中输入样品信息。使用水平滚动条访问每行中的所有信息。

5.5.8 单击工具条上的 （Amounts），为各标准样品瓶输入组份名称和浓度。选择File> Exit，返回Run Sample。

5.5.9 核实运行模式是否设置成Run And Process或Run And Report。如有必要，使用下拉列表更改该条目。

5.5.10 选择File> Save Sample Set Method以保存方法。

5.5.11 使用Intrument Method下拉列表选择仪器方法。单击设置。

5.5.12 要收集数据，请单击工具条上的 （绿灯）。

5.6 使用处理向导创建处理方法

5.6.1 从Millennium32 登录窗口，双击Browse Project。选择要使用的Project

5.6.2 单击通道选项卡，然后单击工具条上的 （Review）。出现查看屏幕。

5.6.3 单击工具条上的 （Process Method Wizard），然后单击确定。从下拉列表中选择适当的处理类型，然后单击确定。向导将引导您逐步完成积分和校正参数的设置。

5.6.4    要在处理方法中输入某组份的多个浓度，或给它添加高级积分，请选择View> 处理方法布局

5.6.5 选择File>Save As> Method Set，将该处理方法保存为方法组的一部分。

5.7 查看结果

5.7.1 在Project窗口中，单击Result选项卡

5.7.2 加亮显示感兴趣的样品（未知样或标准样），然后单击Review图标。查看窗口显示色谱、保留时间和组份名称。

5.7.3 单击窗口底部状态条中的Peak选项卡，显示峰信息。对于PDA 数据，如果在处理方法中选择了Peak Purity和Library，则会显示此两者的信息。

5.7.4 要查看校正曲线，请选择Window> Calibration。

5.7.5 要查看结果的所有详细信息，请选择Window> Result。

5.7.6 要打印结果，请从Project窗口单击Result选项卡，然后选择要打印的结果。单击 （打印），选择所需报告，然后单击确定。