乙硫基四氮唑:基因工程在亲子鉴定方面的应用

【摘要】日益成熟的基因在给社会带来进步的同时也给人们的生活带来了方便。基因工程诞生的意义不亚于历史上任何一次工业革命。基因工程主要应用于以下几个方面：1、医药卫生。包括生产基因工程药品、基因诊断和基因治疗。2、农牧业、食品工业方面。3、环境保护的应用。主要是环境监测和环境净化等。下面笔者主要谈一下基因工程在亲子鉴定方面的应用。

【关键字】亲子鉴定   STR  PCR  琼脂糖凝胶电泳    DNA测序仪    血缘关系

【正文】DNA鉴亲子鉴定就是利用医学、生物学和遗传学的理论和技术，从子代和亲代的形态构造或生理机能方面的相似特点，分析遗传特征，判断父母与子女之间是否是亲生关系。 亲子鉴定在中国古代就已有之，如滴骨验亲，滴血验亲等。

一、DNA鉴定的准确性

传统的血清方法能检测红细胞血型、白细胞血型、血清型和红细胞酶型等，这些遗传学标志为蛋白质（包括糖蛋白）或多肽，容易失活而导致检材得不到理想的检验结果。此外，这些遗传标志均为基因编码的产物，多态信息含量（PIC）有限，不能反映DNA编码区的多态性，且这些遗传标志存在生理性、病理性变异（如A型、O型血的人受大肠杆菌感染后，B抗原可能呈阳性。因此，其应用价值有限。

DNA检验可以弥补血清学方法的不足，其中STR位点和单核苷酸（SNP）位点检测分别是第二代、第三代DNA分析技术的核心，是继VNTRs（可变数量串联重复序列多态性）研究而发展起来的检测技术。作为最前沿的刑事生物技术，DNA分析为法医物证检验提供了科学、可靠和快捷的手段，使物证鉴定从个体排除过渡到了可以作同一认定的水平，DNA检验能直接认定犯罪、为凶杀案、强奸杀人案、碎尸案、强奸致孕案等重大疑难案件的侦破提供准确可靠的依据。随着DNA技术的发展和应用，DNA标志系统的检测将成为破案的重要手段和途径。此方法作为亲子鉴定已经是非常成熟的，也是国际上公认的最好的一种方法，准确率达99.99%。

SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。

SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。这种变异可能是转换(C T，在其互补链上则为G A)，也可能是颠换(C A，G T，C G，A T)。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3，其它几种变异的发生几率相似。 在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP(coding SNP,cSNP)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。 SNP自身的特性决定了它更适合于对复杂性状与疾病的遗传解剖以及基于群体的基因识别等方面的研究：

STR(short tandem repeat，短片段重复序列)又称微DNA.广泛存在于人类及哺乳动物的基因组中，具有高度多态性，它们一般由2-6个碱基构成一个核心序列，人类一般是（CA/GT）n,简称(CA)n核心序列串联重复排列，由核心序列重复数目的变化产生长度多态性。对于一个特定的个体，染色体上某个特定位置的重复序列的重复次数是固定的，而对于不同的个体在同一位置处的重复次数可能不同，这就构成了人群中这些重复序列的多态性。由于人类基因组中这种重复序列非常多，通过对这种多态性的检测，就可以明确区分个体与个体的不同，确定父母子的亲缘关系。

二、DNA亲子鉴定的原理

1、理论基础

通过遗传标记的检验与分析来判断父母与子女是否亲生关系，称之为亲子试验或亲子鉴定。DNA是人体遗传的基本载体，人类的染色体是由DNA构成的，每个人体细胞有23对（46条）成对的染色体，其分别来自父亲和母亲。夫妻之间各自提供的23条染色体，在受精后相互配对，构成了23对（46条）孩子的染色体。如此循环往复构成生命的延续

由于人体约有30亿个核苷酸构成整个染色体系统，而且在生殖细胞形成前的互换和组合是随机的，所以世界上没有任何两个人具有完全相同的30亿个核苷酸的组成序列，这就是人的遗传多态性。尽管遗传多态性的存在，但每一个人的染色体必然也只能来自其父母，这就是DNA亲子鉴定的理论基础 

2、原理

不同个体中，STR核心序列的重复次数不同。根据子代的两条DNA一条来自于父方一条来自于母方，其子代某一特定DNA分子上STR核心序列重复次数必定与父母相同。通过设计引物，运用PCR技术进行DNA扩增，采用琼脂糖凝胶电泳技术分理出微卫星DNA片段。利用微卫星DNA探针于不同个体的DNA分子杂交，就会呈现出各自特有的杂交图谱

三、方法步骤

方法一：DNA测序法

步骤：

1、样本的选择

DNA检测样本很多。一般来说，人体的任何组织或分泌物都可以做。DNA样品收集主要采用抽少量静脉血或者末梢血或者收集口腔上皮细胞。此外，我们也可以进行头发、组织、血迹、胎儿之绒毛等特殊样本的DNA鉴定。

2、DNA的提取

CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖留在溶液中。在高离子浓度下，CTAB与蛋白质和除大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，但不能沉淀核酸。在一定的盐浓度下，DNA、蛋白质与多糖在CTAB溶液中溶解度不一样而达到去多糖的目的。生物体内的DNA与蛋白质结合在一起，提取时需除去其结合的蛋白质，然后再将DNA与RNA分开，并进一步纯化。此外需抑制 DNAase 的活性以防DNA被降解。基本环节：

．破碎细胞壁以释放细胞内容物

．破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中

．DNA释放后，尽量确保DNA的完整性

．去除杂质（大量的RNA、蛋白质、多糖、单宁和色素等）

3、PCR扩增

〔1〕预变性 〔2〕 变性  〔3〕退火 〔4〕 延伸   （2~4步循环30次） 〔5〕延伸

4、琼脂糖凝胶电泳

5、挖胶

6、回收试剂盒回收DNA片段

7、与特定质粒形成重组DNA分子

8、导入大肠杆菌，筛选白斑

9、提取质粒DNA

10、DNA测序

方法二：Southern杂交法

步骤：

1、样本的选择

2、DNA的提取

3、PCR扩增

4、琼脂糖凝胶电泳

5、转膜—进行Southern杂交（探针设计）—洗膜—晾干—包（用保鲜膜）—压X光片（-20度—-70度保存3到7天）—冲洗—观察杂交图谱（全自动条带分析系统）

注：探针设计将微卫星DNA核心序列（CA)n串联起来，—PCR扩增（加入P32标记的dNTP) —电泳—挖胶—回收试剂盒回收DNA片段—导入载体形成重

组DNA分子—导入大肠杆菌—选择白斑—一部分培养保存，一部分提取质粒DNA—测序—作为探针

五、结果分析

方法一：电泳分离片段后，通过放射自显影技术检测单链DNA片段的放射性带，就可以直接读出DNA的核苷酸序列。如果小孩的遗传位点和被测试男子的位点超过3个不一致，那么该男子便100％被排除血缘关系之外，即他绝对不可能是孩子的父亲。如果孩子与其父母亲的位点都吻合，我们就能得出亲权关系大于99．99％的可能性，即证明他们之间的血缘亲子关系。若有1～2个位点不同，要考虑是否发生了基因突变，这是要对多个STR序列位点进行鉴定。

方法二：若获得的个体的杂交图谱与亲代的图谱相同则证明是亲子关系；反之，则不是。

六、实例分析

一家团圆

   1999年3月12日，在北京打工的曾凡彬被人骗出屋后，几名犯罪分子持刀闯入曾家抢走其子曾超。后经公安人员侦查，终于将被卖到在地的曾超解救回家。孩子被解救回来后，体貌特征已发生很大的变化。打拐办民警带曾超到北京市公安局法医中心DNA实验室抽取血样进行DNA检测，在全国丢失儿童父母DNA数据库中上网比对，确认曾超与曾凡彬夫妇的DNA特征完全吻合，曾超终于回到父母身边。
    皇室之谜
    法国国王路易十六的儿子路易夏尔究竟是在1795年死于巴黎一座监狱，还是逃过了法国大革命的追捕？一直是个谜。有人怀疑路易夏尔的坟墓里躺的只是个替死鬼。1999年12月，科学家对墓地中不能确定的少年君主进行鉴定，并将其DNA结构与健在的和已故的皇室成员的DNA样品进行了对比，结果证明死者就是路易夏尔，并分析出死因是结核病。
   真假公主
   十月革命后，苏联官方宣布沙皇一家于1918年7月19日被枪决。但一些历史学家怀疑沙皇幼女安娜丝塔西娅公主可能逃过一死。从此，不断有人声称自己就是安娜丝塔西娅公主。特别是其中一位移居美国的妇女，甚至取得了沙皇亲属的信任。科学家最终又求助于DNA分析法，他们找到了沙皇本人理发留下的头发，提取了DNA，同时找到了那名妇女留下的组织片段，对比后发现这名妇女是个冒牌货。

七、应用前景

由于DNA亲自鉴定技术具有检测迅速准确，安全可靠等优点，现已广泛应用于许多方面。不仅包括亲子鉴定，还用于文物鉴别等方面。作为最前沿的生物技术，DNA分析将为法医物证检验提供科学、可靠和快捷的手段，使物证鉴定从个体排除过渡到可以作同一认定的水平。DNA检验能直接认定犯罪，为凶杀案等重大疑难案件的侦破提供准确可靠的依据。随着DNA技术的发展和应用，DNA标志系统的检测将成为破案的重要手段和途经。让我们共同期。

八、参考文献

1、基因工程技术     钟卫鸿主编    化学化工出版社

2、生物谷网站

3、小木虫网站

4、现代分子生物学    朱玉贤主编    高等教育出版社