江门江海碧桂园怎么样:《普通植物病理学》第四章 植物病毒

　　第一节 概述

　　一、什么是植物病毒？

　　包被在蛋白或脂蛋白的衣壳中，只能在寄主细胞内完成自身复制的一个或多个基因组的核酸分子，又称分子寄生物。

　　二、主要特征

　　1、微小
　　2、结构简单：核酸+衣壳
　　3、专性寄生物，其核酸复制和蛋白质合成需要寄主提供原材料和场所。

　　三、主要类群

　　按寄生寄主：植物，动物，细菌，真菌

　　四、发展简史（植物病毒）

　　1、症状描述
　　eg：荷兰郁金香（16世纪）：杂色
　　欧洲马铃薯退化病（18世纪）：越长越小
　　2、传染性和滤过性
　　1882年，德国Mayer烟草花叶病TMV（汁液可传染，排除了生理性问题，认为可能是细菌）
　　1892年，Ivanowsk →细菌滤器→ 发病→ 毒素（不能增殖）
　　1896年Beijerinck 琼脂扩散→ 不是细菌 →病株 →健株→侵染性活液
　　（在植物中可增殖）
　　1935年 美 Stanley 提纯 → 蛋白质结晶
　　↓
　　1936年 英Bawden 侵染源为核酸 ← 有核酸
　　3、形态
　　1939年 Kausche 拍下照片
　　4、分子生物学
　　（1）研究蛋白、核酸的组成、结构
　　（2）研究复制
　　（3）转基因研究
　　1985（植物） 1986（植物病毒）

　　五、危害性

　　外部症状：变色 花叶 畸形 常见 减生作用（矮化）坏死 烟草类
　　eg：1、马铃薯退化病，减产50%
　　　　2、麦类黄矮病：20~40年代流行
　　　　3、番木瓜黄斑病毒病
第二节 植物病毒形态结构

　　一、形态

　　1、基本形态—粒体（Virion/particle）
　　球状（多面体，CMV）直径20~35nm
　　杆状 截头、圆头
　　线状
　　2、单体病毒，仅有一种粒体
　　联体病毒：两个核酸分别包在两个粒体内
　　多粒体病毒：CMV

　　二、结构 P129

　　核酸（RNA或DNA）+衣壳（蛋白质或脂蛋白）

　　三、组分

　　（一）蛋白质
　　1、结构蛋白：衣壳蛋白（Coat Protein）
　　2、功能蛋白：复制酶
　　运转蛋白
　　（二）核酸
　　基因组、遗传物质
　　1、DNA ssDNA BBTV
　　dsDNA CaMV
　　2、RNA +ssRNA 70%以上
　　﹣ssRNA 
　　dsRNA 
　　病毒核酸的比例：
　　球形粒体的核酸，15%~45%
　　长条形粒体核酸，5%~6%
　　弹状病毒只占1%左右
第三节 植物病毒的复制

　　病毒侵柒植物以后，在活细胞内增殖后代病毒需要两个步骤，一是病毒核酸的复制（replication），从亲代向子代病毒传送核酸性状的过程，即病毒的基因传递（Gene transmission）；二是病毒核酸信息的表达（gene expression），即按照信息RNA的序列来合成病毒专化性蛋白的过程。这两个步骤遵循遗传信息传递的一般规律，但也因病毒核酸类型的变化而存在具体细节上的不同。

　　—、病毒基因组购复制

　　植物病毒与一般细胞生物遗传信息传递的主要不同点是反转录的出现，有的病毒的RNA可以在病毒编码的反转录酶的作用下，变成互补的DNA链。大部分植物病毒的核酸复制仍然是由RNA复制RNA。
　　病毒核酸的复制需要寄主提供复制的场所(通常是在细胞质或细胞核内)、复制所需的原材料和能量、部分寄主编码的酶以及膜系统。病毒自身提供的主要是模板核酸和专化的聚合酶（Po1ymerase），也称复制酶（或其亚基）。例如花椰菜花叶病毒编码一种依赖于RNA的DNA聚合酶（RNA-dependent DNA po1ymerase），也称为反转录酶（reversetranscriptase）。已知在病毒合成系统中存在两种结构的RNA，一种是复制型（replicationform，缩写为RF），是一个碱基完全配对的双链结构；另一种是复制中间型（replicative in-termediate，缩写为RI），是部分双链且含有几个单链尾巴的结构。由于双链RNA的性质独特，双链RNA检测技术常用来证明病毒的存在。

　　二、植物病毒基因组信息的表达

　　病毒基因组信息的表达主要有两个方面；一是病毒基因组转录出信息核酸的过程，二是信息核酸的翻译。表达的不同点主要在于其基因组mRNA具有多种合成途径，mRNA的翻译加工有多种策略。
　　（一）病毒核酸的转录 无论植物病毒含有何种核酸，要翻译出蛋白必须经过mRNA这一过程。
　　+ssRNA病毒核酸可以直接作为mRNA使用，其它植物病毒则需要不同步骤的转录。不同核酸类型的病毒mRNA产生的过程不同。
　　病毒核孩的转录同样需要寄主提供场所和原材料，大部分植物病毒的核酸转录在细胞质内进行，部分在细胞核进行。需要寄主提供转录酶、核苷酸、ATP等物质。DNA病毒（单链和双链病毒）在转录mRNA时都需要寄主的转录酶。如花椰菜花叶病毒的DNA核酸进入寄主细胞核后，需要寄主的DNA依赖的RNA聚合酶Ⅱ．才能转录出mRNA。对于负链RNA病毒来讲，因为其核酸不能直接翻译蛋白，病毒负链核酸转录为正链核酸所必须的复制药是由病毒进入时随病毒粒体带进去的。所以这些病毒的精提纯核酸不能完成复制的过程。另外，双链RNA病毒中的西红柿斑萎病毒属和纤细病毒属，它们的核酸链的部分可以作为mRNA使用，而指导蛋白质的翻译；另外的部分则需要转录一次才能使用。这种类型的核酸称为双义RNA（ambisense RNA）。
　　（二）植物病毒核酸的表达 病毒转录出+RNA以后，其后的翻译仍然不很顺利。由于真核生物体内的蛋白质合成机构仅仅识别病毒+RNA上的第一个开放阅读框架（open reading frame，ORF），同一核酸链上其它基因的表达则要借助病毒的特殊翻译策略。现在发现+ssRNA病毒基因组在真核生物蛋白合成系统中有五种翻译策略：
　　1、亚基因组RNAs策略 由基因组3’末端转录产生一到多个亚基因组（subgenomic）RNA，从各个亚基因组5’端的开放阅读框架翻译出功能性蛋白，如烟草花叶病毒属。
　　2、多聚蛋白策略 基因组核酸具有编码多个蛋白的能力，但是其翻译仅从单一开放阅读框架进行，产生的多聚蛋白（polyproteins）在病毒编码的蛋白酶作用下，分解为多个最终的基因翻译产物，如马铃薯Y病毒属。
　　3、多体基因组策略 病毒的基因组分装在不同的核酸链上，每条核酸链均从5’端进行翻译，直接产生基因的翻译产物，如黄瓜花叶病毒属。
　　4、通读蛋白（read-through）策略 基因5’开放阅读框架的终止密码子可能漏读（1eaky），允许一定比例的核糖体继续向下游翻译，直至下一个终止密码子，从而产生第二个更长的功能蛋白，如烟草花叶病毒属复制酶的翻译。
　　5、核糖体移码（transframe）策略 在翻译接近开放阅读框架0的终止密码子时，核糖体回读一个核苷酸（少数情况是跳过一个），这样使终止密码子UAG分到两个三联体密码中，使翻译继续到下一个开放阅读框架，从而产生一个大蛋白。
　　植物病毒的翻译需要寄主核糖体的参与，主要是80S细胞质核糖体，还需要寄主提供氨基酸、tRNA等物质。翻译后有些病毒蛋白还需要再加工才能发挥功能，这一过程也需要寄主酶系统的参与。
　　植物病毒基因组的翻译产物较少，一般RNA病率的翻泽产物在4~5种，多的可以达到9种。这些产物包括病毒编码的复制酶、病毒的衣壳蛋白、运动蛋白、传播辅助蛋白、蛋白酶等；有些产物会与病毒的核酸、寄主的蛋白等物质聚集起来，形成一定的大小和形状，称为内含体（inclusions）。内含体有不同的形状和大小，从不定形结构到精细的晶体结构，大的可在光学显微镜下看到，小的则只能在电子显微镜下观察。可以分为核内含体（nuclear inclusions）和细胞质内含体（cytoplasmic inclusions）两类。不同属的植物病毒往往产生不同类型、不同形状的内含体，利用这种不同可作为鉴别不同病毒的方法。
　　核内含体可发现在核质（nucleoplasm）、核仁（nucIeous）或者在核膜之间（perinuclear space）。核质内含体一般是内蛋白或病毒粘体构成的晶体结构，少有纤维状的内含体（只有在电子显微镜下才能看到）。核仁相关的内含体多为不定形（amorphous）或晶体形。在核膜间病毒或病毒诱导的物质积累导致核围内含体（perinuclear inclusions）的产生，这种内含体通常是短暂出现的，可能表示核与细胞质物质的移动。
　　细胞质内含体在形状、大小、组成和结构方面差异很大，主要分为不定形内含体、假晶体、晶体内合体和风轮状内含体等五种类型。
　　（三）植物病毒的基因组结构及功能 随着分子生物学研究的进展，越来越多的植物病毒的基因组结构被揭示山来，它们的核酸序列、基因翻译产物的氨基酸序列及其生物学功能，已经有所了解。
　　由于植物病毒基因组基因数目少，我们可以画出它们的基因图谱，标出各种基因产物的位置。下面以研究比较清楚、生产上比较重要的烟草花叶病毒（TMV）为例进行介绍。
　　1、TMV的某因组结构及表达 TMV为+ssRNA病毒，基因组核酸全长6395个核苷酸，共有5个开放阅读框架。核酸的5’端有帽子结构，3’端有类似tRNA的结构。
　　2、TMV蛋白质的生物学功能 病毒基因组核酸直接作为mRNA翻译的第一个产物就是126000u的复制酶亚基，在ORFl处通读翻译出183000u蛋白，126000u和183000u蛋白组成BNA聚合酶。病毒利用亚基因组核酸的翻译策略，产生三个亚基因组核酸，亚基因组RNAl虽然具有三个开放阅读框架，但只有开放阅读框架3可以翻译，在体外翻译系统中产生放54000u的蛋白,这种蛋白目前还没有从病株中分离到。转基因试验证明54000u蛋白可能参与病毒的复制。亚基因组只RNA2翻译产生30000u的蛋白,该蛋白为细胞间运动蛋白。免疫金标记试验显示，在病毒通过胞间联丝之前,30000u蛋白已在胞间联丝处存乔。对比缺乏运动能力抹系（LsI）的30000u蛋白的氨基酸序列，发现只有一个氨基酸与正常株系不同。互补试验、缺失试验等大量证据表明,30000u蛋白是病毒在细胞间运输所必须的。亚基因组RNA3的翻译产物是17.6000u蛋白，即病毒的衣壳蛋白，它除了结构功能外，还参与症状表现和病毒的长距离运输。

　　三、植物病毒的增殖

　　植物病毒作为一种分子寄生物．没有细胞结构像真菌那样具有复杂的繁殖器官，也不像细菌那样进行裂殖生长，而是分别合成核酸和蛋白组分再组装成子代粒体。这种特殊的繁殖方式称为复制增殖（mu1tiplication）。
　　从病毒进入寄主细胞到新的子代病毒粒体合成的过程即为一个增殖过程。包括以下主要步骤及特点，团4-8以+ssRNA病毒的核酸复制为例，介绍病毒复制的一般过程。进入活细胞并脱壳：植物病毒以被动方式通过微伤(机械伤或介体造成伤口)直接进入活细胞，并释放核酸，释放核酸的过程也称为脱壳（uncoating）。
　　核酸复制和基因表达：核酸复制是传递遗传信息的中心环节，包括产生子代病毒的核酸，和产生翻译病毒蛋白质的mRNA。脱壳后的病毒核酸直接作为mRNA，利用寄主提供的核糖体、tRNA、氨基酸等物质和能量，翻译形成病毒专化的RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependet lRNA polymerase RdRp）；在聚合酶作用下，以正链RNA为模板，复制出负链RNA；再以负链RNA为模板，复制出一些亚基因组核酸，同时大量复制出正链RNA亚基因组核酸翻译出3种蛋白，包括衣壳蛋白。病毒粒体的装配相转移合成的正链RNA与衣壳蛋病白进行装配，成为完整的子代病毒粒体。子代病毒粒体可不断增殖并通过胞间联丝进行扩散转移。
第四节 植物病毒的传播与移动

　　传播：在植株间或寄主间的传播（Transmission spread）
　　移动（Movement）：在同一植株上（一个部位到另一个部位）

　　一、介体传播（Vetor transmission）

　　指病毒依附在其他生物上，借其他生物体的活动而进行的传播及侵染
　　（一）介体类型
　　1、昆虫、螨类
　　A、蚜虫（Aphids）200种蚜虫可传播160种病毒
　　棉蚜、桃蚜：花叶
　　B、叶蝉（Leafhopper），飞虱（Whiterflies）
　　黄化矮缩
　　C、粉虱（Mealybugs）
　　D、螨类（Mites）
　　叶蚜螨、蛛螨
　　2、线虫和真菌类（Nematodes & Fungus）
　　外寄生线虫：5属38种，传80个植物病 蠕虫病毒属 烟草脆裂病毒属
　　真菌 根肿菌纲 传17种
　　壶菌纲 传12种
　　（二）传毒机制（Transmission mechanism）
　　1、传毒过程
　　4个时期：
　　A、获毒期（acquisition period）：介体获得病毒所需的取食时间
　　B、潜伏期（incubation period）（潜育、循回期）介体从获得病毒到能传播病毒的时间
　　C、接毒期（inoculative period）：介体传度所需的取食时间
　　D、持毒期（retention period）（带毒期）：介体能保持传毒能力的时间
　　2、介体与所传病毒的关系
　　根据病毒在介体中的持久期分：
　　（1）非持久性传毒（nonpersistent）
　　获毒、传毒、持毒时间短，病毒往往只能停留在口针处，无循回期。
　　循环期：口针→ 前后消化道→ 血液循环→ 唾液腺→ 口针
　　（2）半持久性（semipersistent）
　　病毒有循回期；在虫体内不增殖，常在蚜虫、叶蝉类；持毒期短
　　（3）持久性（persistent）
　　叶蝉、飞虱类
　　具循回期，在虫体可增殖，持毒期长（终生），也可经卵传播

　　二、非介体传播（nonvector transmission）

　　1、机械传播（mechanical transmission）
　　2、无性繁殖材料：系统侵染（某一部位发病，引起全部发病）
　　3、嫁接：可传任何病毒
　　4、种子：种传寄主主要集中在3个科：豆科、葫芦科、菊科与侵染早晚

　　三、病毒在植物体内的移动

　　不具主动移动能力（都是被动的）
　　i. 细胞间（cell to cell movement）
　　通过胞间联丝进行扩散
　　ii. 长距离移动（long distance movement）
　　通过韧皮部（少数木质部）随营养、水分的移动而移动
　　侵染点→ 根部→ 顶部→ 双向→ 全株
第五节 植物病毒分类命名

　　一、分类

　　国际病毒分类委员会（ICTV）
　　1995年以前：Group组，25组
　　Member成员
　　Strain株系
　　1995年以后：按科、属、种 11family,47genus,729species
　　分类依据：（1）病毒核酸类型（RNA，DNA）（2）核酸是单链还是双链（3）是否有包膜（4）病毒形态（5）核酸分段情况（即多分体现象）等

　　二、命名

　　种：俗名法：寄主俗名+症状+病毒
　　eg：烟草花叶病毒：Tobacco Mosaic Virus
　　黄瓜花叶病毒：Cucambe Mosaic Virus
　　番木瓜环斑病毒：Papaya Ringspot Virus
　　属：典型种寄主缩写+主要症状+Virus
　　eg：烟草花叶病毒属：Tobamovirus
　　黄瓜花叶病毒属：Cucamovirus
　　株系：是病毒种下的变种，在生产上有重要性
　　分离物：当分离到一种病毒，但还未完全了解其特征，不能确定其分类地位
第六节 植物病毒鉴定原理

　　鉴定目的：确定一种病毒在分类系统中的地位

　　一、生物学实验（Biological Test）

　　确定病原的侵染性、传播方式、症状类型、寄主范围
　　鉴别寄主：鉴别病毒或其株系所具有的特征性症状反应的植物
　　鉴别寄主谱：几种或一套的鉴别寄主
　　eg： TMV CMV
　　心叶烟 Necrosis 系统花叶
　　西葫芦 非侵染 系统花叶
　　普通烟 系统花叶 系统花叶

　　二、电子显微镜技术（Electrom microscope technique）

　　1、负染技术：使背景与病品反差加大，衬托病毒的形态大小
　　2、免疫电镜技术：免疫学+电镜技术
　　抗血清→ 病毒→ 病毒外沿有一圈

　　三、血清学技术

　　原理：抗原与抗体发生特异性，专化性地结合
　　常用方法：酶联免疫吸附法（ELISA），琼脂双扩散法
　　ELISA优点：
　　1、灵敏度高
　　2、快速
　　3、专化性强，重复性好
　　4、检测对象广
　　5、适用于处理大批样品，所用基本仪器简单，试剂价格较低，且可较长期保存

　　四、核酸杂交及PCR技术

　　1、核酸杂交
　　原理：碱基间互补配对，用已知核酸序列片段（杂交探针）测未知标样杂交，看能否配对
　　定量 Southern blot DNA/RNA
　　Northern blot DNA/RNA 
　　定性 Dot blot
　　2、PCR技术：Polymerase Chain Reaction
　　聚合酶链式反应短时间内能大量合成DNA的方法
　　合成位于两段已知序列之间的DNA片段

　　五、物理化学等特性

　　1、稀释终点：保持病毒侵染力的最高稀释度，用10-1，10-2……表示；反应的病毒的体外稳定性和侵染能力，也象征病毒浓度高低
　　2、钝化温度：处理10分钟使病毒丧失活性的最低温度，用摄氏温度表示
　　体外保毒期（存活期）：在室温下（20~22℃）病毒抽提液保持侵染力的最长时间
第七节 植物类病毒

　　一、类病毒的发现和定义

　　类病毒的定义是：存在于植物中，分子量为1×105左右的、具有很高碱基配对的单链环状植物致病RNA，在健康寄主中不能检查到，它能在寄生主体内自主复制，并引起特殊的症状。类病毒病害过去相当一段时间是作为病毒病来研究的，但由于始终不能看到病毒粒体，而不能确定病毒的归属。后来提纯得到核酸，证明了核酸的侵染性。最后确定为“类新的病原。类病毒（viroid）引起的病害症状主要有畸形、坏死、变色等类型。典型病害是引起马铃薯纺锤块病（PSTVd）。
　　类病毒对热以及对紫外光和离子辐射有高度的抗性，因为它的分子内含有互补的密集区域和以共价键结合成环状结构。目前已经发现了30多种类病毒，其中23种的核苷酸序列已经被分析出来。

　　二、类病毒不同于病毒的主要特性

　　1、耐热性 要使类病毒失活需要高于100℃的温度。 
　　2、高度侵染活性 50~100分子的类病毒可以引起成功的侵染，而病毒需要100万个粒体以上。 
　　3、局限的存在部位 类病毒至今仅仅发现于细胞核中，其核酸在体外翻译体系和寄主体内都没有翻译产物的存在，因为其核酸分子上没有翻译起始密码子。 
　　4、核酸组成的相近性 G/C比相近，55%~58%；有人对比了3种类病毒的核苷酸序列，发现其在很大程度上的同源件，个别核苷酸或者局部片段发生了变化，成为不同的病原，或者不同的株系。研究表明几个甚至一个核苷酸的不同，就会导致致病力的明显变化。 
　　5、不显性感染 植物带有类病毒但不表现症状的现象极为普遍。经测试36个科的232种植物对马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）的感病性，发现有11个科的138种植物是感病的，但只有茄科和菊科的12种植物表现症状，即90％以上的寄主都是不显症感染，酣丛潜育期很长，有的几个月，有的甚至几年。 
　　6、传播方式简单 类病毒主要通过农具、嫁接刀具等传播，大部分可以通过种于传播（有的可在种子中存活20年）；仅仅有危害马铃薯和番茄的三种类病毒被证明有节肢动物介体传播。

　　三、类病毒的检测 

　　已经发现的类病毒已超过30种，其核酸含有246~574个核苷酸，根据序列和结构的同源性、复制特性分为两个组，分别为马铃薯纺锤块茎类病毒组（PSTVd）和鳄梨日斑类病毒组（ASBVd）。 
　　虽然植物类病毒可以侵染12个科的植物，但由于不显性侵染比较普遍，症状表现受环境温度的影响较大，而且几种鉴别植物对不同类病毒的反应症状相似，故难于应用生物测定的方法。由于类病毒不能产生任何蛋白质，所以也不能使用检测病毒的血清学方法。 
　　核酸杂交和PCR扩增等检测核酸的方法可用于类病毒的检测。依据类病毒分子内部的部分碱基配对特性，已发展了—种反向电泳（return-polyacrylamide gel electrophoresis,R-PAGE）技术，可以简便地检测出类病毒的存在，甚至不同种类的类病毒。