榆林市委:双歧杆菌耐药性与质粒

来源:百度文库 编辑:中财网 时间:2024/03/29 19:47:45
双歧杆菌耐药性与质粒 随着微生态学理论与实践的不断发展,人们对维持正常菌群的生态平衡的重要性的认识越来越深刻[1]。根据微生态学的有关理论,多种活菌制剂已经被开发出来,在临床被用于恢复人体的正常菌群,用来治疗各种因素导致的肠道菌群失调[2]。现就与双歧杆菌活菌制剂研制和临床应用密切相关的药物敏感性以及双歧杆菌的质粒进行综述。

1 双歧杆菌对抗生素的药物敏感性
  由于双歧杆菌属于生理性细菌,研究双歧杆菌对抗生素的药物敏感性的主要是为探索抗生素对肠道菌群改变,同时双歧杆菌药物敏感性的研究也是开发活菌制剂的基础。
  1.1 双歧杆菌敏感的抗生素 由于双歧杆菌是一种革兰氏阳性杆菌,同时又是一种厌氧菌,所以对双歧杆菌反应敏感的抗生素是一些有革兰氏阳性抗菌谱和一些对厌氧菌有效的抗生素。
  1.1.1 青霉素G(Penicillin G) 青霉素类抗生素是一种杀菌性抗生素,具有广谱高效等特点,对革兰氏阳性杆菌具有抗菌作用。双歧杆菌对青霉素G非常敏感,绝大多数的实验菌株的MIC<5U/ml[3]
  1.1.2 大环内酯类抗生素(Macrolide) 红霉素(Erythromycin)是大环内酯类抗生素的代表,是由链霉菌产生的一类弱碱性抗生素,其抗菌谱与青霉素相近,但为抑菌而非杀菌作用,对革兰氏阳性菌有强的抑制作用,绝大多数双歧杆菌对红霉素的MIC<2μg/ml。但Lim K.S.发现一株短型双歧(B.breve)对红霉素的MIC为3.2μg/ml,这可能由于实验菌株的来源或实验方法的不同所致。此外双歧杆菌对交沙霉素(Josamycin)和克拉霉素(Clarithromycin)也十分敏感[3、4]
  1.1.3 万古霉素(Vancomycin) 万古霉素是一种由东方链霉素产生的,为一无定形糖肽类抗生素,可抑制细胞壁的合成,是一种对厌氧菌有效的抗生素,所有的实验者一致发现双歧杆菌对万古霉素非常敏感。其MIC为(0.25~0.85μg/ml[3、4]
  1.1.4 林可霉素、氯林可霉素(Lincomycin) 林可霉素可从链霉菌S.lincolnensis变种的发酵滤液中获得,可抑制细菌的蛋白质合成,对革兰氏阳性菌和厌氧菌均有效,克林霉素是由林可霉素的7位羟基被氯原子取代而得到的一种半合成的抗生素,主要用于厌氧菌的感染,对革兰氏阳性菌亦有效。发现人源的双歧杆菌对这两种抗生素非常敏感,MIC为(0.09~0.89)μg/ml[3、4]
  1.1.5 杆菌肽(Bacitracin) 杆菌肽是一类主要含噻唑环的多肽化合物,可抑制细胞壁糖肽的合成,并可损伤细胞膜,改变细胞膜的通透性。杆菌肽对革兰氏阳性菌有高度的抗菌活性。双歧杆菌对本品十分敏感,其MIC通常<1.6μg/ml[3]
  1.1.6 氯霉素(Chloramphenicol) 氯霉素最初是由委内瑞拉链霉菌产生的,现用合成法制造。可抑制细菌的蛋白质合成。对厌氧菌有效,双歧杆菌对本品表现为敏感,其MIC<10μg/ml[3、4]
  双歧杆菌对阿齐霉素(Azithromycin)、伊米替能(Imipeme)和乳铁蛋白也比较敏感[3、4]
  双歧杆菌对上述六大类抗生素表现出敏感。这些抗生素的抗菌谱主要是以革兰氏阳性菌或厌氧菌为主,这与双歧杆菌为一种革兰氏阳性厌氧杆菌的特征是一致的。
  1.2 对双歧杆菌无效的抗生素
  1.2.1 氨基糖苷类抗生素(Aminolglycoside) 氨基糖苷类抗生素是由微生物产生或由半合成制取的一类易溶于水的碱性抗生素。主要作用于细菌的蛋白质合成过程,其主要抗菌谱是革兰氏阴性杆菌,对厌氧菌无效。双歧杆菌不在其抗菌谱中,通常可抵抗这一类抗生素的作用,对这一大类抗生素的MIC通常>100μg/ml[3]。MatteuzziD等还发现短型双歧(B.breve)和猪双歧杆菌(B.suis)对卡那霉素(Kanamycin)的抗性尤强[6]。此外双歧杆菌对巴龙霉素(Paromomycin)也不敏感。但并非所有的双歧杆菌对这一大类抗生素都有不敏感,例如LimKS发现活菌制剂中的婴儿双歧杆菌(B.infantis)就对链霉素(Streptomycin)较为敏感,MIC为1.5μg/ml-3μg/ml。MatteuzziD也发现婴儿双歧杆菌(B.infantis)对氨基糖苷类抗生素敏感的现象[6]
  1.2.2 多粘菌素(Polymyxin) 多粘菌素系由多粘芽胞杆菌产生的一种多肽类抗生素,主要对革兰氏阴性杆菌和某些弧菌有效,但对革兰氏阳性菌和专性厌氧菌无效。双歧杆菌对这类抗生素有抗性,其MIC通常>100μg/ml[3、6]
  1.2.3 甲硝唑(Metronidazole) 甲硝唑为一类合成抗原虫药物,1962年发现本品对厌氧菌具有强大的杀菌作用,而开始广泛用于厌氧菌感染的治疗。但是,双歧杆菌虽然是一种厌氧菌,却对甲硝唑有抗性。其MIC通常500μg/ml[4、6]。由于厌氧菌的硝基还原酶在敏感性细菌的能量代谢中起重要作用,能使甲硝唑的硝基还原成为氨,后者具有细胞毒作用,能抑制敏感菌的DNA代谢,耐药菌往往缺乏硝基还原酶[7]。双歧杆菌对甲硝唑的抗性是否由述因素引起还不清楚。

  此外,双歧杆菌对萘啶酸类(Nalidixiaxid)抗生素也不敏感[3]
  这些抗生素大部分是以革兰氏阴性菌为主要抗菌谱。双歧杆菌对上述抗生素的不敏感性是天然的而非获得性的[8]
  1.3 双歧杆菌对广谱抗生素的敏感性
  这一类抗生素主要包括β-内酰胺类抗生素中的头孢菌素(Cephalosporin),四环素类(Tetracycline)抗生素以及呋喃妥因(Nitrofurantin)。双歧杆菌对这几大类抗生素表现为不同程度的敏感性,MIC变化范围较大[3、4、6]。VeraL.等报导双歧杆菌对四环素类中的脱氧土霉素(Doxycyclin)和二甲胺四环素(Minocycline)比较敏感[4]
  从上述资料我们可以发现作为革兰氏阳性厌氧菌的双歧杆菌对抗生素的药物敏感性比较复杂。既有革兰氏阳性菌的特点,又同时具有厌氧菌的基本特征。但例外的是,双歧杆菌对被普遍认为对厌氧菌感染十分有效的甲硝唑却存在抗性。随着有关双歧杆菌对抗生素的药物敏感性的资料的不断积累,其中的规律将越来越明显。有关双歧杆菌的药物敏感性的研究也将促进双歧杆菌活菌制剂的研制与开发。

2 双歧杆菌质粒
  质粒几乎存在于所有种属的细菌当中,并且对细菌的遗传进化起着重要作用。质粒也决定细菌的表型特征:如:抗生素抗性、重金属抗性、产生细菌素。同时也与细菌的毒力及碳水化合物代谢等有关[9]。有关双歧杆菌质粒的研究是近些年来逐步开展的。现就双歧杆菌质粒进行综述。
  2.1 双歧杆菌质粒提取特点 由于双歧杆菌是一种革兰氏阳性细菌,细胞壁含有较多的糖肽和磷壁酸,这两种成分使细胞壁的机械性大大加强[10]。正是因为这种原因,在提取双歧杆菌质粒时必须预先对细胞壁进行处理,大多使用较高浓度的溶菌酶来消化其细胞壁。在裂解细胞时,使用SDS的浓度也较通常高,同时还采用水浴来帮助裂解细胞[11。Linda等利用3%NaCl饱和的酚来去除残留的单链染色体DNA,其原理是单链DNA主要分布于有机相和无机相之间,可随酚一同被去除[12]
  2.2 质粒在双歧杆菌中的分布及其特点 迄今为止,双歧杆菌共分为24型,已从其中五个型中发现有质粒存在,见表1。

表1 双歧杆菌质粒特点

来源种属质粒分子量决定性状文献来源B.longum1.25-9.5MdalCryptic[30]、[37]、[24]B.breve5.6kbCryptic[27]、[28]B.globsum13.5-46MdalCryptic[30]B.indicum?Cryptic[30]B.asteroides?Cryptic[30]

  迄今为止在人源的9种双歧杆菌中仅在长双歧杆菌(B.longum)和短型双歧杆菌(B.breve)两个种属中发现有质粒存在。Sgorbati等检测了来源于婴儿粪便中的186株长型双歧杆菌,其中的127株中存在质粒,这些质粒分布于13种不同的图谱之中,每种图谱中含有2-7种不同的质粒[13]。ParkM.S也从长型双歧杆菌中提取出质粒。长型双歧杆菌中的质粒分布有如下特点:1.质粒的分布与菌株的来源有关,不同来源的长型双歧杆菌中的质粒阳性菌株的比例不同,例如:Sgorbati报导为40%的长型双歧杆菌存在质粒,Park等在100株双歧杆菌中仅发现1株菌中含有质粒。2.阳性菌株中的质粒大多分布在少数几种质粒图谱当中。Sgorbati发现65%的阳性菌株中的质粒集中分布于全部13种质粒图谱中的3种里。3.长型双歧杆菌中的质粒多为两种以上,且分子量较小(1.25-9.5Mdal)。
  虽然最初Sgorbati在100株短型双歧杆菌(B.breve)中并未发现有质粒阳性菌株。但后来M.iwata却从42株短型双歧杆菌中检测出18株菌为质粒阳性菌株,并发现绝大多数质粒阳性菌株含有的是同一种质粒图谱。M.lwata认为这是由于实验菌株的来源不同所致。后来,Bourget也在短型双歧杆菌中发现有质粒存在[15]。迄今为止,来自人体内的双歧杆菌中,仅在长型双歧和短型双歧杆菌中发现有质粒存在。
  Sgorbati从84株球形双歧(B.globsum)杆菌中分离得到28株质粒阳性菌株,3种不同的质粒图谱,并且阳性菌株均只含有一种质粒。其中一种质粒的分子量为46Mdal,有可能编码与结合功能相关的基因[13]。此外,在印度双歧(B.indicum)和星状型双歧杆菌(B.asteroides)也发现了质粒,并且这两种双歧杆菌中的质粒还有一定的相关性[13]
  2.3 双歧杆菌质粒的分子生物学研究 各国微生态学专家试图对双歧杆菌进行遗传水平上的改造,希望能够筛选出更适合活菌制剂生产和药效的菌种来。国外学者们正在努力寻找适用于双歧杆菌的基因工程载体,并首先把目光瞄向了双歧杆菌中的质粒,希望对其进行改造,来构建出理想的载体。Rossi和Mattarelli及BourgetN等分别对来自长型双歧杆菌(B.longum)中的质粒pMB1、pVS809和短型双歧杆菌(B.breve)中的质粒进行了限制性内切酶的酶切图谱分析,为构建载体打下了基础[14]。对质粒pMB1的研究更为深入一些,pMB1已被克隆,全部核苷酸序列已被测定,为184bp,G+C%为62%。pNB1有两个开放阅读框架(ORF),orf1和orf2位于同一个操纵子中,并发现orf1和orf2编码的蛋白质与Corynebacteriumglutamicum中的质粒pXZ10142和Mycobacteriumfortuitum中的质粒pAL5000的蛋白质DNA序列有极高的同源性。此外,orf1和orf2还是pMB1复制子的一部分。DemotR等还发现pMB1的复制子与来自EnterobacteriaColE2家族质粒大反式作用元件和orl基因序列有较高的同源性。用pMB1已经构建成功了载体pRM2,此外,pMB1还被用来构建能够在大肠杆菌(Escherichiacoli)和动物型双歧杆菌(B.animalis)之间进行穿梭载的载体(ShuttleVector)在大肠杆菌(Escherichiacoli)和长型双歧杆菌(B.longum)之间穿梭体也已用pBLE100构建完成。对双歧杆菌进行基因转移的方法已被ArgnaniA等发展并完善,成功地将穿梭载体pRM2导入长型双歧杆菌。此外,Sgorbati还利用探针杂交技术来研究各种双歧杆菌质粒之间的同源性。大部分双歧杆菌质粒所决定的表型特征还没能被确定下来。Sgorbati和Donskikh EE,认为双歧杆菌对四环素的耐药性可能与其所含质粒有关,但迄今为止还没用找到确凿的证据[13]。美国学者Lacroix JM用PCR方法已从双歧杆菌中检测到四环素的抗性基因,但没有确定其具体位置。此外,我国学者黄耀坚用质粒消除的方法来分析双歧杆菌质粒与耐药性关系,并未发现二者直接相关[16]

  有关双歧杆菌质粒的分子生物学研究正在不断地深入进行,这些质粒的遗传学特征将逐步被人们揭示出来,并有希望达到利用这些质粒对双歧杆菌进行基因工程改造的目的。