中财网tae调ph:生物化学实验
来源：百度文库 编辑：中财网 时间：2024/04/29 05:41:27
一.实验目的
1.加深对理论的理解，理论联系实际。
2.掌握实验的基本方法和技能。
3.培养严谨的科学态度和作风。
二.实验室规则
1.实验前需预习实验指导和有关理论，明确实验目的、原理、预期的结果、操作关键步骤及注意事项。
2.实验要严肃认真地按照操作规程进行，注意观察实验中出现的现象和结果，并把实验数据和结果及时如实记录在实验记录本上，课后根据实验结果进行科学分析。
3.实验室和实验台应保持整洁。公用试剂用毕，立即盖严并还原。实验完毕，仪器洗净放好。
4.注意节约药品、试剂和各种物品，爱护仪器，按规程操作仪器，以免损坏。如果损坏仪器照章赔偿。
5.实验结束离开实验室之前，关好窗户，切断电源，水源，确保安全。
三.实验课考核标准和考核方法
考核标准：实验课成绩占生化课总成绩的20％，共12次实验。每次实验为2分，缺课一次减2分，缺课1/3以上者，取消生化课考试资格。
考核方法：分实验过程考核和实验报告考核。
实验过程考核占1分，包括操作方法及实验结果评分。实验结果占0.4分（结果的正确度），实验操作占0.6分（包括分光光度法测试，离心机使用，层析法，电泳法等基本操作）。
实验报告考核占1分。要求书写规范，字迹清晰，结果分析合理，不允许抄袭。
实验一 基本操作
一.目的
1.熟悉实验室规则及常用生化仪器。
2.掌握各种仪器的正规操作。
3.清点洗刷实验用具。
一、 实验内容
（一） 常用生化仪器
量器：量筒、离心管、吸量管、容量瓶
玻璃仪器
容器：烧杯、试管、锥形瓶、滴管
仪器：离心机、水浴箱、电泳仪、分光光度计等
（二） 玻璃仪器的洗涤
1、初用的玻璃仪器的清洗：表面附有碱性物质，先用去污粉洗，再用自来水冲洗干净，然后浸于盐酸溶液浸泡过夜，再用自来水反复冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗1－2次，80℃烤干备用。
2、使用过的玻璃仪器洗涤
（1）一般非计量玻璃仪器或粗容量仪器，如烧杯、试管、量筒等先用肥皂水刷洗，再用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗1－2次，倒置晾干。
（2）量器，如滴定管、容量瓶等先用自来水冲洗，直至不挂水珠，再用蒸馏水冲洗1－2次，分干备用。若冲洗后仍挂水珠，则将其晾干后浸于铬酸洗液浸泡数小时。然后用自来水反复冲洗干净，再用蒸馏水冲洗1－2次，干燥备用。
（三）吸量管和微量移液器的使用
1.吸量管的使用（注意标签、选择容量大小合适的吸量管）
（1）正确拿法 中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端
（2）取液 用橡皮球吸液体至刻度上，眼睛看着液面上升；吸完后用食指顶住吸量管上端。
（3）调刻度 吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用食指控制液体下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。
（4）放液 吸量管移入准备接受溶液的容器中，仍使其出口尖端接触器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。奥氏吸量管和刻度到底的吸量管应吹出尖端残留的液体。移液管应最后靠壁15秒。
2.微量移液器的使用
调节体积选取钮至所需值，套上吸头，旋紧。垂直持握移液器，用大拇指按下液体吸放钮至第1档，将吸头插入待吸溶液，松开大拇指使吸放钮回复原位。将移液器移入准备接受液体的仪器，用大拇指再次按下液体吸放钮，至第1档后继续至第2档以排空液体。
3.练习吸量管的使用
取50ml锥形瓶加入未知酸5ml ,酚酞指示剂1滴，摇匀，用0.01mol/LNaOH滴定，记录结果。（无色酚酞遇酸不变色，遇碱变红。）滴定时边滴边摇动锥形瓶。
(四)离心机的使用方法
离心机是利用离心力将悬浮液中的微粒从溶液中分离出来的一种仪器。根据最高离心转速的不同可将离心机分为三种类型：普通离心机，其最高转速一般在4000转/分至6000转/分；高速离心机，转速可达10000转/分至25000转/分；超速离心机，转速可超过50000转/分以上。生化实验室常使用普通离心机。
普通离心机的使用方法：
1．使用前先检查变速旋钮是否在“0”位，外套管是否完整无损和垫有橡皮垫。
2．离心时先将待离心的物质转移到大小合适的离心管内，盛量不宜过多,占管的2/3体积为宜,以免溢出。将此离心管放入外套管，再在离心管与外套管间加入缓冲用水。
3．将一对装有离心管的外套管在台称上平衡。如不平衡可调整缓冲用水或离心物质的量。
4．将平衡好的套管，按对称方位放到离心机插孔中。把不用的离心套管取出，盖严离心机盖。
5．接通电源，开启开关，平稳、缓慢移动调速手柄，至所需转速。计时。
6．当达到离心所需时间后，将调速柄慢慢调回零位，关闭开关。待离心机自动停止转动后，再打开离心机盖取出样品。
7．用完后，取出套管中橡皮垫洗净，冲洗外套管，倒置干燥。
实验三 凝胶层析法分离蛋白质
一．目的
1．了解层析技术的基本原理；
2．初步掌握分子筛层析的原理和操作方法。
二．原理
介绍层析的概念
所谓层析，就是利用样品中各组成成分的理化性质的差异，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，由于各组分随流动相前进的速率不同，从而把它们分离开来的技术。这些物理特性包括分子的大小、形状、所带电荷、挥发性、溶解性及吸附性质等。层析系统的必要组分有：
a. 固定相，可以是一种固体、凝胶或固定化的液体
b. 层析床，把固定相填入一个玻璃或金属柱中，或者薄薄涂布一层于玻璃或塑料片上或者吸附在醋酸纤维纸上。
c. 流动相，起溶剂作用的液体或气体
d. 运送系统，用来促使流动相通过层析床。
e. 检测系统，用于检测试管中的物质。
由于不同物质固定相相互作用的强弱不同，从而使得分离目的得以实现。
要点：层析系统中，与固定相作用强的物质受到的阻力最大，而作用弱的物质受到的阻力很小，因而不同物质在层析过程中的迁移距离和洗脱时间不同。
介绍凝胶层析的概念。凝胶层析又称分子筛层析，主要根据混合物中分子的大小和形状不同，在通过凝胶时，分子的扩散速率各异而达到分离的目的。凝胶颗粒具有多孔性网状结构，小分子易进入凝胶网孔，流程长而移动速度慢，而大分子物质不能进入凝胶网孔，沿凝胶颗粒间隙流动，流程短移动快。这种现象称为分子筛效应。
在凝胶层析中常用的凝胶有葡聚糖凝胶(商品名Sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel-P)和琼脂糖凝胶(Agarose)。葡聚糖凝胶是由细菌葡聚糖(又称右旋糖苷)在糖的长链间用交联剂1-氯-2，3-环氧丙烷交联而成。在合成时，调节葡聚糖和交联剂的比例，可以获得具有网孔大小不同的凝胶。G值表示交联度，G值愈大，交联度愈小，网孔和吸水量越大。
本实验通过SephadexG50层析柱，以蒸馏水为洗脱剂，分离血红蛋白(红色，分子量约64500)与硫酸铜(蓝色，分子量249.5)的混合物，从颜色的不同可观察到血红蛋白洗脱快，硫酸铜洗脱较慢。
三．材料
1．仪器 层析柱(直径0.8-1.5cm，长10-20cm)；吸管；玻璃棒；小烧杯；25ml量筒；试管。
2．试剂 Sephadex G-50；抗凝血； 0.9%NaCI溶液；硫酸铜溶液
四．方法
（一）凝胶的准备。由准备室制备。
（二）样品制备
1．血红蛋白(Hb)溶液的制备 取抗凝血液约0.5ml于离心管中，离心5分钟(2500rpm)，弃去上层血浆，用0.9%NaCI溶液3ml洗血细胞二次，将血细胞用1.5ml蒸馏水稀释，即为Hb稀释液，备用。
3．取Hb稀释液与CuSO4溶液各0.5ml，充分混匀，此混合液作为样品。
（三）装柱 取层析柱(直径0.8-1.5cm，长度20cm)一支，将层析柱烧结板下端的死区用蒸馏水充满，不得留有气泡，然后关闭层析柱的出口。将已溶胀的凝胶悬液沿玻棒小心地徐徐灌入柱中，待底部凝胶沉积1-2cm时，再打开出口，继续加入凝胶悬液至凝胶层积集至约15cm高度即可。凝胶悬液尽量一次加完，以免出现不均匀或分层的凝胶带。如表层凝胶凸凹不平时，可用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降，使表面平整。
（四）加样与洗脱：加样时先将柱的出口打开，让蒸馏水逐渐流出，待床面上只留下极薄的一层蒸馏水时，关闭出口。用滴管将样品(约0.4ml)小心地加到凝胶床的表面上。注意加样时不要将床面冲起，亦不要沿柱壁加入。然后，打开出口，使样品恰好进入床面(不要让空气进入床内)，用上法滴加1-2倍样品体积的蒸馏水，待完全流进床内后，再加蒸馏水进行扩展洗脱，直至两条区带分开为止。
注意事项：洗脱的过程中，应不断滴加蒸馏水，使始终凝胶床的上表面保留约2cm左右的蒸馏水
思考题
1. 凝胶层析法的基本原理是什么？假如分离几种分子量大于20000的蛋白质，应选用什么型的交联葡聚糖凝胶？
2. 应用本法分离血红蛋白与硫酸铜，怎样才能得到较好的分离效果？
实验四 影响酶活性的因素
（一）pH对酶活性的影响
一．目的
1．了解pH值对酶促反应速度影响。
2．掌握测定唾液淀粉酶活性的原理及定性方法。
二．原理
复习：1．酶：由活细胞产生的，对其特异底物起高效催化作用的蛋白质。
2．酶促反应：酶所催化的化学反应。
3．影响酶促反应速度的因素：[S]、[E]、pH、温度、激动剂与抑制剂
过酸过碱都能使酶蛋白变性而使其丧失活性。在不致使变性的pH值范围内，酶的活性会因pH值不同而不同。由于酶是一种蛋白质，在不同氢离子浓度下，其解离的情况不同，但往往只有一种情况下才是该酶的最高活力，此时pH值称为酶的最适pH值。倘若其作用条件偏离最适pH值任何方面，都将引起酶活性的降低，减慢酶促反应速度。
唾液淀粉酶能使淀粉水解成一系列比较简单的化合物，最终产物为麦芽糖，利用其与碘液的不同呈色反应，即可推知淀粉酶水解淀粉的程度和pH对唾液淀粉酶的活性影响，并可指出唾液粉酶的最适pH。
pH
v
最适pH
淀粉 紫色糊精 红色糊精 麦芽糖
(遇碘呈蓝色、遇碘呈紫色、遇碘呈红色、遇碘呈淡黄色)
三．操作方法
制备唾液：将放一薄层棉花的漏斗置于10ml量筒顶端，5名以上的学生吐1ml唾液，倒入100ml量筒中，用蒸馏水将小量筒冲洗倒入大量筒中，加蒸馏水至100ml，用吸量管混匀唾液。
取试管3支，编号，按表加各种试剂。
编号
0.5%淀粉液(ml)
pH5.0缓冲液(ml)
pH6.8缓冲液(ml)
pH8.0缓冲液(ml)
唾液(ml)
1
1
2
1
2
1
2
1
3
1
2
1
摇匀放入37℃水浴中保温3分钟，用滴管吸取pH6.8管内液体一滴，在白瓷盘中用碘液检查是否水解完全，然后向各管加碘液3滴，观察结果解释之。
（二）温度对酶活性的影响
一．目的
了解温度对酶活性的影响。
二．原理
在低温时酶的催化反应速度一般很低，温度升高催化反应速度也随之升高，但酶是一种蛋白质，升高温度可以引起蛋白质的变性，使酶的活性降低。所以温度对酶的活性有二种相反的影响，一般在比较低温范围内(例如0-40℃)，温度对酶蛋白变性影响不大，活性随温度升高而增高。各种酶都有它的最适温度，此时酶表现最高的活力。机体大多数酶的最适温度在37℃—40℃。本实验利用碘与淀粉的反应，来比较唾液淀粉酶在不同温度对淀粉的水解速度。
温度
v
最适温度
三．操作方法
取试管4支，标号。在各管中均加入0.2%淀粉液2ml和pH6.8缓冲液1ml。然后，把第一试管置于40℃的水浴中，第二试管放在室温下，第三放在冰水中，约2分钟后，向第一、第二、第三试管再加稀释唾液1ml，第四试管加入煮沸的唾液1ml，摇匀。隔2分钟左右以第一试管取出几滴反应液至白瓷盘内，检查完全水解后，取出各管，分别加碘液1滴，观察颜色变化并解释之。
（三）激动剂与抑制剂对酶活性的影响
一．目的
了解激动剂与抑制剂对酶活性的影响。
二．原理
酶活性常受一些物质影响。在酶反应体系中加入某些物质能增高酶活性，亦即加速酶促反应的进行，而另外某些物质能降低酶的活性，即减缓甚至完全停止酶促反应的进行。前者称为激动剂，后者称为抑制剂。许多电解质是酶的激动剂，某些重金属盐则是酶的抑制剂。激动剂与抑制剂影响酶活性的需要量是很小的，并常具有特异性。本实验用氯离子和铜离子，说明对唾液淀粉酶的激动和抑制。
三．操作方法
取试管4支，编号，按表分别加入试剂，摇匀，迅速置于37℃的水浴中，15分钟后取出，冷却后分别加入碘液3滴，观察其颜色变化，并解释之。
编号
0.25%淀粉液(ml)
pH6.8缓冲液(ml)
H2O(ml)
0.3%Nacl
(ml)
1%CuSO4
(ml)
唾液
(ml)
1
3
1
2
—
—
—
2
3
1
1
—
―
1
3
3
1
—
1
―
1
4
3
1
—
—
1
1
四.注意事项：
1.制备混合唾液，并将唾液混匀。
2.试管正确编号。
3.三种浓度淀粉不要加错，淀粉用之前混匀。
4.最后加唾液，加完淀粉、唾液后将二者充分混匀，混匀时间不超过一分钟。
五.思考题：
1. 影响酶促反应的主要因素有哪些？
2. 出现何种结果，说明酶活性最高；出现何种结果，说明酶活性最低？
蛋白质定量（双缩脲法）
[复 习]
1. 组成蛋白质的基本单位及肽键的形成；
2. 双缩脲及双缩脲反应；
3. 利用分光光度法测定样品浓度的方法（标准比较法、标准曲线法、回归分析法）
[实验目的]
1. 掌握双缩脲法测定蛋白质的操作方法和原理；
2. 学会制作标准曲线；
3. 正确使用721分光光度计。
[实验原理]
蛋白质分子具有两个以上的肽键，因此在硷性溶液中能与Cu2+形成紫红色的配合物，该配合物颜色的深浅与蛋白质的浓度呈正比。在相同的实验条件下配制标准蛋白溶液和样品液并于540 nm波长下比色，通过标准蛋白液的标准曲线可求出样品液的蛋白质浓度。
[器材与试剂]
一、 器材
1. 试管及试管架； 2. 刻度吸量管； 3. 721分光光度计。
二、 试剂
1. 标准酪蛋白溶液（5mg/ml）
2. 双缩脲试剂；
3. 样品液（稀释10倍的血清）
[步骤与方法]
试剂（ml）/管号
1
2
3
4
5
6
标准酪蛋白溶液
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
蒸馏水
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
0
双缩脲试剂
4
4
4
4
4
4
一、绘制标准曲线： 按下表加试剂
充分混匀后室温放置30分钟，观察各管颜色并以1号管作空白对照，在540nm 波长下进行比色，记录各管OD值，然后以OD值为纵坐标，酪蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线图。
二、样品液的测定：按下表加入试剂
试剂（ml/管号）
1
2
3
样品液
1
1
0
蒸馏水
1
1
2
双缩脲试剂
4
4
4
充分混匀后在室温放置30分钟，在560nm波长下比色，以3号管为空白对照，测定并记录两管OD值，计算平均值，以平均值从标准曲线上查出样品液中蛋白质的含量。
[注意事项]
1. 注意吸量管的正确使用，加样量一定要准确；
2. 充分混匀各管溶液，以免显色不均。
3. 样品液中蛋白质含量以质量浓度表示（g/升）。
[思考题] 1. 为什么测定未知样品时要用两个相同的测定管？
2.不用标准曲线如何测定未知样品液中的蛋白质浓度？
聚丙烯酰胺凝胶电泳
复习电泳的概念、影响电泳的因素。
一、 目的
1：学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理
2：掌握聚丙烯酰胺凝胶不连续圆盘电泳分离血清蛋白质的方法。
二、原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N¢，N¢—四甲基乙二胺(N，N，N¢，N¢—tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。采用不同浓度的Acr、Bis，产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小，形状来选择凝胶浓度。大多数蛋白质在7.5﹪凝胶中能得到满意的结果。根据凝胶系统的均匀性，可分为连续性凝胶电泳和不连续凝胶电泳；按凝胶形状可分为圆盘状电泳和平板电泳；根据分离的蛋白质是否变性可分为非变性、变性（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）。
聚丙烯酰胺凝胶不连续圆盘电泳示意图
（A为正面 B为剖面）
1样品胶pH6.7
2浓缩胶：是大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1
3分离胶；是小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1
4电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液
可见电泳系统是不连续的。进行电泳时，样品物质被分成狭窄的圆盘状区带，故称为不连续圆盘电泳。可根据三种效应将样品进行分离：浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。
浓缩效应：
⑴：被分离的蛋白质分子在浓缩胶（大孔胶）中受到阻力小移动速度快，当走到分离胶（小孔胶）处时，阻力突然加大，移动速度急剧减慢，样品的分离区带变窄，浓度升高。
⑵：通电后，电极槽缓冲液中的甘氨酸进入浓缩胶，遇到pH6.7的凝胶缓冲液，甘氨酸解离度明显降低，负电荷减少，向正极移动速度变慢，称为尾随离子或慢离子；C1-在任何pH下都处于解离状态，所以泳动速度最快，称为前导离子或快离子；而蛋白质在pH6.7条件下，大部分以负离子形式存在，带较多的负电荷，泳动速度居于上述两者之间。结果在浓缩胶中，3种离子的泳动速度为C1-＞蛋白质离子＞甘氨酸离子。C1-迅速向前移动，在它后面形成一个低离子浓度的低电导区域，电导与电势梯度成反比，所以低电导区就有较高的电势梯度。这种高电势梯度迫使蛋白质离子和甘氨酸离子在此区域内加速前进，追赶快离子，夹在快慢离子中间的蛋白质就在这种追赶过程中被逐渐压缩成一条狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，pH由6.7变为8.9，甘氨酸的解离度增加，负电荷增多，泳动加快，超过蛋白质的泳动速度，此时凝胶中高电势梯度区域消失，蛋白质样品在均一的电势梯度和均一pH条件下，在分离胶中按分子筛效应和电荷效应进行分离。
分子筛效应：蛋白质分子越大，阻力越大，移动的速度越慢：蛋白质分子越小，阻力越小，移动的速度越快。
电荷效应：蛋白质的pI越小，所带负电荷越多，电泳速度越快；蛋白质的pI越大，所带负电荷越少，电泳速度越慢。
三、仪器与试剂
（一）主要的仪器：电泳仪
圆盘电泳槽
电泳玻璃管
微量注射器
日光灯
（二）试剂
（1）凝胶储备液
A储备液：分离胶缓冲液 pH8.9 Tris-HCl缓冲液：
B储备液：浓缩胶缓冲液 pH6.7 Tris~HCl缓冲液：
C储备液：分离胶储备液
D储备液：浓缩胶储备液
Ｅ储备液4% Ap（W/V）
Ｆ储备液40%蔗糖
G储备液 核黄素4mg定容到100ml
（2）电泳缓冲液：
pH8.3 Tris-甘氨酸
（3）染色液：考马斯亮蓝溶液
（4）脱色剂：7%冰乙酸
四、方法
1.分离胶（小孔胶）的制备：
将电泳用的玻璃管，洗净烘干；同时将需要的凝胶储备液从冰箱中取出，放至室温备用。
(1)电泳玻璃管的准备：
取一根洁净的电泳玻璃管，垂直放在青霉素瓶盖的凹穴中，并用橡皮泥固定在日光灯下，用40%蔗糖溶液密封。
(2) 分离胶的制备：
取一小烧杯，按表1的比例混合，用微量移液器取一定量胶液小心加入
到玻璃管内，在加的过程中注意不要混进空气，当加到液面距离电泳玻璃管上口2cm时停止。加水覆盖液面，勿使加入的蒸馏水与胶液混合。刚加入水层时在水层和胶面的交界处可见一明显的折光面，此折光面会逐渐消失，等再次出现时标志分离胶聚合已经开始，聚合60分钟后用滤纸小心吸去表面的水层，切勿破坏胶面的完整性。
2.浓缩胶 (大孔胶)的制备
另取小烧杯，按表2的比例混合，用微量移液器取一定量胶液小心加入到玻璃管至管口约0.5cm处，表面也覆盖一层蒸馏水。刚加入水层时在水层和胶面的交接处可见一明显的折光面，此折光面会逐渐消失，等再次出现时标志浓缩胶聚合已经开始，聚合30分钟后除去上面的水层，同样不要破坏胶面的完整性。吸去水层后用电泳缓冲液漂洗胶面，再用电泳缓冲液注满至管口，在室温下放置30分钟，备用。
3.待分离样品的制备：
40%蔗糖100μl，血清100μl，溴酚蓝200μl混匀备用。
4.加样：
将制好的胶管装入电泳槽中调节高度并塞紧，防止电泳中产生漏液。然后
分别在电泳槽的上下槽体内注入电泳缓冲液，下槽的液面应没过玻璃管的下管口（注意不要有气泡存在）和电极丝；上槽的液面应没过玻璃管口0.5cm。用微量注射器吸取20μl的样品，小心的加入电泳玻璃管内，注意不要让样品溢出管口。
5.电泳
将电泳仪和电泳槽连接，负极在上，正极在下，开通电源。开始时电流为1m A/管，待样品（溴酚蓝）进入分离胶后，电流可调节到3mA/管，当溴酚蓝到凝胶泳出管口时电泳结束。
6.剥胶
电泳结束后，取下玻璃管，用带长针头的注射器从浓缩胶一端紧贴玻璃管壁缓慢插入针头，一面注入蒸馏水一面缓慢旋转玻璃管同时推针前进。靠水流的压了力和润滑作用使凝胶和玻璃管的内壁分开，待水流从另一端流出时，再慢慢将针头退出。注意操作中不要把胶条搅碎。退出针头后将针头去掉，用注射器向玻璃管中快速注水，将胶条从玻璃管中那个压出。
7.固定染色
将取下的胶条放入染色液中，室温固定染色1～2小时 （根据季节的变化，调整染色时间）
8.洗脱
将染色完毕的胶条用脱色液浸泡，中间更换1～2次脱色液并浸泡过夜，
将浮色脱去进行观察染好色的蛋白带，胶条可以制成干胶长期保存。
表1：分离胶配方表
凝胶浓度（%）
7.2
双蒸水（ml）
2
Ａ储备液（ml）
2
Ｃ储备液（ml）
4
Ｅ储备液（μl）
8
总体积（ml）
16
表2：浓缩胶配方表：
胶液浓度（%）
3.1
Ｂ储备液（ml）
0.5
Ｄ储备液（ml）
1
G储备液（μl）
0.5
Ｆ储备液（ml）
2
总体积
4
五、注意事项
1：Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩
2：玻璃管表面应光滑洁净，蔗糖溶液封住管底，否则会造成凝胶与玻璃管之间产生气泡
3：尽量不要破坏胶面，否则样品区带不平整。
六：思考题
1：样品为什么会在浓缩胶内被压缩成狭窄的一条带？
2：为什么聚丙烯酰胺凝胶电泳有较高的分辨率？
3：为什么在分离胶和浓缩胶内使用不同的催化剂？
应用PCR技术扩增Hbβ基因
PCR(Polymerase Chain Reaction )是一种在体外特异的扩增基因的技术。由Kary.Mullis发明，该技术大大推动了分子生物学的发展，被认为是分子生物学发展的里程碑。Kary.Mullis分享了1993年诺贝尔化学奖。
复习细胞内DNA复制条件和过程。
一、目的
1：学习PCR技术的基本原理
2：掌握从全血中制备DNA的方法‘
3：掌握应用PCR扩增Hbβ基因的基本操作
4：熟悉Hb基因结构
二、原理
1：PCR扩增的原理
聚合酶链反应—PCR是一种体外基因扩增技术，是在引物和四种脱氧核苷三磷酸存在下，利用DNA 聚合酶反复作用，使微量的特定片段得以大量扩增的反应过程。
PCR所需的条件：模板
引物：决定扩增产物的特异性
dNTPs
Taq聚合酶
Mg2+
PCR反应过程
变性
94?C
延伸
72?C
退火
Tm-5
每三步为一个循环，每循环一次，使模板DNA拷贝数增加1倍，理论上讲，30个循环后，扩增产物为230拷贝
16 p12
z2 z1 j a a2 a1
2：Hb基因结构
jb2 e Gg Ag jb1 d b
11p12
本实验应用PCR技术扩增Hbβ基因上400bp片段
引物序列为 A：5′-AAG GAG ACC AAT AGA AAC TGG GC- 3′
B：5′-TCT CCC CTT CCT ATG ACA TGA AC- 3′
3：PCR产物的鉴定
含溴乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳
DNA在pH8.0电泳缓冲液环境下带负电荷，向阳极移动。DNA分子量大小及形状不同，电泳速度不同。在分子形状相同的条件下，分子量（bp数）越大，电泳速度越慢；分子量（bp数）越小，电泳速度越快；分子量（bp数）相同，电泳速度相同。所以PCR扩增产物可以根据分子量（bp数）的大小进行分离。bp数相同的DNA集中在同一位置上，与EB结合成复合物，在紫外灯激发下，发出桔红色的荧光，而形成桔红色的区带，根据Maker判断扩增产物的长度。
三、仪器与试剂
（一）主要仪器：PCR仪 潜水式电泳仪 微量移液器 台式高速离心机
（二） 试剂：裂解液（Tris-HCl TritonX-100） 生理盐水 双蒸水
PCR反应液 液体石蜡 载样缓冲液 电泳缓冲液
四、方法
（一）模板的制备
裂解细胞膜 1：用刻度离心管取全血0.5ml，加裂解液至3ml，颠倒混匀，振荡60～80次。3,000rpm离心10分钟。
去血红素 2：弃上清，加生理盐水至3ml，振荡直至沉淀成线状，3,000rpm离心10分钟。
3：重复步骤2一次
破坏细胞核膜 4：弃上清，离心管倒置在滤纸上控干，加ddH2O 50μl,用枪头搅动沉淀，直至沉淀完全溶解。
去除蛋白质 5：全部转移至1.5ml 离心 管，沸水锅中煮沸10分钟，12,000rpm离心5分钟，上清液即含有模板DNA。
（二）PCR扩增
反应体系：总体积：25 μl
模板液 5.0μl
缓冲液（含Mg2+） 2.0μl
dNTPs（2.5mM） 1.6μl
引物(10μm) 各0.8μl
Taq DNA聚合酶(2.5U/ml) 0.8μl
ddH2O 14.0μl
循环参数：预变性94℃ 2分钟
变性94℃ 30秒
退火55℃ 30秒
延伸72℃ 45秒
最后延伸72℃ 10分钟 共35个循环。
（三）扩增产物的鉴定：
1：制胶 将凝胶托架两端封闭并水平放置在工作台上，放上梳子，用1
×TBE缓冲溶液配制2﹪琼脂糖凝胶液,加热溶解.注到托架上,待凝固
后撤去两端封闭插片.
2:加样 将托架放入电泳槽中,加入1×TBE缓冲溶液使之没过胶面2
㎜，拔出梳子,向PCR产物中加入载样缓冲液,混合.将15μl混合物加入
凝胶样品孔中.载样缓冲液中有蔗糖和溴酚兰，可以增加样品比重,同时
有颜色指示剂的作用。
3:电泳 加样端接负极,盖上电泳槽,接通电源,以100V电压电泳25分钟.
4:观察结果 在紫外灯下观察电泳结果.与maker400bp相对应的区带为
Hbβ基因400bp片段.
五、注意事项
1：操作的整个过程中避免污染,因为PCR可以将微量的DNA进行扩增而造成假阳性
2：血红素是酶的抑制剂,必须去除干净，但在去除过程中注意勿丢失DNA。
3：加ddH2O破坏细胞核膜是关系到本实验结果好坏关键的一步,一定使核膜破坏充分,充分使DNA释放。
.
六、 PCR常见的问题及解决办法
常见的问题
解决办法
假阴性
模板
模板中蛋白质没有去除干净
保证模板的数量及质量
模板中含有Taq酶抑制剂
模板在制备过程中丢失过多
反应体系
酶的活性低
选择高质量的酶,尽量减少运输时间
引物设计不合理及浓度过低
Mg2+浓度过低
合理设计引物,摸索出最佳的引物浓度和Mg2+浓度
循环参数设置
变性温度过低,时间过短
退火温度过高
提高变性温度，延长变性时间，降低退火温度
出现非特异性扩增带
Mg2+浓度过高
降低Mg2+浓度
降底酶量
提高退火温度
合理设计引物
引物设计不合理
退火温度过低
酶量过多
出现片状拖带
模板量相对过少
增加摸板量
七、思考题
1：经过30个循环,PCR扩增产物是否是230拷贝?
2:体内DNA复制过程与体外DNA扩增过程有何不同?
实验九 转氨基作用（纸层析法）
一．目的
了解动物组织的转氨基作用，学习转氨基反应产物的纸层析鉴定方法。
二．原理
复习：氨基酸在体内分解代谢的主要方式是脱氨基作用。脱氨基作用的主要方式有氧化脱氨基、转氨基、联合脱氨基及非氧化脱氨基。转氨基是指在转氨酶的催化下，氨基酸的α-氨基与α-酮酸的α酮基的互换反应。转氨酶广泛分布于动物体的各器官组织中，各种转氨基作用都有专一的转氨酶催化。
本实验将谷氨酸和丙酮酸与肝匀浆一起保温，在肝细胞的丙氨酸转氨酶催化下产生丙氨酸。利用纸层析法鉴定丙氨酸的存在，证明组织内的转氨基作用。为了防止底物丙酮酸被组织中其它酶所氧化或还原，可加碘乙酸（或溴乙酸）抑制糖的酵解作用和氧化作用。
设计思路：测定管 对照管
谷氨酸和丙酮酸 谷氨酸和丙酮酸
结果
丙氨酸和α酮戊二酸 没有反应产物
用纸层析法鉴定转氨基产物丙氨酸的存在与否。原理为：谷氨酸和丙氨酸是理化性质不同的两种氨基酸，前者为亲水性氨基酸，后者为疏水性氨基酸，据此二者在固定相（水）与流动相（酚试剂）中的分配程度不同，因而流速不同。最后用茚三酮显色。
三．材料
（一）仪器 试管；离心管；离心机；剪刀及镊子；培养皿；表面皿；毛细管；喷雾器；吹风机。
（二）试剂
1．0.1%丙氨酸溶液
2．1%谷氨酸溶液
3．1%丙酮酸钠溶液
4．0.25%碘乙酸溶液
5．0.01 mol/LpH7.4磷酸缓冲液
6．0.1%茚三酮乙醇溶液
7．层析溶剂（酚的饱和水溶液）
四．方法
（一）肝匀浆的制备 取新鲜动物肝脏1克，置研钵中剪碎，加细砂少许，5ml预冷的0.01 mol/LpH7.4磷酸缓冲液，研磨成匀浆。
(二)转氨基反应
1．取小试管2支，分别标明测定和对照，各加肝匀浆10滴，将对照管立即置沸水浴中10分钟，取出冷却。
2．两管各加1%谷氨酸10滴，1%丙酮酸钠10滴，0.25%碘乙酸5滴，置40℃水浴中保温30分钟后取出。
3．两管各加5%三氯醋酸2滴，置沸水浴中5分钟（2000rpm），将上清液分别移入同样编号的小试管中备用。
（三）层析验证
1．取直径13cm圆形滤纸一张，用铅笔过圆心作两条相互垂直的线，在每条线上距圆心1cm处打点作记，作为点样处，并分别在其边缘标上测、谷、对、丙字样，见图9。
2．用毛细玻璃管分别蘸取测定液、1%谷氨酸溶液、对照液、0.1%丙氨酸溶液各一小滴，在滤纸上相应点样处点样2μl，点样斑点的直径不超过3mm。
3．用大头针在滤纸圆心扎一小孔（约1mm直径），另取滤纸条（0.5×2.5cm），卷成筒状，捻紧如灯芯，从滤纸上相应点样背面插入小孔，突出滤纸面约1cm。
4．加约2.5ml层析溶剂于直径为5cm的表面皿中，表面皿放在直径为10cm培养皿正中，将滤纸平放在培养皿上，使滤纸芯浸入层溶剂，取另一同样大小的培养皿反向盖上。层析溶剂沿滤纸芯上升到滤纸，并向四周扩散，待溶剂前沿距滤纸边缘1.5cm时，即可取出（层析时间约50分钟）。用铅笔划出溶剂前沿后，用吹风机或电炉烘干。
5．显色 将滤纸平放于培养皿上，喷雾0.1%茚三酮乙醇溶液，再用吹风机或电炉烘干。观察层析出现的弧形紫色斑，并用铅笔描出。计算各色斑的Rf值。
注意事项：操作中接触滤纸前要洗手擦净，并尽量避免手与滤纸中间部位接触。
思考题
为什么对照管是一个色斑，而测定管是两个色斑？这些色斑分别代表什么物质？又是如何证明的？
实验十 核酸的提取与鉴定——大白鼠肝DNA的提取与鉴定（8学时）
一、目的
掌握从动物组织中DNA基本原理和方法，了解利用电泳技术分离、鉴定核酸的原理和方法。
二、原理
真核生物DNA主要以核蛋白形式存在于细胞核中，因此制备DNA必须先粉碎组织，裂解细胞膜和核膜，使核蛋白释放，在除去蛋白质、脂类、糖类和RNA等物质，得到纯化的DNA。在本实验的提取DNA反应体系中，SDS（十二烷基磺酸钠）破坏细胞膜和核膜，并使蛋白质变性，将核蛋白中的DNA与蛋白质分开，EDTA及SDS抑制细胞中的DNA酶的活性。用酚、氯仿抽提的方法进一步除去蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀除净小分子化合物。提取出的DNA制品进一步用含溴乙锭的琼脂糖凝胶电泳加以鉴定。
三、材料
（一）仪器
研钵；研钵棒；刻度离心管；普通离心机；小试管；Ep管
（二）试剂
1、生理盐水
2、裂解缓冲液
3、苯酚：氯仿混合液（1：1）
4、无水乙醇
5、70％乙醇
6、TE缓冲液
7、溴酚蓝载样液
8、溴乙锭溶液
9、TBE缓冲液
四、操作步骤：
1、处死大白鼠，迅速取出大白鼠肝脏，用生理盐水洗去附着血液，用滤纸吸干血水后称量0.5g肝实质组织放于研钵中。
2、研钵中加入1ml裂解缓冲液、少量石英砂，研磨至匀浆，再加入2ml继续研磨至匀浆。
3、取刻度离心管一支，加肝匀浆至1.0ml，再加入等体积苯酚：氯仿混合液抽提，每次抽提以中等大小的力来回振荡5min，然后离心3000r/min，10min，水相吸入另一干净的小试管中，抽提重复3次『注1』。
4、往乘有上水相的小试管中加入2.5倍体积的冷无水乙醇，轻轻混匀，此时可见有白色絮状沉淀，此即DNA粗制品。
5、将试管中的上清液倒出，保留沉淀。用70％的乙醇洗涤沉淀2次，洗涤时动作要轻柔，同上法弃上清保留沉淀『注2』。
6、加入0.25mlTE缓冲液溶解沉淀。
7、取30ml沉淀溶解液放入Ep管中。
8、向Ep管中加入溴酚蓝载样液5ml，混匀后即为鉴定所用样品。
9、取琼脂糖0.3g，TBE缓冲液15ml加入锥形瓶中，加热锥形瓶使琼脂糖充分熔解后，加入10ml溴乙锭，混匀后将胶液倒入已放置样孔梳的胶板上。
10、待胶板凝好后拔去样孔梳，取15ml样品液加入样孔槽中。
11、将加好样品液的胶板放入乘有TBE缓冲液的电泳槽中，样孔槽位于阴极侧，盖好电泳槽盖后通电，调节电压100V电泳40-60min。
12、泳毕，拿出胶板，在紫外光灯下观察结果。
『注1』吸水相时不要将界面上的变性蛋白质混入，抽提3次后一般有机相和水相界面上的变性蛋白质极少，肉眼基本看不见，若变性蛋白质仍较多，可增加抽提次数。实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管管口需粗而短，并烧成钝口。
『注2』最后一次弃上清时，尽可能去尽上清。
思考题：
1、DNA的定量可采用哪些方法？
实验十一 醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质并定量
一、目的
1、了解分离纯化蛋白质，并进行蛋白质定量的原理及方法
2、了解利用醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质并定量操作方法。
二、原理
血清中各种蛋白质的等电点大都低于pH7.0，在pH8.6巴比妥缓冲液中，它们均电离成阴离子，在电场中向阴极泳动。由于各种蛋白质在同一pH环境中所带电荷多少及分子大小不同，所以在电场中的泳动速度不同。一般所来，蛋白质分子量小而带电荷多者，泳动速度快，分子量大而带电荷少者泳动速度慢，因此可以利用其泳速不同将之分开。
血清中含有清蛋白、α－球蛋白、β－球蛋白、γ－球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同（见下表）。
人血清蛋白质的分类，等电点，分子量及迁移率
血清蛋白质
等 电 点
（PI）
分 子 量
（MW）
迁移率μ
（cm2/s.v）
白蛋白（A）
4.8
68500
5.9×10-5
α1球蛋白（α1-G）
5.06
>10万
5.1×10-5
α2球蛋白（α2-G）
5.06
>10万
4.1×10-5
β球蛋白（β-G）
5.12
>10万
2.8×10-5
γ球蛋白（γ-G）
6.85-7.3
>10万
1.0×10-5
本实验用醋酸纤维素薄膜作为支持物进行电泳，分离各种血清蛋白。正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带，从阳极到阴极依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白。
醋酸纤维素素薄膜是由二乙酸纤维素加工制成，具有均一的泡沫结构，厚度仅120mm。醋酸纤维素素薄膜作为是电泳支持体有以下优点：①电泳后区带界限清晰；②通电时间较短（二十分钟至一小时）；③它对各种蛋白质（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都几乎完全不吸附，因此拖尾现象；④对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完无色。它的电渗作用虽高但很均一，不影响样品的分离效果，由于醋酸纤维素素薄膜水量较低，因此必需在密闭的容器中进行电泳，并使用较低有电流避免蒸发。
由于醋酸纤维素素薄膜作为支持物进行蛋白电泳，具有以上优点。故本实验最终采用此种方法分离血清蛋白质并加以定量。
三、材料
（一）器材
醋酸纤维素薄膜（2×8cm），培养皿，点样器，电泳仪，电泳槽，粗滤纸，镊子
（二）材料
新鲜血清（未溶血）
（三）试剂
1、巴比妥缓冲液（pH 8.6，离子强度0.06）：巴比妥1.66g, 巴比妥钠12.76g，加水至1000ml。置4℃冰箱保存，备用。
2、染色液：氨基黑10B 0.5g, 甲醇50ml, 冰醋酸10ml，蒸馏水40ml，混匀。
3、漂洗液：含95％乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml，混匀。
4、透明液：冰醋酸25ml，无水乙醇75ml，混匀。
四、方法
（一）准备电泳槽
电泳槽内放入巴比妥缓冲液。电泳槽应密闭使蒸汽饱和，避免水分蒸发。将电泳槽与电泳仪接好。
（二）点样
1、浸泡：用镊子取醋酸纤维素薄膜『注1』1张（识别光泽面和无光泽面），无光泽面朝下小心平放在盛有缓冲液的培养皿中，浸泡30min左右（浸至无白斑）。
2．点样『注2』：将浸透的薄膜从缓冲液取出（无光泽面朝上），用滤纸吸干多余的液体。点样时，先在点样器上均匀地沾上血清，在距阴极端1.5cm处将点样器轻轻地印在薄膜上，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线后迅速离开（见图）。
醋酸纤维素素薄膜规格及点样位置示意图（虚线处为点样位置）
（三）电泳：电泳槽架上分别用4层纱布连接电泳槽。将点样后的薄膜条置于纱布上，点样面朝下，点样端置于负极侧，薄膜条应平直，并与纱布紧贴。盖好电泳槽盖，静止平衡5min后通电，调节电压10-15V/cm，电流0.5mA/cm，电泳30-60min。
（四）染色与漂洗：
1、电泳完毕后将薄膜取下, 放在染色液中浸泡1-2min。
2、漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱净。取出薄膜放在滤纸上，晾干。
图4.7血清蛋白醋酸纤维素素薄膜电泳图谱示意图
（五）定量
1、洗脱比色：将各蛋白质区带仔细剪下，分置各试管中，另从空白背景剪块平均大小的膜条置于空白管中。各管加入0．4mol／lNaOH4ml,于37℃水浴20分钟(不时振荡)，待颜色脱净即用波长620nm比色，以空白管调零读m各管吸光度。
2、计算：
吸光度总和(T)=A+α1+α2+β+γ(吸光度)
血清蛋白组分的相对百分数：
A % = A/T*100%
α1 % = α1/T*100%
α2 % = α2/T*100%
β % = β%/T*100%
γ % = γ%/T*100%
注意事项
『注1』 市售醋酸纤维素素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。若飘浮于液面的薄膜在15－30s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳。
『注2』 点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不起，影响分离效果。点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。
思考题
1、为什么需将血清样品点在薄膜条的负极端？
2、如果是血浆，结果有何不同？
异常血红蛋白筛查
[复 习]
1. 血红蛋白及其组成；
2. 异常血红蛋白；
3. 影响电泳速度的因素。
[实验目的]
1. 学习血红蛋白电泳分离方法；
2. 能辨认正常人和异常血红蛋白的电泳图谱；
[实验原理]
血红蛋白是一种结合蛋白质，由血红素和珠蛋白组成。正常人所含珠蛋白的多肽链有a、b、d 、e、g和z六种。这六种肽链的基因在人体发育的不同阶段表达状况不一。正常成人红细胞中有三种血红蛋白即HbA、 HbA2 和 HbF。HbA（a2b2）是正常成人红细胞中的最主要的血红蛋白，占红细胞内血红蛋白总量的96%以上，PI=6.7。 HbA2(a2d2)是正常成人红细胞中的次要成分，占2~3% 左右，其PI>6.7。 HbF(a2g2)为胎儿血红蛋白，胎儿出生后六个月急剧持续下降至血红蛋白总量的1%以下，其PI接近 6.7。各种血红蛋白在pH8.5的缓冲液中均带负电荷在电场中都向阳极移动，但因等电点不同所带电荷数目不同而有不同的电泳速度。HbA因其所带电荷最多故向阳极泳动速度最快，又因其含量最多区带颜色最深。其后有一较浅的区带为HbA2, HbF与HbA的等电点接近，通常与HbA分不开
异常血红蛋白是指由于基因突变而导致结构异常的红蛋白。异血红蛋白具有与正常血红蛋白不同的电泳行为，因此用电泳的方法可以将其检出。例如HbS是一种由b-链第6位的谷氨酸被缬氨酸所替换而形成的异常血红蛋白，此变异体比HbA少带两个负电荷，因此，向阳极移动的速度比HbA慢,出现于HbA与HbA2之间．
分析血红蛋白的电泳方法有许多，如滤纸电泳.淀粉胶电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳等.但异常血红蛋白筛查最常用的还是醋酸纤维薄膜电泳法.因为醋酸纤维薄膜做支持体电泳操作简便,电泳速度快,分辨力强区带集中而且对染料不吸附,容易定量.用醋酸纤维素薄膜电泳筛查异常血红蛋白的检出率为1~2%o.
[器材与试剂]
1. 器材 电泳仪 电泳槽 醋酸纤维素薄膜
2. 试剂
(1) 浸泡醋酸纤维膜TBE缓冲夜(pH8.5);
(2)电泳槽硼酸缓冲液(pH8.6);
(3)丽春红染色液;
(4)漂洗液.
[步骤与方法]
1. 浸膜: 将醋酸纤维素薄膜(2´8cm)膜面向下放入浸膜液中,浸透后用眼科镊子压入液面底部
2. 采血:碘伏消毒耳垂部,用一次性采血针采血,并将血液吸在两次对折的滤纸尖部;
3. 加样: 将浸泡好的醋酸纤维素薄膜膜面向上放在滤纸上,用滤纸吸去多余的液体,在距一侧1.5cm处用沾血的滤纸.涂圆点状（直径约0.2cm）或线状;
4. 电泳: 将加好样的醋酸纤维素薄膜膜面向下放入电泳槽中的缓冲液纱布上，加样端放在负极,静置2分钟后开启电源,调电压200伏,电泳40分钟.
5. 电泳结束后,关掉电源,观察电泳图谱,并记录红色区带（几条）及分布（位置）情况.
6. 染色: 将醋酸纤维素薄膜放入染色液中2分钟,然后转入漂洗液中洗至背底呈白色,再观察结果.
（—）
（+）
[结果判断] 正常人全血血红蛋白电泳图谱
1. 未染色电泳图谱
HbA
HbA2
（—）
（+）
2. 染色后电泳图谱
含异常血红蛋白的样品：应在未染色前观察，除正常成分外，在任何位置出现的不经染色的红色区带，均可记为有异常血红蛋白存在。异常血红蛋白常以HbA为标准，分为快泳血红蛋白和慢泳血红蛋白。
[注意事项]
1. 醋酸纤维素膜一定要浸透（无白色斑点），加样前从浸膜液中取出，既要吸去多余的液体还不能使膜太干，否则都会影响电泳结果。
2. 加样时注意要加在醋酸纤维素的膜面，电泳时也要膜面向下放到电泳槽中的缓冲液纱布上。
[思考题]
1. 正常成人红细胞中的主要血红蛋白是什么？
2. 为什么HbA的电泳速度比HbA2 快？
3. a-珠蛋白肽链第30位的谷氨酸被谷氨酰胺所替换，由此构成的血红蛋白会在电泳图谱中何处出现？
1.加深对理论的理解，理论联系实际。
2.掌握实验的基本方法和技能。
3.培养严谨的科学态度和作风。
二.实验室规则
1.实验前需预习实验指导和有关理论，明确实验目的、原理、预期的结果、操作关键步骤及注意事项。
2.实验要严肃认真地按照操作规程进行，注意观察实验中出现的现象和结果，并把实验数据和结果及时如实记录在实验记录本上，课后根据实验结果进行科学分析。
3.实验室和实验台应保持整洁。公用试剂用毕，立即盖严并还原。实验完毕，仪器洗净放好。
4.注意节约药品、试剂和各种物品，爱护仪器，按规程操作仪器，以免损坏。如果损坏仪器照章赔偿。
5.实验结束离开实验室之前，关好窗户，切断电源，水源，确保安全。
三.实验课考核标准和考核方法
考核标准：实验课成绩占生化课总成绩的20％，共12次实验。每次实验为2分，缺课一次减2分，缺课1/3以上者，取消生化课考试资格。
考核方法：分实验过程考核和实验报告考核。
实验过程考核占1分，包括操作方法及实验结果评分。实验结果占0.4分（结果的正确度），实验操作占0.6分（包括分光光度法测试，离心机使用，层析法，电泳法等基本操作）。
实验报告考核占1分。要求书写规范，字迹清晰，结果分析合理，不允许抄袭。
实验一 基本操作
一.目的
1.熟悉实验室规则及常用生化仪器。
2.掌握各种仪器的正规操作。
3.清点洗刷实验用具。
一、 实验内容
（一） 常用生化仪器
量器：量筒、离心管、吸量管、容量瓶
玻璃仪器
容器：烧杯、试管、锥形瓶、滴管
仪器：离心机、水浴箱、电泳仪、分光光度计等
（二） 玻璃仪器的洗涤
1、初用的玻璃仪器的清洗：表面附有碱性物质，先用去污粉洗，再用自来水冲洗干净，然后浸于盐酸溶液浸泡过夜，再用自来水反复冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗1－2次，80℃烤干备用。
2、使用过的玻璃仪器洗涤
（1）一般非计量玻璃仪器或粗容量仪器，如烧杯、试管、量筒等先用肥皂水刷洗，再用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗1－2次，倒置晾干。
（2）量器，如滴定管、容量瓶等先用自来水冲洗，直至不挂水珠，再用蒸馏水冲洗1－2次，分干备用。若冲洗后仍挂水珠，则将其晾干后浸于铬酸洗液浸泡数小时。然后用自来水反复冲洗干净，再用蒸馏水冲洗1－2次，干燥备用。
（三）吸量管和微量移液器的使用
1.吸量管的使用（注意标签、选择容量大小合适的吸量管）
（1）正确拿法 中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端
（2）取液 用橡皮球吸液体至刻度上，眼睛看着液面上升；吸完后用食指顶住吸量管上端。
（3）调刻度 吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用食指控制液体下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。
（4）放液 吸量管移入准备接受溶液的容器中，仍使其出口尖端接触器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。奥氏吸量管和刻度到底的吸量管应吹出尖端残留的液体。移液管应最后靠壁15秒。
2.微量移液器的使用
调节体积选取钮至所需值，套上吸头，旋紧。垂直持握移液器，用大拇指按下液体吸放钮至第1档，将吸头插入待吸溶液，松开大拇指使吸放钮回复原位。将移液器移入准备接受液体的仪器，用大拇指再次按下液体吸放钮，至第1档后继续至第2档以排空液体。
3.练习吸量管的使用
取50ml锥形瓶加入未知酸5ml ,酚酞指示剂1滴，摇匀，用0.01mol/LNaOH滴定，记录结果。（无色酚酞遇酸不变色，遇碱变红。）滴定时边滴边摇动锥形瓶。
(四)离心机的使用方法
离心机是利用离心力将悬浮液中的微粒从溶液中分离出来的一种仪器。根据最高离心转速的不同可将离心机分为三种类型：普通离心机，其最高转速一般在4000转/分至6000转/分；高速离心机，转速可达10000转/分至25000转/分；超速离心机，转速可超过50000转/分以上。生化实验室常使用普通离心机。
普通离心机的使用方法：
1．使用前先检查变速旋钮是否在“0”位，外套管是否完整无损和垫有橡皮垫。
2．离心时先将待离心的物质转移到大小合适的离心管内，盛量不宜过多,占管的2/3体积为宜,以免溢出。将此离心管放入外套管，再在离心管与外套管间加入缓冲用水。
3．将一对装有离心管的外套管在台称上平衡。如不平衡可调整缓冲用水或离心物质的量。
4．将平衡好的套管，按对称方位放到离心机插孔中。把不用的离心套管取出，盖严离心机盖。
5．接通电源，开启开关，平稳、缓慢移动调速手柄，至所需转速。计时。
6．当达到离心所需时间后，将调速柄慢慢调回零位，关闭开关。待离心机自动停止转动后，再打开离心机盖取出样品。
7．用完后，取出套管中橡皮垫洗净，冲洗外套管，倒置干燥。
实验三 凝胶层析法分离蛋白质
一．目的
1．了解层析技术的基本原理；
2．初步掌握分子筛层析的原理和操作方法。
二．原理
介绍层析的概念
所谓层析，就是利用样品中各组成成分的理化性质的差异，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，由于各组分随流动相前进的速率不同，从而把它们分离开来的技术。这些物理特性包括分子的大小、形状、所带电荷、挥发性、溶解性及吸附性质等。层析系统的必要组分有：
a. 固定相，可以是一种固体、凝胶或固定化的液体
b. 层析床，把固定相填入一个玻璃或金属柱中，或者薄薄涂布一层于玻璃或塑料片上或者吸附在醋酸纤维纸上。
c. 流动相，起溶剂作用的液体或气体
d. 运送系统，用来促使流动相通过层析床。
e. 检测系统，用于检测试管中的物质。
由于不同物质固定相相互作用的强弱不同，从而使得分离目的得以实现。
要点：层析系统中，与固定相作用强的物质受到的阻力最大，而作用弱的物质受到的阻力很小，因而不同物质在层析过程中的迁移距离和洗脱时间不同。
介绍凝胶层析的概念。凝胶层析又称分子筛层析，主要根据混合物中分子的大小和形状不同，在通过凝胶时，分子的扩散速率各异而达到分离的目的。凝胶颗粒具有多孔性网状结构，小分子易进入凝胶网孔，流程长而移动速度慢，而大分子物质不能进入凝胶网孔，沿凝胶颗粒间隙流动，流程短移动快。这种现象称为分子筛效应。
在凝胶层析中常用的凝胶有葡聚糖凝胶(商品名Sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel-P)和琼脂糖凝胶(Agarose)。葡聚糖凝胶是由细菌葡聚糖(又称右旋糖苷)在糖的长链间用交联剂1-氯-2，3-环氧丙烷交联而成。在合成时，调节葡聚糖和交联剂的比例，可以获得具有网孔大小不同的凝胶。G值表示交联度，G值愈大，交联度愈小，网孔和吸水量越大。
本实验通过SephadexG50层析柱，以蒸馏水为洗脱剂，分离血红蛋白(红色，分子量约64500)与硫酸铜(蓝色，分子量249.5)的混合物，从颜色的不同可观察到血红蛋白洗脱快，硫酸铜洗脱较慢。
三．材料
1．仪器 层析柱(直径0.8-1.5cm，长10-20cm)；吸管；玻璃棒；小烧杯；25ml量筒；试管。
2．试剂 Sephadex G-50；抗凝血； 0.9%NaCI溶液；硫酸铜溶液
四．方法
（一）凝胶的准备。由准备室制备。
（二）样品制备
1．血红蛋白(Hb)溶液的制备 取抗凝血液约0.5ml于离心管中，离心5分钟(2500rpm)，弃去上层血浆，用0.9%NaCI溶液3ml洗血细胞二次，将血细胞用1.5ml蒸馏水稀释，即为Hb稀释液，备用。
3．取Hb稀释液与CuSO4溶液各0.5ml，充分混匀，此混合液作为样品。
（三）装柱 取层析柱(直径0.8-1.5cm，长度20cm)一支，将层析柱烧结板下端的死区用蒸馏水充满，不得留有气泡，然后关闭层析柱的出口。将已溶胀的凝胶悬液沿玻棒小心地徐徐灌入柱中，待底部凝胶沉积1-2cm时，再打开出口，继续加入凝胶悬液至凝胶层积集至约15cm高度即可。凝胶悬液尽量一次加完，以免出现不均匀或分层的凝胶带。如表层凝胶凸凹不平时，可用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降，使表面平整。
（四）加样与洗脱：加样时先将柱的出口打开，让蒸馏水逐渐流出，待床面上只留下极薄的一层蒸馏水时，关闭出口。用滴管将样品(约0.4ml)小心地加到凝胶床的表面上。注意加样时不要将床面冲起，亦不要沿柱壁加入。然后，打开出口，使样品恰好进入床面(不要让空气进入床内)，用上法滴加1-2倍样品体积的蒸馏水，待完全流进床内后，再加蒸馏水进行扩展洗脱，直至两条区带分开为止。
注意事项：洗脱的过程中，应不断滴加蒸馏水，使始终凝胶床的上表面保留约2cm左右的蒸馏水
思考题
1. 凝胶层析法的基本原理是什么？假如分离几种分子量大于20000的蛋白质，应选用什么型的交联葡聚糖凝胶？
2. 应用本法分离血红蛋白与硫酸铜，怎样才能得到较好的分离效果？
实验四 影响酶活性的因素
（一）pH对酶活性的影响
一．目的
1．了解pH值对酶促反应速度影响。
2．掌握测定唾液淀粉酶活性的原理及定性方法。
二．原理
复习：1．酶：由活细胞产生的，对其特异底物起高效催化作用的蛋白质。
2．酶促反应：酶所催化的化学反应。
3．影响酶促反应速度的因素：[S]、[E]、pH、温度、激动剂与抑制剂
过酸过碱都能使酶蛋白变性而使其丧失活性。在不致使变性的pH值范围内，酶的活性会因pH值不同而不同。由于酶是一种蛋白质，在不同氢离子浓度下，其解离的情况不同，但往往只有一种情况下才是该酶的最高活力，此时pH值称为酶的最适pH值。倘若其作用条件偏离最适pH值任何方面，都将引起酶活性的降低，减慢酶促反应速度。
唾液淀粉酶能使淀粉水解成一系列比较简单的化合物，最终产物为麦芽糖，利用其与碘液的不同呈色反应，即可推知淀粉酶水解淀粉的程度和pH对唾液淀粉酶的活性影响，并可指出唾液粉酶的最适pH。
pH
v
最适pH
淀粉 紫色糊精 红色糊精 麦芽糖
(遇碘呈蓝色、遇碘呈紫色、遇碘呈红色、遇碘呈淡黄色)
三．操作方法
制备唾液：将放一薄层棉花的漏斗置于10ml量筒顶端，5名以上的学生吐1ml唾液，倒入100ml量筒中，用蒸馏水将小量筒冲洗倒入大量筒中，加蒸馏水至100ml，用吸量管混匀唾液。
取试管3支，编号，按表加各种试剂。
编号
0.5%淀粉液(ml)
pH5.0缓冲液(ml)
pH6.8缓冲液(ml)
pH8.0缓冲液(ml)
唾液(ml)
1
1
2
1
2
1
2
1
3
1
2
1
摇匀放入37℃水浴中保温3分钟，用滴管吸取pH6.8管内液体一滴，在白瓷盘中用碘液检查是否水解完全，然后向各管加碘液3滴，观察结果解释之。
（二）温度对酶活性的影响
一．目的
了解温度对酶活性的影响。
二．原理
在低温时酶的催化反应速度一般很低，温度升高催化反应速度也随之升高，但酶是一种蛋白质，升高温度可以引起蛋白质的变性，使酶的活性降低。所以温度对酶的活性有二种相反的影响，一般在比较低温范围内(例如0-40℃)，温度对酶蛋白变性影响不大，活性随温度升高而增高。各种酶都有它的最适温度，此时酶表现最高的活力。机体大多数酶的最适温度在37℃—40℃。本实验利用碘与淀粉的反应，来比较唾液淀粉酶在不同温度对淀粉的水解速度。
温度
v
最适温度
三．操作方法
取试管4支，标号。在各管中均加入0.2%淀粉液2ml和pH6.8缓冲液1ml。然后，把第一试管置于40℃的水浴中，第二试管放在室温下，第三放在冰水中，约2分钟后，向第一、第二、第三试管再加稀释唾液1ml，第四试管加入煮沸的唾液1ml，摇匀。隔2分钟左右以第一试管取出几滴反应液至白瓷盘内，检查完全水解后，取出各管，分别加碘液1滴，观察颜色变化并解释之。
（三）激动剂与抑制剂对酶活性的影响
一．目的
了解激动剂与抑制剂对酶活性的影响。
二．原理
酶活性常受一些物质影响。在酶反应体系中加入某些物质能增高酶活性，亦即加速酶促反应的进行，而另外某些物质能降低酶的活性，即减缓甚至完全停止酶促反应的进行。前者称为激动剂，后者称为抑制剂。许多电解质是酶的激动剂，某些重金属盐则是酶的抑制剂。激动剂与抑制剂影响酶活性的需要量是很小的，并常具有特异性。本实验用氯离子和铜离子，说明对唾液淀粉酶的激动和抑制。
三．操作方法
取试管4支，编号，按表分别加入试剂，摇匀，迅速置于37℃的水浴中，15分钟后取出，冷却后分别加入碘液3滴，观察其颜色变化，并解释之。
编号
0.25%淀粉液(ml)
pH6.8缓冲液(ml)
H2O(ml)
0.3%Nacl
(ml)
1%CuSO4
(ml)
唾液
(ml)
1
3
1
2
—
—
—
2
3
1
1
—
―
1
3
3
1
—
1
―
1
4
3
1
—
—
1
1
四.注意事项：
1.制备混合唾液，并将唾液混匀。
2.试管正确编号。
3.三种浓度淀粉不要加错，淀粉用之前混匀。
4.最后加唾液，加完淀粉、唾液后将二者充分混匀，混匀时间不超过一分钟。
五.思考题：
1. 影响酶促反应的主要因素有哪些？
2. 出现何种结果，说明酶活性最高；出现何种结果，说明酶活性最低？
蛋白质定量（双缩脲法）
[复 习]
1. 组成蛋白质的基本单位及肽键的形成；
2. 双缩脲及双缩脲反应；
3. 利用分光光度法测定样品浓度的方法（标准比较法、标准曲线法、回归分析法）
[实验目的]
1. 掌握双缩脲法测定蛋白质的操作方法和原理；
2. 学会制作标准曲线；
3. 正确使用721分光光度计。
[实验原理]
蛋白质分子具有两个以上的肽键，因此在硷性溶液中能与Cu2+形成紫红色的配合物，该配合物颜色的深浅与蛋白质的浓度呈正比。在相同的实验条件下配制标准蛋白溶液和样品液并于540 nm波长下比色，通过标准蛋白液的标准曲线可求出样品液的蛋白质浓度。
[器材与试剂]
一、 器材
1. 试管及试管架； 2. 刻度吸量管； 3. 721分光光度计。
二、 试剂
1. 标准酪蛋白溶液（5mg/ml）
2. 双缩脲试剂；
3. 样品液（稀释10倍的血清）
[步骤与方法]
试剂（ml）/管号
1
2
3
4
5
6
标准酪蛋白溶液
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
蒸馏水
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
0
双缩脲试剂
4
4
4
4
4
4
一、绘制标准曲线： 按下表加试剂
充分混匀后室温放置30分钟，观察各管颜色并以1号管作空白对照，在540nm 波长下进行比色，记录各管OD值，然后以OD值为纵坐标，酪蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线图。
二、样品液的测定：按下表加入试剂
试剂（ml/管号）
1
2
3
样品液
1
1
0
蒸馏水
1
1
2
双缩脲试剂
4
4
4
充分混匀后在室温放置30分钟，在560nm波长下比色，以3号管为空白对照，测定并记录两管OD值，计算平均值，以平均值从标准曲线上查出样品液中蛋白质的含量。
[注意事项]
1. 注意吸量管的正确使用，加样量一定要准确；
2. 充分混匀各管溶液，以免显色不均。
3. 样品液中蛋白质含量以质量浓度表示（g/升）。
[思考题] 1. 为什么测定未知样品时要用两个相同的测定管？
2.不用标准曲线如何测定未知样品液中的蛋白质浓度？
聚丙烯酰胺凝胶电泳
复习电泳的概念、影响电泳的因素。
一、 目的
1：学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理
2：掌握聚丙烯酰胺凝胶不连续圆盘电泳分离血清蛋白质的方法。
二、原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N¢，N¢—四甲基乙二胺(N，N，N¢，N¢—tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。采用不同浓度的Acr、Bis，产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小，形状来选择凝胶浓度。大多数蛋白质在7.5﹪凝胶中能得到满意的结果。根据凝胶系统的均匀性，可分为连续性凝胶电泳和不连续凝胶电泳；按凝胶形状可分为圆盘状电泳和平板电泳；根据分离的蛋白质是否变性可分为非变性、变性（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）。
聚丙烯酰胺凝胶不连续圆盘电泳示意图
（A为正面 B为剖面）
1样品胶pH6.7
2浓缩胶：是大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1
3分离胶；是小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1
4电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液
可见电泳系统是不连续的。进行电泳时，样品物质被分成狭窄的圆盘状区带，故称为不连续圆盘电泳。可根据三种效应将样品进行分离：浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。
浓缩效应：
⑴：被分离的蛋白质分子在浓缩胶（大孔胶）中受到阻力小移动速度快，当走到分离胶（小孔胶）处时，阻力突然加大，移动速度急剧减慢，样品的分离区带变窄，浓度升高。
⑵：通电后，电极槽缓冲液中的甘氨酸进入浓缩胶，遇到pH6.7的凝胶缓冲液，甘氨酸解离度明显降低，负电荷减少，向正极移动速度变慢，称为尾随离子或慢离子；C1-在任何pH下都处于解离状态，所以泳动速度最快，称为前导离子或快离子；而蛋白质在pH6.7条件下，大部分以负离子形式存在，带较多的负电荷，泳动速度居于上述两者之间。结果在浓缩胶中，3种离子的泳动速度为C1-＞蛋白质离子＞甘氨酸离子。C1-迅速向前移动，在它后面形成一个低离子浓度的低电导区域，电导与电势梯度成反比，所以低电导区就有较高的电势梯度。这种高电势梯度迫使蛋白质离子和甘氨酸离子在此区域内加速前进，追赶快离子，夹在快慢离子中间的蛋白质就在这种追赶过程中被逐渐压缩成一条狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，pH由6.7变为8.9，甘氨酸的解离度增加，负电荷增多，泳动加快，超过蛋白质的泳动速度，此时凝胶中高电势梯度区域消失，蛋白质样品在均一的电势梯度和均一pH条件下，在分离胶中按分子筛效应和电荷效应进行分离。
分子筛效应：蛋白质分子越大，阻力越大，移动的速度越慢：蛋白质分子越小，阻力越小，移动的速度越快。
电荷效应：蛋白质的pI越小，所带负电荷越多，电泳速度越快；蛋白质的pI越大，所带负电荷越少，电泳速度越慢。
三、仪器与试剂
（一）主要的仪器：电泳仪
圆盘电泳槽
电泳玻璃管
微量注射器
日光灯
（二）试剂
（1）凝胶储备液
A储备液：分离胶缓冲液 pH8.9 Tris-HCl缓冲液：
B储备液：浓缩胶缓冲液 pH6.7 Tris~HCl缓冲液：
C储备液：分离胶储备液
D储备液：浓缩胶储备液
Ｅ储备液4% Ap（W/V）
Ｆ储备液40%蔗糖
G储备液 核黄素4mg定容到100ml
（2）电泳缓冲液：
pH8.3 Tris-甘氨酸
（3）染色液：考马斯亮蓝溶液
（4）脱色剂：7%冰乙酸
四、方法
1.分离胶（小孔胶）的制备：
将电泳用的玻璃管，洗净烘干；同时将需要的凝胶储备液从冰箱中取出，放至室温备用。
(1)电泳玻璃管的准备：
取一根洁净的电泳玻璃管，垂直放在青霉素瓶盖的凹穴中，并用橡皮泥固定在日光灯下，用40%蔗糖溶液密封。
(2) 分离胶的制备：
取一小烧杯，按表1的比例混合，用微量移液器取一定量胶液小心加入
到玻璃管内，在加的过程中注意不要混进空气，当加到液面距离电泳玻璃管上口2cm时停止。加水覆盖液面，勿使加入的蒸馏水与胶液混合。刚加入水层时在水层和胶面的交界处可见一明显的折光面，此折光面会逐渐消失，等再次出现时标志分离胶聚合已经开始，聚合60分钟后用滤纸小心吸去表面的水层，切勿破坏胶面的完整性。
2.浓缩胶 (大孔胶)的制备
另取小烧杯，按表2的比例混合，用微量移液器取一定量胶液小心加入到玻璃管至管口约0.5cm处，表面也覆盖一层蒸馏水。刚加入水层时在水层和胶面的交接处可见一明显的折光面，此折光面会逐渐消失，等再次出现时标志浓缩胶聚合已经开始，聚合30分钟后除去上面的水层，同样不要破坏胶面的完整性。吸去水层后用电泳缓冲液漂洗胶面，再用电泳缓冲液注满至管口，在室温下放置30分钟，备用。
3.待分离样品的制备：
40%蔗糖100μl，血清100μl，溴酚蓝200μl混匀备用。
4.加样：
将制好的胶管装入电泳槽中调节高度并塞紧，防止电泳中产生漏液。然后
分别在电泳槽的上下槽体内注入电泳缓冲液，下槽的液面应没过玻璃管的下管口（注意不要有气泡存在）和电极丝；上槽的液面应没过玻璃管口0.5cm。用微量注射器吸取20μl的样品，小心的加入电泳玻璃管内，注意不要让样品溢出管口。
5.电泳
将电泳仪和电泳槽连接，负极在上，正极在下，开通电源。开始时电流为1m A/管，待样品（溴酚蓝）进入分离胶后，电流可调节到3mA/管，当溴酚蓝到凝胶泳出管口时电泳结束。
6.剥胶
电泳结束后，取下玻璃管，用带长针头的注射器从浓缩胶一端紧贴玻璃管壁缓慢插入针头，一面注入蒸馏水一面缓慢旋转玻璃管同时推针前进。靠水流的压了力和润滑作用使凝胶和玻璃管的内壁分开，待水流从另一端流出时，再慢慢将针头退出。注意操作中不要把胶条搅碎。退出针头后将针头去掉，用注射器向玻璃管中快速注水，将胶条从玻璃管中那个压出。
7.固定染色
将取下的胶条放入染色液中，室温固定染色1～2小时 （根据季节的变化，调整染色时间）
8.洗脱
将染色完毕的胶条用脱色液浸泡，中间更换1～2次脱色液并浸泡过夜，
将浮色脱去进行观察染好色的蛋白带，胶条可以制成干胶长期保存。
表1：分离胶配方表
凝胶浓度（%）
7.2
双蒸水（ml）
2
Ａ储备液（ml）
2
Ｃ储备液（ml）
4
Ｅ储备液（μl）
8
总体积（ml）
16
表2：浓缩胶配方表：
胶液浓度（%）
3.1
Ｂ储备液（ml）
0.5
Ｄ储备液（ml）
1
G储备液（μl）
0.5
Ｆ储备液（ml）
2
总体积
4
五、注意事项
1：Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩
2：玻璃管表面应光滑洁净，蔗糖溶液封住管底，否则会造成凝胶与玻璃管之间产生气泡
3：尽量不要破坏胶面，否则样品区带不平整。
六：思考题
1：样品为什么会在浓缩胶内被压缩成狭窄的一条带？
2：为什么聚丙烯酰胺凝胶电泳有较高的分辨率？
3：为什么在分离胶和浓缩胶内使用不同的催化剂？
应用PCR技术扩增Hbβ基因
PCR(Polymerase Chain Reaction )是一种在体外特异的扩增基因的技术。由Kary.Mullis发明，该技术大大推动了分子生物学的发展，被认为是分子生物学发展的里程碑。Kary.Mullis分享了1993年诺贝尔化学奖。
复习细胞内DNA复制条件和过程。
一、目的
1：学习PCR技术的基本原理
2：掌握从全血中制备DNA的方法‘
3：掌握应用PCR扩增Hbβ基因的基本操作
4：熟悉Hb基因结构
二、原理
1：PCR扩增的原理
聚合酶链反应—PCR是一种体外基因扩增技术，是在引物和四种脱氧核苷三磷酸存在下，利用DNA 聚合酶反复作用，使微量的特定片段得以大量扩增的反应过程。
PCR所需的条件：模板
引物：决定扩增产物的特异性
dNTPs
Taq聚合酶
Mg2+
PCR反应过程
变性
94?C
延伸
72?C
退火
Tm-5
每三步为一个循环，每循环一次，使模板DNA拷贝数增加1倍，理论上讲，30个循环后，扩增产物为230拷贝
16 p12
z2 z1 j a a2 a1
2：Hb基因结构
jb2 e Gg Ag jb1 d b
11p12
本实验应用PCR技术扩增Hbβ基因上400bp片段
引物序列为 A：5′-AAG GAG ACC AAT AGA AAC TGG GC- 3′
B：5′-TCT CCC CTT CCT ATG ACA TGA AC- 3′
3：PCR产物的鉴定
含溴乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳
DNA在pH8.0电泳缓冲液环境下带负电荷，向阳极移动。DNA分子量大小及形状不同，电泳速度不同。在分子形状相同的条件下，分子量（bp数）越大，电泳速度越慢；分子量（bp数）越小，电泳速度越快；分子量（bp数）相同，电泳速度相同。所以PCR扩增产物可以根据分子量（bp数）的大小进行分离。bp数相同的DNA集中在同一位置上，与EB结合成复合物，在紫外灯激发下，发出桔红色的荧光，而形成桔红色的区带，根据Maker判断扩增产物的长度。
三、仪器与试剂
（一）主要仪器：PCR仪 潜水式电泳仪 微量移液器 台式高速离心机
（二） 试剂：裂解液（Tris-HCl TritonX-100） 生理盐水 双蒸水
PCR反应液 液体石蜡 载样缓冲液 电泳缓冲液
四、方法
（一）模板的制备
裂解细胞膜 1：用刻度离心管取全血0.5ml，加裂解液至3ml，颠倒混匀，振荡60～80次。3,000rpm离心10分钟。
去血红素 2：弃上清，加生理盐水至3ml，振荡直至沉淀成线状，3,000rpm离心10分钟。
3：重复步骤2一次
破坏细胞核膜 4：弃上清，离心管倒置在滤纸上控干，加ddH2O 50μl,用枪头搅动沉淀，直至沉淀完全溶解。
去除蛋白质 5：全部转移至1.5ml 离心 管，沸水锅中煮沸10分钟，12,000rpm离心5分钟，上清液即含有模板DNA。
（二）PCR扩增
反应体系：总体积：25 μl
模板液 5.0μl
缓冲液（含Mg2+） 2.0μl
dNTPs（2.5mM） 1.6μl
引物(10μm) 各0.8μl
Taq DNA聚合酶(2.5U/ml) 0.8μl
ddH2O 14.0μl
循环参数：预变性94℃ 2分钟
变性94℃ 30秒
退火55℃ 30秒
延伸72℃ 45秒
最后延伸72℃ 10分钟 共35个循环。
（三）扩增产物的鉴定：
1：制胶 将凝胶托架两端封闭并水平放置在工作台上，放上梳子，用1
×TBE缓冲溶液配制2﹪琼脂糖凝胶液,加热溶解.注到托架上,待凝固
后撤去两端封闭插片.
2:加样 将托架放入电泳槽中,加入1×TBE缓冲溶液使之没过胶面2
㎜，拔出梳子,向PCR产物中加入载样缓冲液,混合.将15μl混合物加入
凝胶样品孔中.载样缓冲液中有蔗糖和溴酚兰，可以增加样品比重,同时
有颜色指示剂的作用。
3:电泳 加样端接负极,盖上电泳槽,接通电源,以100V电压电泳25分钟.
4:观察结果 在紫外灯下观察电泳结果.与maker400bp相对应的区带为
Hbβ基因400bp片段.
五、注意事项
1：操作的整个过程中避免污染,因为PCR可以将微量的DNA进行扩增而造成假阳性
2：血红素是酶的抑制剂,必须去除干净，但在去除过程中注意勿丢失DNA。
3：加ddH2O破坏细胞核膜是关系到本实验结果好坏关键的一步,一定使核膜破坏充分,充分使DNA释放。
.
六、 PCR常见的问题及解决办法
常见的问题
解决办法
假阴性
模板
模板中蛋白质没有去除干净
保证模板的数量及质量
模板中含有Taq酶抑制剂
模板在制备过程中丢失过多
反应体系
酶的活性低
选择高质量的酶,尽量减少运输时间
引物设计不合理及浓度过低
Mg2+浓度过低
合理设计引物,摸索出最佳的引物浓度和Mg2+浓度
循环参数设置
变性温度过低,时间过短
退火温度过高
提高变性温度，延长变性时间，降低退火温度
出现非特异性扩增带
Mg2+浓度过高
降低Mg2+浓度
降底酶量
提高退火温度
合理设计引物
引物设计不合理
退火温度过低
酶量过多
出现片状拖带
模板量相对过少
增加摸板量
七、思考题
1：经过30个循环,PCR扩增产物是否是230拷贝?
2:体内DNA复制过程与体外DNA扩增过程有何不同?
实验九 转氨基作用（纸层析法）
一．目的
了解动物组织的转氨基作用，学习转氨基反应产物的纸层析鉴定方法。
二．原理
复习：氨基酸在体内分解代谢的主要方式是脱氨基作用。脱氨基作用的主要方式有氧化脱氨基、转氨基、联合脱氨基及非氧化脱氨基。转氨基是指在转氨酶的催化下，氨基酸的α-氨基与α-酮酸的α酮基的互换反应。转氨酶广泛分布于动物体的各器官组织中，各种转氨基作用都有专一的转氨酶催化。
本实验将谷氨酸和丙酮酸与肝匀浆一起保温，在肝细胞的丙氨酸转氨酶催化下产生丙氨酸。利用纸层析法鉴定丙氨酸的存在，证明组织内的转氨基作用。为了防止底物丙酮酸被组织中其它酶所氧化或还原，可加碘乙酸（或溴乙酸）抑制糖的酵解作用和氧化作用。
设计思路：测定管 对照管谷氨酸和丙酮酸 谷氨酸和丙酮酸
结果
丙氨酸和α酮戊二酸 没有反应产物
用纸层析法鉴定转氨基产物丙氨酸的存在与否。原理为：谷氨酸和丙氨酸是理化性质不同的两种氨基酸，前者为亲水性氨基酸，后者为疏水性氨基酸，据此二者在固定相（水）与流动相（酚试剂）中的分配程度不同，因而流速不同。最后用茚三酮显色。
三．材料
（一）仪器 试管；离心管；离心机；剪刀及镊子；培养皿；表面皿；毛细管；喷雾器；吹风机。
（二）试剂
1．0.1%丙氨酸溶液
2．1%谷氨酸溶液
3．1%丙酮酸钠溶液
4．0.25%碘乙酸溶液
5．0.01 mol/LpH7.4磷酸缓冲液
6．0.1%茚三酮乙醇溶液
7．层析溶剂（酚的饱和水溶液）
四．方法
（一）肝匀浆的制备 取新鲜动物肝脏1克，置研钵中剪碎，加细砂少许，5ml预冷的0.01 mol/LpH7.4磷酸缓冲液，研磨成匀浆。
(二)转氨基反应
1．取小试管2支，分别标明测定和对照，各加肝匀浆10滴，将对照管立即置沸水浴中10分钟，取出冷却。
2．两管各加1%谷氨酸10滴，1%丙酮酸钠10滴，0.25%碘乙酸5滴，置40℃水浴中保温30分钟后取出。
3．两管各加5%三氯醋酸2滴，置沸水浴中5分钟（2000rpm），将上清液分别移入同样编号的小试管中备用。
（三）层析验证
1．取直径13cm圆形滤纸一张，用铅笔过圆心作两条相互垂直的线，在每条线上距圆心1cm处打点作记，作为点样处，并分别在其边缘标上测、谷、对、丙字样，见图9。
2．用毛细玻璃管分别蘸取测定液、1%谷氨酸溶液、对照液、0.1%丙氨酸溶液各一小滴，在滤纸上相应点样处点样2μl，点样斑点的直径不超过3mm。
3．用大头针在滤纸圆心扎一小孔（约1mm直径），另取滤纸条（0.5×2.5cm），卷成筒状，捻紧如灯芯，从滤纸上相应点样背面插入小孔，突出滤纸面约1cm。
4．加约2.5ml层析溶剂于直径为5cm的表面皿中，表面皿放在直径为10cm培养皿正中，将滤纸平放在培养皿上，使滤纸芯浸入层溶剂，取另一同样大小的培养皿反向盖上。层析溶剂沿滤纸芯上升到滤纸，并向四周扩散，待溶剂前沿距滤纸边缘1.5cm时，即可取出（层析时间约50分钟）。用铅笔划出溶剂前沿后，用吹风机或电炉烘干。
5．显色 将滤纸平放于培养皿上，喷雾0.1%茚三酮乙醇溶液，再用吹风机或电炉烘干。观察层析出现的弧形紫色斑，并用铅笔描出。计算各色斑的Rf值。
注意事项：操作中接触滤纸前要洗手擦净，并尽量避免手与滤纸中间部位接触。
思考题
为什么对照管是一个色斑，而测定管是两个色斑？这些色斑分别代表什么物质？又是如何证明的？
实验十 核酸的提取与鉴定——大白鼠肝DNA的提取与鉴定（8学时）
一、目的
掌握从动物组织中DNA基本原理和方法，了解利用电泳技术分离、鉴定核酸的原理和方法。
二、原理
真核生物DNA主要以核蛋白形式存在于细胞核中，因此制备DNA必须先粉碎组织，裂解细胞膜和核膜，使核蛋白释放，在除去蛋白质、脂类、糖类和RNA等物质，得到纯化的DNA。在本实验的提取DNA反应体系中，SDS（十二烷基磺酸钠）破坏细胞膜和核膜，并使蛋白质变性，将核蛋白中的DNA与蛋白质分开，EDTA及SDS抑制细胞中的DNA酶的活性。用酚、氯仿抽提的方法进一步除去蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀除净小分子化合物。提取出的DNA制品进一步用含溴乙锭的琼脂糖凝胶电泳加以鉴定。
三、材料
（一）仪器
研钵；研钵棒；刻度离心管；普通离心机；小试管；Ep管
（二）试剂
1、生理盐水
2、裂解缓冲液
3、苯酚：氯仿混合液（1：1）
4、无水乙醇
5、70％乙醇
6、TE缓冲液
7、溴酚蓝载样液
8、溴乙锭溶液
9、TBE缓冲液
四、操作步骤：
1、处死大白鼠，迅速取出大白鼠肝脏，用生理盐水洗去附着血液，用滤纸吸干血水后称量0.5g肝实质组织放于研钵中。
2、研钵中加入1ml裂解缓冲液、少量石英砂，研磨至匀浆，再加入2ml继续研磨至匀浆。
3、取刻度离心管一支，加肝匀浆至1.0ml，再加入等体积苯酚：氯仿混合液抽提，每次抽提以中等大小的力来回振荡5min，然后离心3000r/min，10min，水相吸入另一干净的小试管中，抽提重复3次『注1』。
4、往乘有上水相的小试管中加入2.5倍体积的冷无水乙醇，轻轻混匀，此时可见有白色絮状沉淀，此即DNA粗制品。
5、将试管中的上清液倒出，保留沉淀。用70％的乙醇洗涤沉淀2次，洗涤时动作要轻柔，同上法弃上清保留沉淀『注2』。
6、加入0.25mlTE缓冲液溶解沉淀。
7、取30ml沉淀溶解液放入Ep管中。
8、向Ep管中加入溴酚蓝载样液5ml，混匀后即为鉴定所用样品。
9、取琼脂糖0.3g，TBE缓冲液15ml加入锥形瓶中，加热锥形瓶使琼脂糖充分熔解后，加入10ml溴乙锭，混匀后将胶液倒入已放置样孔梳的胶板上。
10、待胶板凝好后拔去样孔梳，取15ml样品液加入样孔槽中。
11、将加好样品液的胶板放入乘有TBE缓冲液的电泳槽中，样孔槽位于阴极侧，盖好电泳槽盖后通电，调节电压100V电泳40-60min。
12、泳毕，拿出胶板，在紫外光灯下观察结果。
『注1』吸水相时不要将界面上的变性蛋白质混入，抽提3次后一般有机相和水相界面上的变性蛋白质极少，肉眼基本看不见，若变性蛋白质仍较多，可增加抽提次数。实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管管口需粗而短，并烧成钝口。
『注2』最后一次弃上清时，尽可能去尽上清。
思考题：
1、DNA的定量可采用哪些方法？
实验十一 醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质并定量
一、目的
1、了解分离纯化蛋白质，并进行蛋白质定量的原理及方法
2、了解利用醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质并定量操作方法。
二、原理
血清中各种蛋白质的等电点大都低于pH7.0，在pH8.6巴比妥缓冲液中，它们均电离成阴离子，在电场中向阴极泳动。由于各种蛋白质在同一pH环境中所带电荷多少及分子大小不同，所以在电场中的泳动速度不同。一般所来，蛋白质分子量小而带电荷多者，泳动速度快，分子量大而带电荷少者泳动速度慢，因此可以利用其泳速不同将之分开。
血清中含有清蛋白、α－球蛋白、β－球蛋白、γ－球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同（见下表）。
人血清蛋白质的分类，等电点，分子量及迁移率
血清蛋白质
等 电 点
（PI）
分 子 量
（MW）
迁移率μ
（cm2/s.v）
白蛋白（A）
4.8
68500
5.9×10-5
α1球蛋白（α1-G）
5.06
>10万
5.1×10-5
α2球蛋白（α2-G）
5.06
>10万
4.1×10-5
β球蛋白（β-G）
5.12
>10万
2.8×10-5
γ球蛋白（γ-G）
6.85-7.3
>10万
1.0×10-5
本实验用醋酸纤维素薄膜作为支持物进行电泳，分离各种血清蛋白。正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带，从阳极到阴极依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白。
醋酸纤维素素薄膜是由二乙酸纤维素加工制成，具有均一的泡沫结构，厚度仅120mm。醋酸纤维素素薄膜作为是电泳支持体有以下优点：①电泳后区带界限清晰；②通电时间较短（二十分钟至一小时）；③它对各种蛋白质（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都几乎完全不吸附，因此拖尾现象；④对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完无色。它的电渗作用虽高但很均一，不影响样品的分离效果，由于醋酸纤维素素薄膜水量较低，因此必需在密闭的容器中进行电泳，并使用较低有电流避免蒸发。
由于醋酸纤维素素薄膜作为支持物进行蛋白电泳，具有以上优点。故本实验最终采用此种方法分离血清蛋白质并加以定量。
三、材料
（一）器材
醋酸纤维素薄膜（2×8cm），培养皿，点样器，电泳仪，电泳槽，粗滤纸，镊子
（二）材料
新鲜血清（未溶血）
（三）试剂
1、巴比妥缓冲液（pH 8.6，离子强度0.06）：巴比妥1.66g, 巴比妥钠12.76g，加水至1000ml。置4℃冰箱保存，备用。
2、染色液：氨基黑10B 0.5g, 甲醇50ml, 冰醋酸10ml，蒸馏水40ml，混匀。
3、漂洗液：含95％乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml，混匀。
4、透明液：冰醋酸25ml，无水乙醇75ml，混匀。
四、方法
（一）准备电泳槽
电泳槽内放入巴比妥缓冲液。电泳槽应密闭使蒸汽饱和，避免水分蒸发。将电泳槽与电泳仪接好。
（二）点样
1、浸泡：用镊子取醋酸纤维素薄膜『注1』1张（识别光泽面和无光泽面），无光泽面朝下小心平放在盛有缓冲液的培养皿中，浸泡30min左右（浸至无白斑）。
2．点样『注2』：将浸透的薄膜从缓冲液取出（无光泽面朝上），用滤纸吸干多余的液体。点样时，先在点样器上均匀地沾上血清，在距阴极端1.5cm处将点样器轻轻地印在薄膜上，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线后迅速离开（见图）。
醋酸纤维素素薄膜规格及点样位置示意图（虚线处为点样位置）
（三）电泳：电泳槽架上分别用4层纱布连接电泳槽。将点样后的薄膜条置于纱布上，点样面朝下，点样端置于负极侧，薄膜条应平直，并与纱布紧贴。盖好电泳槽盖，静止平衡5min后通电，调节电压10-15V/cm，电流0.5mA/cm，电泳30-60min。
（四）染色与漂洗：
1、电泳完毕后将薄膜取下, 放在染色液中浸泡1-2min。
2、漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱净。取出薄膜放在滤纸上，晾干。
图4.7血清蛋白醋酸纤维素素薄膜电泳图谱示意图
（五）定量
1、洗脱比色：将各蛋白质区带仔细剪下，分置各试管中，另从空白背景剪块平均大小的膜条置于空白管中。各管加入0．4mol／lNaOH4ml,于37℃水浴20分钟(不时振荡)，待颜色脱净即用波长620nm比色，以空白管调零读m各管吸光度。
2、计算：
吸光度总和(T)=A+α1+α2+β+γ(吸光度)
血清蛋白组分的相对百分数：
A % = A/T*100%
α1 % = α1/T*100%
α2 % = α2/T*100%
β % = β%/T*100%
γ % = γ%/T*100%
注意事项
『注1』 市售醋酸纤维素素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。若飘浮于液面的薄膜在15－30s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳。
『注2』 点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不起，影响分离效果。点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。
思考题
1、为什么需将血清样品点在薄膜条的负极端？
2、如果是血浆，结果有何不同？
异常血红蛋白筛查
[复 习]
1. 血红蛋白及其组成；
2. 异常血红蛋白；
3. 影响电泳速度的因素。
[实验目的]
1. 学习血红蛋白电泳分离方法；
2. 能辨认正常人和异常血红蛋白的电泳图谱；
[实验原理]
血红蛋白是一种结合蛋白质，由血红素和珠蛋白组成。正常人所含珠蛋白的多肽链有a、b、d 、e、g和z六种。这六种肽链的基因在人体发育的不同阶段表达状况不一。正常成人红细胞中有三种血红蛋白即HbA、 HbA2 和 HbF。HbA（a2b2）是正常成人红细胞中的最主要的血红蛋白，占红细胞内血红蛋白总量的96%以上，PI=6.7。 HbA2(a2d2)是正常成人红细胞中的次要成分，占2~3% 左右，其PI>6.7。 HbF(a2g2)为胎儿血红蛋白，胎儿出生后六个月急剧持续下降至血红蛋白总量的1%以下，其PI接近 6.7。各种血红蛋白在pH8.5的缓冲液中均带负电荷在电场中都向阳极移动，但因等电点不同所带电荷数目不同而有不同的电泳速度。HbA因其所带电荷最多故向阳极泳动速度最快，又因其含量最多区带颜色最深。其后有一较浅的区带为HbA2, HbF与HbA的等电点接近，通常与HbA分不开
异常血红蛋白是指由于基因突变而导致结构异常的红蛋白。异血红蛋白具有与正常血红蛋白不同的电泳行为，因此用电泳的方法可以将其检出。例如HbS是一种由b-链第6位的谷氨酸被缬氨酸所替换而形成的异常血红蛋白，此变异体比HbA少带两个负电荷，因此，向阳极移动的速度比HbA慢,出现于HbA与HbA2之间．
分析血红蛋白的电泳方法有许多，如滤纸电泳.淀粉胶电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳等.但异常血红蛋白筛查最常用的还是醋酸纤维薄膜电泳法.因为醋酸纤维薄膜做支持体电泳操作简便,电泳速度快,分辨力强区带集中而且对染料不吸附,容易定量.用醋酸纤维素薄膜电泳筛查异常血红蛋白的检出率为1~2%o.
[器材与试剂]
1. 器材 电泳仪 电泳槽 醋酸纤维素薄膜
2. 试剂
(1) 浸泡醋酸纤维膜TBE缓冲夜(pH8.5);
(2)电泳槽硼酸缓冲液(pH8.6);
(3)丽春红染色液;
(4)漂洗液.
[步骤与方法]
1. 浸膜: 将醋酸纤维素薄膜(2´8cm)膜面向下放入浸膜液中,浸透后用眼科镊子压入液面底部
2. 采血:碘伏消毒耳垂部,用一次性采血针采血,并将血液吸在两次对折的滤纸尖部;
3. 加样: 将浸泡好的醋酸纤维素薄膜膜面向上放在滤纸上,用滤纸吸去多余的液体,在距一侧1.5cm处用沾血的滤纸.涂圆点状（直径约0.2cm）或线状;
4. 电泳: 将加好样的醋酸纤维素薄膜膜面向下放入电泳槽中的缓冲液纱布上，加样端放在负极,静置2分钟后开启电源,调电压200伏,电泳40分钟.
5. 电泳结束后,关掉电源,观察电泳图谱,并记录红色区带（几条）及分布（位置）情况.
6. 染色: 将醋酸纤维素薄膜放入染色液中2分钟,然后转入漂洗液中洗至背底呈白色,再观察结果.
（—）
（+）
[结果判断] 正常人全血血红蛋白电泳图谱
1. 未染色电泳图谱
HbA
HbA2
（—）
（+）
2. 染色后电泳图谱
含异常血红蛋白的样品：应在未染色前观察，除正常成分外，在任何位置出现的不经染色的红色区带，均可记为有异常血红蛋白存在。异常血红蛋白常以HbA为标准，分为快泳血红蛋白和慢泳血红蛋白。
[注意事项]
1. 醋酸纤维素膜一定要浸透（无白色斑点），加样前从浸膜液中取出，既要吸去多余的液体还不能使膜太干，否则都会影响电泳结果。
2. 加样时注意要加在醋酸纤维素的膜面，电泳时也要膜面向下放到电泳槽中的缓冲液纱布上。
[思考题]
1. 正常成人红细胞中的主要血红蛋白是什么？
2. 为什么HbA的电泳速度比HbA2 快？
3. a-珠蛋白肽链第30位的谷氨酸被谷氨酰胺所替换，由此构成的血红蛋白会在电泳图谱中何处出现？