必须要了解的新型的生物杀虫剂＿＿白僵菌！！！

白僵菌(Beauveria bassiana)：

半知菌亚门，菌丝有横隔有分枝的真菌。白僵菌可以侵入6个目15科200多种昆虫、螨类的虫体内大量繁殖，同时不断产生白僵素（大环脂类毒素）和草酸钙结晶，这些物质可引起昆虫中毒，使体液发现机能发生变化，打乱新陈代谢以致死亡。

农药中的白僵菌  

药剂特性 

    白僵菌是一种真菌微生物杀虫剂。菌落为白色粉状物，产品为白色或灰白色粉状物。菌体遇到较高的温度自然死亡而失效。其杀虫有效物质是白僵菌的活孢子。孢子接触害虫后，在适宜的温度条件下萌发，生长菌丝侵入虫体内，产生大量菌丝和分泌物，使害虫生病，约经4－5天后死亡。死亡的虫体白色僵硬，体表长满菌丝及白色粉状孢子。孢子可借风、昆虫等继续扩散，侵染其他害虫。 

主要剂型 

    粉剂。 

防治对象及使用方法 

    白僵菌杀虫剂用于防治多种作物上的磷翅目害虫，如菜青虫、小菜蛾、棉铃虫、玉米螟等，对松毛虫有特效。 

    （l）喷菌法。菌粉用水溶液稀释配成菌液，每毫升菌液含孢子1亿以上。用菌液在蔬菜上喷雾。 

    （2）喷粉。苗粉与2．5%敌百虫粉均匀混合，每克混合粉含活孢子1亿以上，在蔬菜上喷粉。 

    （3）将病死的僵尸虫收集研磨，配成每毫升含活孢子1亿以上（每100个虫尸加工后，兑水80-100公斤）即可在蔬菜上喷雾。 

注意事项 

    （l）家蚕养殖区不能使用。 

    （2）菌液要随配随用，存放时间不宜超过2小时，以免孢子过早萌发而失去治病的能力。与化学杀虫剂混用，也应随配随用，以免孢子受药害而失效。不能与杀菌剂混用。

    （3）白僵菌会使部分人皮肤产生过敏，如出现低烧、皮肤刺痒等，使用时应注意保护皮肤。 昆虫病原真菌及其应用
近代利用病原微生物防治害虫的趋向是细菌和病毒的研究快于真菌，直至近十多年来才发现到因真菌引起害虫种群的抑制作用而引起重视。早在公元前5世纪，我国就有利用虫生真菌的白僵蚕入药的记载。冬虫夏草、僵蚕作为药物的记载都是虫生真菌的结果。能侵染昆虫并使昆虫死亡的真菌的种类很多，目前已知约有530余种真菌，分属于藻状菌纲、子囊菌纲、担子菌纲和半知菌纲，有可能作为微生物杀虫剂的真菌主要是藻状菌和半知菌。最常用于微生物防治的虫生真菌有白僵菌、绿僵菌、拟青菌、多毛菌、虫霉等。其中绿僵菌和白僵菌最多。

第一节  昆虫病原真菌的利用（白僵菌）
本节内容包括白僵菌（半知菌）的生活史与侵染循环、培养与培养物、大规模生产和制剂种类及其稳定性与应用。通常所说的白僵菌，指的是白僵菌属的真菌。生活史中有分生孢子。
一、白僵菌概述
白僵菌属半知菌纲丛梗孢目，丛梗孢科，白僵菌属。被白僵菌侵染的昆虫可从外形加以识别，多数情况下，虫体上长出白色菌丝体并变硬，在表面长出孢子层，普遍称为白僵病或硬化病
1.形态：白僵菌菌丝体具隔膜、分枝，表面色泽白色至不同程度的乳色，或略带橙黄或红色，偶有绿色。分生孢子梗单生或分枝，最后形成产孢细胞，产孢细胞多为球形，有时呈瓶状的圆柱形，弯曲或正直，孢子生于产孢细胞的呈线形的顶端，产孢细胞生于小枝梗上。白僵菌在虫体上蔓延为白色菌丝，至后期呈淡黄色，有的很快形成粉层状孢子，有的继续保持絮状。
2.种类：分生孢子和分生孢子梗的形态是区别种的主要特征，特别是孢子的大小和形状。经研究，白僵菌属可作为独立种的只有2个种，即白僵菌和卵孢白僵菌。这两个种的区别是：白僵菌的分生孢子约有50%为球形，而卵孢白僵菌的分生孢子约有98%为卵形。之前曾有19个种被描述，后经研究将其归并。白僵菌的寄主范围很广，有200多种昆虫和螨类，包括鳞翅目、鞘翅目、 半翅目、同翅目、双翅目、膜翅目、直翅目等，白僵菌常常侵染的是幼虫。
二、白僵菌的感染途径及杀虫机理
1.感染途径及侵染过程：白僵菌在虫体上及在培养基上均以无性繁殖完成世代交替。绝大多数真菌是通过体壁侵染寄主的，但有证据表明，白僵菌也可通过口被寄主摄入后，经肠壁感染寄主，经此途径感染的均为咀嚼式口器昆虫，如家蚕、蚱蜢等。也有人认为白僵菌从气门等处进入虫体。对于同翅目、半翅目等刺吸式口器的昆虫，真菌感染的唯一途径是体壁。
侵染始于分生孢子在寄主体壁上的附着。在湿度较高的环境条件下，孢子萌发长出芽管，穿透体壁，进入寄主的血腔。在穿透体壁过程中，伴随着一系列酶的活动，使侵入点体壁结构被降解，如蛋白质、几丁质和脂类物质被分解。分生孢子产生芽管，芽管一旦穿透体壁（或肠壁）进入血腔，白僵菌就利用寄主营养而繁殖。首先芽管伸长为菌丝，而后在血腔中以芽殖的方式产生大量芽生孢子。在高湿条件下菌丝自虫体表面长出，产生分生孢子，并借此开始下一轮侵染。
图示侵染过程：分生孢子—芽管—菌丝，菌丝在体内产生芽生孢子，在寄主体表形成分生孢子。白僵菌的分生孢子在25℃、相对湿度90%以上、pH4.4的条件下萌发率最高。菌丝在13-36℃间，均能生长。生育适温为21-30℃，相对湿度为98%以上、pH4-5.在30 ℃、相对湿度为70%，pH6的情况下，最适于分生孢子的产生。白僵菌在培养基上可保持1-2年，在干燥条件下可存活5年，在虫体上可维持6个月。白僵菌制剂中分生孢子起主要作用。
2.传播途径：白僵菌分生孢子通过气流或其它机械传播（雨水及虫体的接触）。白僵菌在虫体上和在培养基上均以无性阶段完成世代交替。作为昆虫病原菌，它们以分生孢子完成侵染循环的。
3.致死原因及症状
昆虫被白僵菌致死的原因是，或因其血液养分被病菌耗尽，或因病菌有毒代谢产物引起的毒血症。在高湿条件下，菌丝自虫体表面长出，产生分生孢子，并借此开始新的侵染。白僵菌的侵染，除了上述对昆虫的直接致死作用，还对寄主具有亚致死作用或影响其卵巢的发育，从而降低死亡前的产卵量。
被卵孢白僵菌感染的症状：白僵菌侵入虫体后，昆虫在发病初期运动呆滞，食欲减退，静止时全身侧倾，或者头兄俯付，呈萎靡无力的状态，身体失去原有的色泽。有的发病昆虫体上出现黑褐色病斑，大小形状不一。个别发病昆虫在胸腹足表皮上下出现黑色状环病斑。随着病情的发展，病虫的体躯侧转，吐出黄水或排出软粪，不久死亡。死后虫体内部组织一般都分解和液化。刚死的虫体，体躯都很松弛，过几个小时后开始变硬，常变成粉红色。这粉红色是卵孢菌的色素。硬化后的虫尸在1-2天后，在口器、气门和各个节间多长出绵状菌丝体，3-4天后白色菌丝长满虫体，菌丝上又长出孢子。
三、白僵菌引起的流行病
白僵菌的寄主范围虽然较广，但其在自然条件下导致的流行病并不多，下面是有记载的例子。1954年，白僵病在湖南数万亩松林中流行，造成松毛虫死亡达85-95%。1958年，福建龙溪县程溪乡境内的几乎所有松毛虫死于白僵病流行。1973-1976年间安徽泾县2600多公顷松林中，松毛虫由于白僵病的流行，虫口密度很低，死亡率达90%。湖北、广东、广西等地区，松毛虫白僵病的流行常有报导。华南林区白僵病的流行，一般发生于松毛虫的越冬代，正值三、四月的温暖多小雨季节。不同程度的白僵病还见于稻叶蝉、榆黄叶甲、桃小食心虫、蛴螬等。
四、白僵菌的培养和培养物
白僵菌是容易人工分离培养的，固、液体培养基均能使其生长发育良好，如常见的萨氏培养基和马铃薯葡萄糖琼脂。在固体培养即上，白僵均产生气生分生孢子，它们在形态学和侵染力方面与僵虫体表产生的分生孢子几无差异。在液体培养条件下，白僵均通过菌丝隔膜间的裂殖或菌细胞酵母式的芽殖母式的芽殖产生芽生孢子。白僵均芽生孢子以其寄主血腔内的形成物相似。液体培养产生芽生孢子的研究，报导很多。根据形成方式，白僵均芽生孢子在功能上相当于短的菌细胞，因而称为菌丝段更恰当。但是，芽生孢子被广泛应用。
白僵均芽生孢子壁薄，在发酵后的干燥过程中和用于田间后易失去活性。从害虫微生物防治的实用目的，研究者试图以液体发酵直接生产分生孢子。因为以双相发酵法即液体发酵产生营养菌丝后转到含养分或惰性固体基质上使菌丝产生分生孢子既易受杂菌污染，又麻烦，不适合于现代的发酵工艺。研究以液体发酵方式大量生产在环境稳定性和毒力方面与气生分生孢子相似的液生分生孢子，是研究的目标。但目前还存在技术上的困难。
在液体培养中，分生孢子的形成可概括为五个发育阶段：分生孢子的膨大与萌发；第一、二级菌丝和分生孢子梗的形成；菌丝分枝和分生孢子开始产生；分生孢子的大量形成；分生孢子自梗脱落并分散于培养液中。
并非所有球孢白僵菌株均有在深层液体培养条件下产生分生孢子的能力。一般而言，前述在固体培养基平板上表现营养生长不足但产孢丰富的第一类菌株，更可能在液体培养中产生分生孢子。此外培养基的组成也是很重要的。
气生与深层发酵的分生孢子之间是否在侵染力与环境稳定性方面存在差异，是人们关心的一大问题。Boucias等1988认为，丝状真菌孢子的疏水性，对于它们在寄主体壁上的附着是至关重要的。关于两类分生孢子的环境稳定性和毒力的比较，仍有待于深入。环境因子的组合，不仅要考虑温湿度的影响，还要考虑紫外线辐射、植被与土壤特征等的影响。
五、白僵菌应用中注意的问题
白僵菌用于防治农、林、果等害虫近30种，如马铃薯叶甲、苹果食心虫、玉米螟、松毛虫和水稻黑尾叶蝉、蛴螬等。随着对病原、寄主、环境的深入研究，对白僵菌的研究和大规模的应用将更加深入，但应同时注意以下问题：防治适期的确定和一年施用，多年有效。土壤湿度对白僵菌的作用影响大，多种病原真菌要求95-100%的相对湿度。 相对湿度对分生孢子的萌发和生殖菌丝的发育都很重要。病原真菌防治害虫的失败常由于湿度的不足。在高湿的地区和季节，使用真菌制剂往往可获得高效。
因地制宜：在具体操作中，由于各地栽培条件的不同，农民的习惯也有差异，因此应根据具体情况，确定施用方法。以前用白僵菌防治蛴螬，有水泼的、有在播种前撒毒土的，尽管在播种前施用效果不好，但在地膜覆盖栽培制度下，只能采用菌与种子一起下的措施。
施用时应选择湿度大、地面覆盖物丰富的地方，以利于喷撒后能迅速自然扩散。
在阴天、雨后、小雨天湿度较大时为宜，以利于孢子的萌发与侵入。
六、影响真菌制剂效果的环境因子
真菌制剂效果的发挥受多种因素的影响，如菌剂本身的致病力，寄主昆虫的易感性，特别是受环境条件的制约性很大。如能掌握环境影响的特点，将有助于防治效果的提高。
（一）温度：温度能影响孢子的萌发、菌丝的侵入、病情的发展。
（二）风：风能降低湿度不利于病原菌的发育。但风对真菌孢子的传播有利。
（三）光：日光能提高气温、降低湿度，紫外线能杀死真菌孢子。白僵菌如经3 小时的直接日晒，则孢子的侵染力即被破坏。
（四）土壤及其酸碱度：富于腐殖质的土壤，有利于病原真菌的侵染。
第二节  绿僵菌研究的新进展
摘要：本文从绿僵菌的系统学进展、分离方法、生态学和流行学、遗传与菌株的选育、应用与剂型、展望等六个方面阐述了近年来绿僵菌研究的新进展。
自从1879年Mehhiikob首先大量繁殖绿僵菌防治奥地利丽金龟以来，绿僵菌就成为害虫微生物防治的主角之一。由于本世纪初人们对绿僵菌防治效果不稳定感到失望，对绿僵菌的研究仅限于分类、培养特性、感染机制及影响因素的研究。进20年来，随着巴西和澳大利亚使用金龟子绿僵菌防治甘蔗和牧草害虫取得较大进展，以及非洲用黄绿绿僵菌防治蝗虫的试验初步成功，对绿僵菌的研究进入了一个高潮。
一、绿僵菌的系统学进展
分类现状  自1883年Sorokin建立绿僵菌属Metarhizium以来，先后发表了10余个种，分类状况混乱。目前国际上被广泛接受的分类观点是Tulloch建立的，他将绿僵菌定位为2个种，包括金龟子绿僵菌和黄绿绿僵菌，金龟子绿僵菌包括小孢变种和大孢变种。樊美珍等（1994）依据瓶梗和分生孢子的形态及排列方式，总结国内发现的新种，将绿僵菌属定为7个种或变种。白色绿僵菌、金龟子绿僵菌小孢变种、金龟子绿僵菌大孢变种、双型孢绿僵菌、黄绿绿僵菌黄绿变种、黄绿绿僵菌小孢变种、戴氏绿僵菌。
二、系统学研究方法进展
2.1酶学方法  同功酶是由基因决定的，通过同功酶谱了解菌株特性，对种内分群有一定效果。Rakotonirainy等（1994）在分析绿僵菌28rRNA部分序列的同时测定了7种酶的同功酶谱，分析酶谱得到了菌株间的系统关系与rRNA序列分析得到的相同。
2.2 分子生物学方法  核糖体普遍存在于所有生物中，核糖体RNA分子在结构上具有高度的保守性，所以非常适用于揭示生物进化发育关系。刘兆伟等（1994）应用特异寡聚核苷酸引物和双氧核苷酸终止法，测定了绿僵菌不同种的18S和25SrRNA上的不同区域的系统发育。Rakotonirany等分析了41株金龟子绿僵菌和1株黄绿绿僵菌系统树为A来自新西兰的菌株，B黄绿绿僵菌，C金龟子绿僵菌，在金龟子绿僵菌中又分为大孢和小孢两变种。
近年来开始用随机引物扩增多态性(RAPD)和限制性片断长度多态性（RFLP）方法研究绿僵菌的分类鉴定、系统发育、种内分型和地理型分布。Bidochka等1994用RAPD研究了24株侵染蝗虫的绿僵菌和白僵菌的种间差异，M.ansopliae不同菌株之间PCR扩增片段的差异水平与M.anisopliae  M.flavoviride 和B.bussiana之间差异水平相当，认为此种现象暗示着M.ansopliae可能包括一些亚种；在PCR扩增片段中酶隐性梅毒证据表明菌株寄主专一性的差异，同时证实了stleger 将ARSEF324定位M.flavoviride是正确的。
三、绿僵菌的分离方法
常规分离方法多是从体表有明显真菌感染症状的僵虫上分离。1986年Zimmermann将研究线虫在土壤中发生率的大蜡螟诱饵法引入昆虫病原真菌的生态学研究，检验昆虫病原真菌在土壤中的出现频率。高松等1995用此种方法检验了我国南北方三省区的47份土样，昆虫病原真菌的总检出率为78.7%，诱得白僵菌80株，绿僵菌47株，初步证明了我国不同地区的土壤中广泛存在的病原真菌。利用选择性培养基可直接从土壤中分离白僵菌，此法原用于研究绿僵菌在土壤中的动态。Doberski 1980和Rash1992分别改进了含放线菌酮的选择性培养基，可快速分离土壤中的白僵菌、绿僵菌。---从土壤中分离的菌株
僵虫分离法是目前研究中最常用的方法，但寻找僵虫的工作量大，且受季节限制，特别是从土栖昆虫中寻找僵虫显得尤为困难，人们一直对从土壤中分离的菌株的致病力有怀疑，认为寄主来源的菌株具有高毒力，但此种观点尚缺乏立足的证据，实际上用于防治的菌株并不都是来自于目标昆虫。从流行病学的角度来说，存在于土壤中的真菌孢子是引起昆虫真菌病害的初始感染源，白僵菌、绿僵菌和拟青霉是土壤中比较常见的真菌类群，且也从土壤中分离到高效的生防菌株。这表明土壤中同样存在高毒力的菌株，因此土壤之间分离法和诱饵法是收集虫生真菌资源的重要手段之一，不应该忽视其作用。活虫体分离法很有新意，值得进一步研究。
四、绿僵菌的生态学与流行病学
研究绿僵菌的生态学与流行病学在害虫生防中有重要的理论意义，同时在引入绿僵菌作为生防作用物控制害虫时需要进行评价，确立害虫的减退是引入绿僵菌的作用。这些研究的关键之一是将其从自然界中分离出来并鉴定之。最常用的方法是采用选择性培养基。目前国外一般采取PCR法，本方法的关键是特异性引物的选择。通过比较菌株的特异性片断进行鉴别，这种方法比较准确，但工作量大，对设备要求条件高，在国内一时难以实现。上述鉴定方法都需要经过分离这一繁琐的过程，随着现代科学技术的进展，荧光抗体标记已用于土壤微生物的生态学研究，用荧光显微镜能直接观察微生物在土壤中的分布情况，是一种快速简便的研究手段。
在作物病虫害防治的实践中，绿僵菌往往与化学杀虫剂混合施用，以期取得更好的防效。同时，绿僵菌不可避免地会遇到为防治病害而施用的杀菌剂。所以筛选抗药性好的菌株或选择生物相容性好的化学农药在综合防治中十分重要。Li和Holdom1994在室内测定了5种杀虫剂、7种除草剂和2种杀菌剂对绿僵菌生长及产孢的影响。绿僵菌对杀虫剂和除草剂的耐受力比对杀菌剂的强，根据处理用的杀菌剂对绿僵菌有很大的抑制作用，这表明选育抗杀菌剂的菌株是十分重要的。Baath1991和刘易斯（1994）分别研究了硫酸铜和可杀得（含50%氢氧化铜），Kocide对绿僵菌生长及产孢影响，发现在一定浓度内，不但不抑制绿僵菌的生长，反而对产孢有一定的促进作用并缩短产孢的时间，目前绿僵菌的开放式固体培养存在时间长、易污染的问题，这个结果对绿僵菌孢子的生长有一定的意义。
五、绿僵菌的遗传和菌株变异
绿僵菌是防治地下害虫最有潜力的病原物，但湿度是病害发生与否的关键。一般绿僵菌的最适生长温度为25-28度，温带地区的土壤温度除夏季的很短一段时间外大都低于25度，所以筛选在低温条件下能生长侵染的菌株是提高防效的重要途径。Yip(1990)和Rath1992从塔斯马尼亚土壤中分离到1株可在2-25℃萌发的菌株，接种体浓度为4.1X106孢子/克土，该菌株已经商品化生产，商品名为Biogreen颗粒剂。
用绿僵菌防治农作物害虫时会与防治真菌病害的杀菌剂接触并被大量杀死，降低防治效果。抗药性基因导入是微生物抗性育种的常用方法。Goettel等1990用BENA3质粒将构巢曲霉的抗苯菌灵基因bena3导入M.ansopliae的原生质体，转化率为9个转化子/50HgDNA/2x106 原生质体，转化菌株对苯菌灵的抗性比出发菌株高10倍。虽然抗性程度还不够高 ，但这是基因转化技术用于虫生真菌抗性育种的第一个成功的范例，为今后的遗传工程育种工作提供了宝贵的经验。
六、绿僵菌的应用与剂型
绿僵菌用于防治农林害虫已有近百年的历史，但制剂的商品化进展十分缓慢。常用的方法是喷施孢子粉的水悬浮液防治地上害虫，或将孢子粉连同培养基一起撒在地面上然后翻入土中，防治农作物地下害虫。真正商品化的制剂只有德国拜耳公司80年代开发的M.anisopliae菌丝体颗粒剂bio1020，用于防治葡萄黑耳喙象，它的生产技术很独特，在发酵罐中使用特殊工艺使菌丝体形成直径1-1.5mm菌丝球，离心分离后造粒，用沸腾床干燥为含水量10%(w/W)的颗粒，然后真空储藏，4℃条件下可保持活力18个月，20℃时5个月。
80年代末，IIBC用昆虫病原真菌防治沙漠蝗虫，从上千个菌株中筛选出黄绿绿僵菌IMI330189,它的孢子粉剂在35%RH条件下，5天时对沙漠蝗虫（Schistocerca gregaria）的LD50为8900孢子/头，HIBC为防治蝗虫的真菌孢子产品制定了质量标准：
1．    水分含量50-70%；
2．    孢子萌发率大于90%；
3．    活微生物数量的99.9%应是M.flavoviride；
4．    除绿僵菌孢子以外，其它成份的重量不应超过5%，若论体积，则应更小；
5．    微粒的直径不应超过44微米。
这个标准已被许多国外科研机构和生产生物农药的公司所接受，成为真菌杀虫剂孢子产品的标准。
Hegedus等1992在比较球孢白僵菌气生、液生分生孢子和芽孢子的毒力时，发现芽孢子的致死速度最快。这是一个启示，生防中使用的侵染体不一定局限于分生孢子，在添加适量的保护剂以后，芽孢子或菌丝体有可能成为更好的生防作用物，而且生产起来更方便。
七、绿僵菌的展望
绿僵菌的研究已有百年历史，特别是最近十几年在分子系统学研究、基因遗传育种、剂型的改进和扩大防治对象上都取得较大的进展，但与Bt等微生物的研究相比还有较大的差距。
从自然界中筛选高毒力菌株的随机性很大，可遇而不可求。分子生物学技术的发展为菌株改良提供了手段。绿僵菌的毒力与其分泌的昆虫表皮降解酶有直接关系。St.leger1987系统地研究了绿僵菌的酶系，认为弹性凝乳蛋白酶Prl的活性决定绿僵菌的侵染力，而且编码Prl的基因已被克隆，为遗传工程育种创造了条件。
历史上曾经因为防效不稳定而使绿僵菌的应用陷入停顿。外界环境对绿僵菌防效的影响很大。对地上害虫的防治，影响最大的是湿度和紫外线。这主要依赖剂型的改进，添加能使孢子在低湿状态下萌发的助剂和紫外线保护剂。对于地下害虫，土壤中的微生物和土壤的理化性质影响孢子的存活和萌发。Zimmermann1984发现植物根际分泌物有时会使防效降低一半，这个现象值得注意。今后应着重加强绿僵菌生态学方面的研究，这是应用绿僵菌防治害虫的基础。
绿僵菌孢子粉的规模化生产尚待突破。国外多年来用巴西发明的塑料袋培育法或类似方法，很难形成规模。液固两相法生产球孢白僵菌的成功，使我国成为世界上唯一能批量生产真菌高孢粉的国家。从理论上讲，此法也适用于绿僵菌，只是固体培养阶段存在的污染问题，产品质量无法达到IIBC提出的标准。作为商品其货架寿命(shelf life)应该达到18个月。孢子含水量是影响存活的关键因素，目前尚无经济、简便的方法施入孢子含水量达到5%而萌发率不低于90%，解决这一难题需要我们与有关工业和科研部门的合作。