关于时空记忆的电影:槲皮素异戊烯基化修饰物清除自由基活性研究

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槲皮素异戊烯基化修饰物清除自由基活性研究

吴丽燕

专 业:食品科学与工程   学 号:2007464111  指导老师:李梅

 

摘要:对槲皮素进行结构修饰,开发具有更强生物活性的新药是目前医药研究的重要内容。本试验分别通过Fenton反应、邻苯三酚自动氧化法和紫外可见分光光度法,对不同浓度槲皮素及其异戊烯基化修饰物清除羟自由基(?OH)、超氧阴离子自由基(O2?-)和二本代苦味酰自由基(DPPH)能力进行比较研究。结果显示,对槲皮素进行异戊烯基化修饰后,所得修饰物对三种自由基清除能力较槲皮素显著增强,平均清除率为分别为56.16%44.82%87.69%;两种物质对三种自由基体系的清除能力大小依次为DPPH>?OH > O2?-,而且呈现明显的剂量依赖性。

 

关键词:异戊烯基修饰;槲皮素;自由基;清除

AbstractStructural modification of quercetin, the development of new drugs with greater biological activity is an important part of medical research. In this study, respectively, through the Fenton reaction of pyrogallol auto-oxidation and UV-visible spectrophotometer for different concentrations of quercetin and its prenyl modification scavenging hydroxyl radical (? OH), superoxide anion radical (O2 ? -) and two on behalf of the bitter acid radical (DPPH) capacity were compared. The results showed that quercetin for prenyl modification, the modification from the three free radical scavenging properties of quercetin significantly increased compared with the average clearance rate was 56.16%, 44.82% and 87.69%; two Substances on the free radical scavenging ability of the three order of DPPH> ? OH> O2 ? -, and showed a dose dependent manner.

Key words: prenyl modification; quercetin; free radicals; clear

 

槲皮素及其衍生物是植物界分布最广的黄酮类化合物,广泛存在于植物的花、叶、果实中, 也是人类饮食中最主要的生物类黄酮。研究表明,槲皮素具有抗氧化、抗炎、降血压、抗心律失常、抗血小板凝聚、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等多种生物活性,这些生物活性与其较强的清除自由基能力密切相关[1-2]。槲皮素可直接清除活性氧自由基,抑制脂质过氧化损伤,可显著提高超氧物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷耽一甘肤过氧化物酶(GSH-Px)的活性和降低丙二醛(MDA)含量,对经过运动训练的大鼠肝组织产生的自由基具有清除效果,并有保护肝组织的作用,可减少运动后因脂质过氧化产生的内源性自由基对机体的损伤,保护细胞膜的完整性,从而增强抗氧化活性[3]槲皮素还能抑制H2O2引起的人红细胞溶血和红细胞脂质过氧化作用[4]。槲皮素抗氧化清除自由基的机制可能与以下几方面有关:①与超氧阴离子络合而减少氧自由基的产生;②与脂质过氧化氢反应抑制脂质过氧化过程;③与铁离子络合而阻止轻自由基的形成;④抑制醛糖还原酶,减少还原辅酶 11(NADPH)消耗,从而提高机体抗氧化能力[5]

槲皮素之所以具有较强的清除自由基能力,原因之一是其结构中富含酚轻基,这些酚经基可提供活泼氢使自由基灭活。由于槲皮素为平面型分子,分子堆砌较紧密,分子间引力较大,不易被溶剂或溶质分散,水溶性差,难于吸收、生物利用度低,进而影响其吸收和药效的发挥。因此,国内外学者对槲皮素的结构进行化学修饰,在槲皮素分子中导入亲水性集团,以期增加其溶解度和改善吸收,从而增强其药理活性作用[6]。目前对于槲皮素的结构修饰的研究多集中槲皮素的金属配合物的合成和生物活性研究,合成的槲皮素与金属元素(锌、铬、钼、钴)的配合物,其抗氧化明显增强[7]

研究表明,许多化合物的异戊烯基化修饰会带来一些新的生物活性,尤其表现在抗癌、抗病菌、抗发炎、抗氧化、抗HIV等方面[8-10]。异戊烯基化的黄酮类化合物作为黄酮类化合物中最独特的一类,具有多种生物活性,目前已发现的大约近700个,据Nikaido.T.等报道,黄酮类化合物中异戊烯基的存在极大的增长了它们的亲脂性,这使得化合物分子能够强烈的亲和生物膜,进而可引起相关生物活性(尤其是抗氧化性)的显著提高[10]。由此可以推测,在槲皮素分子上引入合适的异戊烯基,对其结构进行异戊烯基修饰,会对槲皮素分子生物活性产生一定的影响。

本研究通过对不同浓度的槲皮素和槲皮素戊烯基化修饰物清除羟基自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基能力的比较,研究其可能存在的协同作用,为寻找新型、高效、低毒的槲皮素修饰物提供初步的实验依据。

1.材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1实验材料与试剂

槲皮素纯度为95%,国药集团化学试剂有限公司;90%异戊烯基溴,国药集团化学试剂有限公司;丙酮(分析纯),成都市科龙化工试剂厂;100%乙醇;DPPHSIGMA公司;30%H2O2、硫酸亚铁、水杨酸、邻苯三酚HCl等均为分析纯。

1.1.2试验主要仪器

722可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司);百分之一和天分之一的电子天平(北京赛多丽斯仪器有限公司);HH恒温水浴锅(江苏金坛市中大仪器厂);RE-52旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器有限公司)10-100ul100-1000ul移液枪。

1.1.3不同浓度的槲皮素及槲皮素异戊烯基化修饰物清除自由基的能力

研究不同浓度的槲皮素及槲皮素异戊烯基化修饰物对不同体系自由基的清除能力。槲皮素设七个浓度,分别是:0.51.01.52.02.53.03.5mg/ml,用A1-A7表示;槲皮素异戊烯基化修饰物的七个浓度分别用B1-B7表示。

1.1.3.1羟自由基体系

比色法测定Fenton反应生成的?OH的,利用H2O2Fe2 + 混合产生?OH,若在反应体系中加入水杨酸,就能有效地捕捉?OH,并产生有色产物。该产物在510 nm 处有强吸收。若在此反应体系中加入具有清除?OH 功能的被测物,与水杨酸竞争?OH,从而使有色产物生成量减少。取30支试管编号为A11-A17A21-A27,A3B11-B17,B21-B27,B3,。每支试管中加入样液AB产品 0.1ml,、9mmol/L  Fe2 +  l mL9 mmol/L水杨酸乙醇溶液1mL,最后加入9.1mmol/L  H2O2 0.1 mL(启动Fenton反应)摇匀,在510 nm 测量各浓度下的吸光度为A11-A17B1-B7.。取0.1ml蒸馏水取代9mmol/L 1 Fe2 + 溶液测定吸光度为A21-A27B21-B27。取0.1蒸馏水分别代替样液AB 测吸光度为A3B3

1.1.3.2超氧阴离子自由基体系

采用邻苯三酚自氧化法测定, 利用O2?-清除剂能使邻苯三酚自氧化产物在325 nm 处的吸收峰受到抑制这一特点, 用紫外分光光度计进行监测, 间接测得O2?-生成及O2?-的清除率。取30支试管编号为A11-A17A21-A27,A3B11-B17,B21-B27,B3,。每支试管中加入0. 05mmol/ L PH 8. 2 的磷酸盐酸 缓冲液3. 5 mL 于试管中, 25 预热20 min,加入0. 1 mmol/ L 邻苯三酚(用0.01mol/LHCl配成)0. 1 mL, 样液产品0. 1 mL, 蒸馏水1 mL, 25 水浴准确反应4 min时测定A325B325, 记为A11-A17B11-B17样品。另取试剂同上,用0.1ml蒸馏水代替邻苯三酚,测定吸光度记为A21-27B21-B27。再取0.1ml蒸馏水代替样液AB测吸光度为A3B3

1.1.3.3二本代苦味酰自由基(DPPH)体系

比色法测定产品对DPPH的清除作用:取30支试管编号为A11-A17A21-A27,A3B11-B17,B21-B27,B3,。每支试管中加入样液产品0.1ml5mlDPPH –用95%乙醇配成0.0001mol/L,25度恒温30min,在波长517nm下测定吸光值。其中A11-A175mlDPPH溶液+0.1ml样液A A21-A25ml乙醇溶液+0.1ml样液AA35mlDPPH溶液+0.1ml蒸馏水。B11-B175mlDPPH溶液+0.1ml样液BB21-B275ml乙醇溶液+0.1ml样液B 0.1ml蒸馏水代替样液测吸光度为A3B3

1.2试验方法

1.2.1槲皮素戊烯基化修饰物的制备

1.2.1.1合成

0.255g槲皮素→加入50ml丙酮中溶解,+无水碳酸钾(丙酮溶液的1/4),+相关比例105ul的异戊烯基溴→加热回流,(温度60)水浴回流8h

合成路线如下图:

 1.2.1.2纯化

过滤去碳酸钾后用丙酮润洗,旋转蒸发,蒸干。用乙醚(乙酸乙酯,氯仿)萃取3-水浴锅挥干(搅拌)-少量甲醇溶解-加入水(10ml-乙醚(乙酸乙酯,氯仿)萃取3-挥干-高效液相色谱(HPLC)分析纯度。

1.2.2自由基清除率P(%)的计算

以上各体系测定所得的吸光度为A1A2A2代入以下公式,计算不同浓度的槲皮素及槲皮素异戊烯基化修饰物对不同体系自由基的清除能力。

1.2.3数据的处理和统计分析

试验数据利用Excel进行整理,利用DPS统计软件进行统计分析。

2试验结果与分析

2.1槲皮素及槲皮素异戊烯基化修饰物对自由基的清除能力比较

2.1.1不同浓度槲皮素及槲皮素异戊烯基化修饰物对羟自由基的清除能力

羟基自由基是最活泼的自由基,也是毒性最大的自由基,它可与活细胞中的任何分子发生反应而造成损害,且反应速度快,能杀死红细胞,降解DNA、细胞膜和多糖化合物,许多由它所致有害效应在加入羟自由基的清除剂后会明显降低。所以羟自由基清除率是评价物质对自由基的清除效果的最常用的指标。

图1 不同浓度的槲皮素及其异戊烯基化修饰物对羟自由基的清除率

试验结果表明(见图1):槲皮素及槲皮素异戊烯基化修饰物均有较强的清除羟自由基的能力,当浓度从0.05mg/mL增加到0.3mg/mL,羟自由基清除率随样液浓度增加而增加,差异达到显著或极显著水平,浓度再增加至0.35mg/mL,羟自由基清除率继续增加,但差异不显著。相比,槲皮素异戊烯基化修饰物清除能力较槲皮素有明显的提高,且随浓度的增加,羟自由基清除率的增幅比槲皮素更大,当样液浓度达到0.35mg/mL时槲皮素异戊烯基化修饰物对羟自由基的清除率达到75.11%远高于槲皮素的57.13%

2.1.2不同浓度槲皮素异戊烯基化修饰物对超氧阴离子自由基的清除能力

生物体内氧化还原反应中,大致有2%-5%的氧会产生超氧阴离子自由基,超氧阴离子自由基的毒性是机体发生氧中毒的主要原因,表现在使核酸链断裂、多糖解聚和不饱和脂肪酸过氧化作用,进而造成遗传突变、膜损伤、酶系失活、线粒体氧化磷酸化作用改变等一系列变化。

图2 不同浓度的槲皮素及其异戊烯基化修饰物对超氧阴离子的清除率

对槲皮素及其异戊烯基化修饰物的超氧阴离子清除能力的试验结果见图2。试验结果表明:槲皮素及槲皮素异戊烯基化修饰物均有一定的清除?OH自由基的能力,随浓度的增加,槲皮素及其异戊烯基化修饰物清除?OH自由基的能力逐渐增强,差异达到显著或极显著水平,与槲皮素相比,低浓度时,槲皮素异戊烯基化修饰物清除?OH自由基的能力稍强,但差异不显著,但随浓度的增加,修饰物清除?OH自由基的能力增加更快,当浓度达到0.35mg/ml时,槲皮素异戊烯基化修饰物清除超氧阴离子自由基效率达到69.11%,显著高于槲皮素的清除率为48.98%。提示更高浓度的槲皮素异戊烯基化修饰物可能具有更强的清除超氧阴离子,具体情形如何需进一步的试验验证。

2.1.3不同浓度槲皮素及槲皮素异戊烯基化修饰物对二本代苦味酰自由基(DPPH)的清除能力

DPPH 在有机溶剂中是一种稳定的自由基,在517nm 处对光有较强的吸收,当有自由基消除剂存在时,其孤电子被配对,吸收消失或减弱。因此,可通过检测自由基的清除情况,从而评价某物质的氧化能力。自由基清除率越大,物质的抗氧化能力越强。

图3 不同浓度的槲皮素及其异戊烯基化修饰物对DPPH自由基清除率

试验结果表明(图3):槲皮素及槲皮素异戊烯基化修饰物均有较强的清除DPPH自由基的能力,样液浓度为0.05mg/ml时,槲皮素的清除率已经达到68.8%,且随样液浓度的增加而增加,相比,槲皮素异戊烯基化修饰物的清除DPPH自由基的能力更强,样液浓度为0.05mg/ml时,修饰物的DPPH清除率就高达75.4%。当样液浓度达0. 35 mg/ml,清除率已高达93.77%,明显高于槲皮素的清除率72.61%。但随样液浓度的增加,两种物质对DPPH的清除率增幅都不明显,尤其是在浓度大于0.20mg/ml,两种物质清除DPPH的能力随浓度的增加幅度都不大,差异性不显著。

2.1.4槲皮素及其异戊烯基化修饰物自由基清除率的比较

槲皮素及其异戊烯基化修饰物对不同体系自由基清除率见表1:槲皮素分子结构符合有效酚羟基理论,具有极强的自由基清除能力,研究结果表明,槲皮素对羟基自由基、超氧阴离子和DPPH的清除率分别是41.80%31.56%72.99%,对其结构进行异戊烯基化修饰后得到的修饰物的清除自由基能力进一步增强,均与对照差异达到极显著水平,尤其是对DPPH的清除率高达87.69%

表1 槲皮素及槲皮素异戊烯基化修饰物对不同体系自由基清除率

 

羟基自由基

超氧阴离子

DPPH

异戊烯基化修饰物

56.16 16.69aA

44.82 18.30aA

87.69 6.64aA

槲皮素

41.80 13.11bB

31.56 10.87bB

72.99 2.67bB

3 讨论

3.1槲皮素具有较强的体外抗氧化活性,对其结构进行异戊烯基化修饰,所得的异戊烯基化修饰物的体外抗氧化活性会显著增强,表现为对羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基的清除率较槲皮素极显著增加。

3.2 槲皮素及其槲皮素异戊烯基化修饰物对三种自由基体系的清除率存在差异,清除能力大小依次是DPPH自由基>羟基自由基>超氧阴离子自由基。槲皮素及其修饰物对超氧阴离子自由基清除能力最低,但试验最高浓度,清除率仍在持续增加,差异达到显著水平,由此提示,更高的浓度的槲皮素及其异戊烯基化修饰物可能会对超氧阴离子自由基的清除能力更强。

3.3 供试浓度范围内,随浓度的增加,槲皮素及其异戊烯基化修饰物清除羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的能力都不断增加,但槲皮素异戊烯基化修饰物的增幅较槲皮素更大,表现为提高浓度,清除自由基的能力增加更快。

4 结论

槲皮素具有广泛的生物活性,对其进行结构修饰,合成出具有更优越生物活性的化合物,对于充分开发和利用这一类丰富的天然药物资源,为人类的健康和医药事业的发展具有重要的意义。本试验仅对槲皮素及其异戊烯基化修饰物的体外抗氧化作用进行试验研究,而槲皮素具有广泛的生化活性,对其进行异戊烯基化修饰后,其抗炎、降血压、抗心律失常、抗血小板凝聚、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等多种生物活性是否也会如抗氧化性一样得以提高,需试验进一步的研究。

参考文献:

[1]H ertogMCL, H ollm an PCHPotent ial health effects of the d ietary fla.vono l qu ercetin [ J] E ur J C l inNu tr, 1996, 50: 63 - 66

[2]苏俊锋, 郭长江,食物黄酮槲皮素的抗氧化作用[ J]解放军医学学, 2001, 19( 3 ) : 229- 231

[3]刘慧明,丁航,侯敢.棚皮素对过氧化氢诱导的人红细胞过氧化损伤的抑制作用[J].广东医学院学报,2003,21(4):31-318

[4]KuklmannMK.InhibitionfoxidantindueedLiPidPeroxidationinrenaItubuIarePitheIiaIcells(LIC-PKI)byquercetion[J].FreeRadicReseareh199829(5):451~46

[5]HanJJ,HaoJ,KimCHetc.Quereetin prevents Cardiae HyPertrophy Induced bypressure OverloadinRats[J].VetMed,2009Jun71(6):737~4

[6]刘慧,槲皮素衍生物的合成及抗肿瘤活性的研究[J]沈阳药科大学硕士学位论文,2000.6

[7]王箭,张鹏辉,涂植光.棚皮素对肺腺癌A549细胞生长的影响[J].第三军医大学学200729(19):1852-1854

[8]EllaneG.;JeanW.Helv.Chim.Acta.1988.814754-763.CheonB.:YoungH.Planta.2000.667),596-100.

[9]HayashiK.I.;NakanishiY.J2003.66125-127.

[10]Nikaido,T.:Olunoto,T.; Noshita,T.;Sanka、va,U.;Monaehe,F.D.;Botta,B.;Tomimori,T.:Miyaichi,Y.:Shirataki,Y.:Yokoe,1.;Komatsu,M.Chem.Phar.ull.1989.37,1392-1395.